experimentele PROCEDURES
primaire cellen, cellijnen en groeicondities—mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC) werden geïsoleerd uit buffy coats (Western Province Blood Transfusion Service, Kaapstad, Zuid-Afrika) met behulp van Ficoll-Paque™ Plus (Amersham Biosciences), zoals eerder beschreven (14). Monocyt-afgeleide macrofagen en dendritische cellen werden gegenereerd uit PBMC ‘ s zoals beschreven (14). NIH3T3 en HEK293T fibroblasten, RAW264.7 macrofagen, HEK293T op basis van Phoenix ecotropic retrovirale verpakking cellijnen (een geschenk van Dr. Gary Nolan, Stanford University), Unnethes-tekort (C35) en Unnethes-gereconstitueerd (WT8) B-cellijnen (15) werden gehandhaafd in Dulbecco ’s modified Eagle’ s medium of RPMI1640 medium (Cambrex), aangevuld met 10% van de warmte geïnactiveerd foetaal kalf serum (Invitrogen), 20 mm HEPES, 2 mm l-glutamine, 100 eenheden/ml penicilline, en 0,1 mg/ml streptomycine (Cambrex). Alle cellen werden gekweekt bij 37 °C in 5% CO2.
generatie van constructies en Transduced cellijnen—het complete CLEC9A open reading frame (ORF) werd geà soleerd uit humaan PBMC cDNA door PCR en gekloond in de pFBneo (Stratagene) retrovirale vector met een ha tag (16) met behulp van de volgende primers: AAAGAATTCCCACCATGCACGAGGAAGAAATATAC en AAACTCGAGGACAGAGGATCTCAACGC. C-terminaal HA-tagged murine CLEC9A (mCLEC9A) werd op dezelfde manier gekloond van muis milt cDNA met behulp van de volgende primers; AAAGTCGACCACCATGCATGCGGAAGAAATA en GTACTCGACGATGCAGGATCCAAATGC.
de CLEC9A/Dectin-1 chimera in pFBneo werd gegenereerd met behulp van overlap extensie PCR met primers CTGCTAAACTTTACAGAAAAACCAGCCCACA en TCTGGCTTGTGGTTTTCTGTAAAGTTTAGCAG zodanig dat de sequentie vertaald als CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84/Dectin-91NHKPTDectin-95. De Fc-CLEC9A expressie construct werd gegenereerd door PCR met behulp van de volgende primers; TTTGGTACCAGCAGCAAGAAAAACTC en GCGGAATTCGACAGAGGATCTCAACGC, en gekloond in de pSecTag2 vector (Invitrogen) stroomopwaarts van de menselijke IgG1 Fc regio, gegenereerd zoals beschreven (17). De trouw van alle constructies werd geverifieerd door sequencing. Menselijke en muriene CLEC9A en isovormen zijn bij GenBank™ gedeponeerd onder de volgende toetredingsnummers: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mCLEC9Aß, EU339278; mCLEC9Ay, EU339279; mCLEC9Aδ, EU339280; mCLEC9Ae, EU339281.
om stabiele cellijnen te genereren, werden constructies verpakt in virons, met behulp van Hek293t-gebaseerde Phoenix ecotrope cellen, en werden de verschillende cellijnen getransduceerd zoals eerder beschreven (16). Alle cellijnen werden gebruikt als niet-klonale populaties om stichtereffecten te verminderen en werden minstens tweemaal gegenereerd en getest om fenotype te bevestigen. Waar nodig werden cellijnen geselecteerd en gehandhaafd in 0,6 mg/ml Geneticine (G418) (Merck) of 4 µg/ml puromycine (Invitrogen).
Humane CLEC9A-expressie werd geanalyseerd door PCR van cDNA-panelen van menselijk weefsel (Clontech) met behulp van de volgende primers die coderen voor de gehele ORF, ATGCACGAGGAAGAAATATACACC en GACAGAGGATCTCAACGCATA. mCLEC9A expressie werd geanalyseerd door PCR van muis Weefsel cDNA panelen (Clontech) met behulp van dezelfde muriene primers hierboven beschreven. De uitdrukking van G3PDH werd gebruikt als positieve controle.
generatie van een monoklonaal antilichaam tegen CLEC9A—het monoklonaal antilichaam (mAb), 9A11, specifiek voor CLEC9A, werd gegenereerd door immunisatie van 129 sv muizen met een oplosbaar FC-CLEC9A fusie-eiwit. Er werden ns1-hybridomen gegenereerd en supernatanten uit clonaal verdunde cellen werden gescreend met ELISA. MAb 9A11 (IgG1) werd later geselecteerd gebaseerd op zijn capaciteit om in ELISA, cytometry stroom, en het westelijke bevlekken, onder niet-gereduceerde voorwaarden te functioneren.
Western Blotting en Deglycosylation—voor Te bereiden mobiele extracten werden de cellen gewassen met PBS en dan gelyseerd in Nonidet P-40 buffer (1% Nonidet P-40, 0,15 m NaCl, 10 mm EDTA, 10 mm NaN3, 10 mm Tris-HCl, pH 8), aangevuld met protease-remmers (Roche Applied Science), voor 30 min bij 4 °C. de Cellulaire puin/kernen werden verwijderd door middel van centrifugeren, en supernatants werden verzameld en opgeslagen bij -20 °C. Eiwit concentraties van extracten werden bepaald door BCA assay (Pierce), en een gelijke hoeveelheid eiwit op een SDS-PAGE gel, volgens standaard protocollen. Na transfer naar HybondC+ nitrocellulose membranen (Amersham Biosciences), werd CLEC9A gedetecteerd door immunostaining met 9A11 of anti-HA (kloon 16B12, Covance) gevolgd door geit anti-muis mierikswortel peroxidase (Jackson). Blots werden ontwikkeld met de ECL-plus kit (Amersham Biosciences). Cellysaten werden gedeglycosyleerd met pngase F en / of O-glycosidase (Roche Applied Science), zoals beschreven door de fabrikant.
antilichamen, Flow Cytometrie en Celsorteercellen werden onderzocht met multicolor flow cytometrie op een FASCCaliber (Bd Biowetenschappen), uitgevoerd volgens conventionele protocollen bij 4 °C in aanwezigheid van 2 mm NaN3. Cellen werden geblokkeerd in PBS met 5 mm EDTA, 0,5% BSA en 5% warmte-geïnactiveerd konijnenserum (muriene cellen) of muriene serum (perifeer bloed), en 50 µg/ml humaan IgG (Sigma; in vitro gekweekte menselijke cellen en PBMC ‘ s) voorafgaand aan de toevoeging van primaire antilichamen. Cellen werden gefixeerd met 1% formaldehyde, 0,25% BSA in PBS voorafgaand aan de analyse.
isoleren 9A11+ cellen voor analyse, 30 miljoen PBMCs, geïsoleerd zoals hierboven beschreven, werden geblokkeerd met 5% muis serum of 50 µg/ml humaan IgG voor 15 min bij 4 °C. de Cellen werden vervolgens gekleurd met biotinylated 9A11 mAb voor 30 min bij 4 °C, gevolgd door streptavidin-APC (BD Pharmingen), en APC+ cellen werden gesorteerd met behulp van FACSVantage S.E. (Beckton Dickinson). De gesorteerde cellen werden gedurende de hele sorteerprocedure bij 4 °C gehouden en vervolgens gekleurd voor verschillende oppervlakte markers, zoals hierboven beschreven. De gesorteerde cellen vertegenwoordigden 0,21% ± 0,07% van de startpopulatie van PBMC ‘ s en waren 72,89 ± 6.21% zuiver. Slechts 9A11 + cellen binnen de gesorteerde populatie werden verder geanalyseerd (zie Fig. 3B).
expressie van hCLEC9A op BDCA3+ DC en een subset van CD14+CD16 – monocyten. A, RT – PCR analyse die uitdrukking van CLEC9A in de meeste weefsels, maar hoofdzakelijk in de hersenen, milt, en thymus tonen. B, met behulp van een nieuw monoklonaal antilichaam (9A11), bleek CLEC9A tot expressie te komen op een kleine populatie PBMC (zie aanvullende Fig. S4C), en cellen die deze receptor uitdrukken werden daarom gesorteerd voorafgaand aan analyse door multicolor cytometry stroom. Met behulp van verschillende markers, zoals aangegeven, werden alle CLEC9A+ cellen (gated) gevonden CD4+HLA-DR+CD11c+, en verdere analyse wees uit dat de receptor voornamelijk werd uitgedrukt op bdca3+ dendritische cellen (59 ± 10%), maar ook op een subset van CD64+CD11b+CD14+CD16 – monocyten (14 ± 6%) en een derde populatie van CD64+CD11b+ CD14 – CD16 – cellen (23 ± 3%), die verder niet werden geïdentificeerd. De getoonde gegevens zijn representatief voor gegevens die zijn verkregen van ten minste zes verschillende donoren.
endocytose Assays – voor de endocytose assays, transduced NIH3T3 of RAW264.De dag voor het experiment werden 7 cellen geplateerd bij respectievelijk 4 × 105 cellen/put en 5 × 105 cellen/put in 6-putplaten. Aan het begin van de test werden de cellen gewassen en vervolgens Geblokkeerd met PBS met 5 mm EDTA, 10 mm NaN3, 0,5% BSA en 5% door warmte geïnactiveerd konijnenserum gedurende 30 minuten bij 4 °C. cellen werden gekleurd met gebiotinyleerd 9A11 of anti-mdectine-1 (2A11; 10 µg/ml) en geïncubeerd gedurende 50 minuten bij 4 °C en vervolgens gewassen met FACS wash (PBS, 05% BSA, 10 mm NaN3 en 5 mm EDTA), om ongebonden antilichamen te verwijderen. Een cross-linking schapen anti-muis antilichaam (Jackson; 5 µg / ml) werd toegevoegd en de cellen werden nog eens 30 minuten bij 4 °C geïncubeerd. na het wassen in kweekmedium om ongebonden secundair antilichaam en azide te verwijderen, werden de cellen geïncubeerd in kweekmedium voor de aangegeven tijden bij 37 of 4 °C. De cellen werden vervolgens gekleurd met streptavidin-PE (BD Pharmingen), en onderzocht op resterende receptoroppervlakexpressie door middel van flow cytometrie, zoals hierboven beschreven.
voor Microscopie werden de cellen de dag voor het experiment bij 2 × 105/putje op glazen dekglaasjes in 6-putje platen geplateerd. De cellen werden op dezelfde wijze behandeld als voor de FACS-gebaseerde assay, waarbij slechts 1 uur bij 4 °C 9A11 werd gekleurd en vervolgens met FACS wash werd gewassen om ongebonden antilichamen te verwijderen. De cellen werden gedurende 30 minuten bij 37 °C of 4 °C in kweekmedium geïncubeerd. Na incubatie werden de cellen gedurende 20 minuten gefixeerd in 1 ml fixeermiddel (4% paraformaldehyde; 250 mm HEPES in dH2O). De aldehydegroepen werden met PBS-glycine (25 mm glycinepoeder in PBS) gedurende 10 min gedoofd en vervolgens met 0,5% Triton X-100 gedurende 20 min gepermeabiliseerd. Cellen werden gewassen met 0,1% PBS-Tween en daarna Geblokkeerd met 0,5% saponine gedurende 20 minuten. Cellen werden gekleurd met LAMP-1 (kloon ID4B; Ontwikkelingsstudies Hybridoma Bank, Universiteit van Iowa, Iowa City) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en gewassen met 0,1% PBS-Tween. Cellen werden vervolgens gekleurd met donkey anti-mouse Cy3 en donkey anti-rat Alexa488 (1: 100 verdunning; beide van Jackson) gedurende 50 min bij kamertemperatuur en vervolgens gewassen met 0,1% PBS-Tween. Coverslips werden gemonteerd met Vectashield (Vectorlaboratoria) en onderzocht met conventionele fluorescentiemicroscopie op een Zeiss Axiovert 40. Afbeeldingen werden verwerkt met Adobe Photoshop versie 6.0.
Zymosan Binding en Cytokine Assays-RAW264. 7 en nih3t3 transfectanten werden de dag voor het experiment in 5 × 104 cellen/putje in 24-putje platen geplateerd. De cellen werden gewassen, oplosbare β-glucanen (glucaanfosfaat; een soort geschenk van David Williams, ETSU; 5 µg/ml) waar nodig toegevoegd, en de cellen geïncubeerd gedurende 20 minuten bij 4 °C om remming van de DECTIN-1 CRD mogelijk te maken (18). Na toevoeging van FITC-gelabelde Zymosan (Invitrogen; 25 deeltjes/cel), werden de cellen gedurende 60 minuten bij 4 °C geïncubeerd om binding mogelijk te maken, en vervolgens uitgebreid gewassen om ongebonden deeltjes te verwijderen. Voor de bepaling van TNF werden RAW264.7-cellen gedurende nog eens 3 uur geïncubeerd en werd de hoeveelheid TNF die vrijkwam in de supernatanten bepaald met ELISA (Biowetenschappen van BD). Voor het meten van de zymosanbinding werden cellen gelyseerd in 3% Triton X-100 (Sigma), en de hoeveelheid gebonden Zymosan werd gekwantificeerd door fluorometrie met behulp van een Titertek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.).
voor de analyse van de Syk-toereikende en Syk-deficiënte B-cellen werden 2 × 106 transduced cellen gestimuleerd met niet-gelabelde Zymosan (Sigma; 1 deeltje per cel) in 24-Wells suspensieplaten gedurende 24 uur bij 37 °C. IL-2 uitgescheiden in de supernatanten werd gekwantificeerd met ELISA (Biowetenschappen van BD). Waar aangegeven werd piceatennol (Sigma) opgenomen bij 50 µm.
fagocytose Assays – om fagocytose door flowcytometrie te kwantificeren, werden transduced NIH3T3 fibroblasten of RAW264.7 macrofagen in 2 × 105cells/putje in 6-putje platen gezaaid de dag voor het experiment. Wanneer nodig, werden de cellen voorbehandeld met 5 µm cytochalasin D (Calbiochem) gedurende 40 min bij 37 °C, om fagocytose te remmen en werd gehandhaafd gedurende de analyse. Vervolgens werden de cellen gewassen en met FITC gelabeld zymosan toegevoegd (1 deeltje/cel) en werd het toegestaan om zich gedurende 1 uur bij 4 °C te binden.na deze incubatie werd ongebonden zymosan verwijderd door wassen, en de cellen werden bij 37°C gedurende 2 uur (NIH3T3-cellen) of 30 minuten (RAW264.7-cellen) geïncubeerd om de opname van deeltjes mogelijk te maken. De hoeveelheid geïnternaliseerde zymosan werd toen bepaald door cytometrie stroom, zoals eerder beschreven (19). Kort, uitwendige zymosan werd gekleurd met polyclonal konijn anti – Zymosan (Invitrogen), die vervolgens werd gedetecteerd met APC-gelabelde geit anti-konijn antilichamen (Invitrogen). Flow cytometrische analyse werd uitgevoerd door gating op de FITC-positieve celpopulaties, die zymosan hadden gebonden, en het percentage van internalisatie werd bepaald door het vergelijken van de APC-negatieve (geïnternaliseerde deeltjes) versus de APC-positieve (niet-geïnternaliseerde deeltjes) celpopulaties.
het onderzoek van fagocytose door immunofluorescentiemicroscopie werd op dezelfde manier uitgevoerd, behalve dat de getransduceerde cellen werden gezaaid bij 3 × 104 cellen / putje op glazen dekglaasjes, 10 deeltjes per cel van FITC-gelabeld zymosan werden toegevoegd, en de cellen konden de deeltjes gedurende 45 minuten internaliseren bij 37 °C. Na deze incubatie werden de cellen gewassen, gefixeerd met 4% paraformaldehyde, en gepermeabiliseerd met 0,25% saponine in FACS-blok gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Actin werd gekleurd met 1 µm tetramethylrhodamine isothiocyanaat (TRITC)-gelabeld phalloidin (Sigma). Coverslips werden gemonteerd met Vectashield (Vectorlaboratoria) en onderzocht met conventionele fluorescentiemicroscopie op een Zeiss Axiovert 40. Afbeeldingen werden verwerkt met Adobe Photoshop versie 6.0.
Immunoprecipitaties-1 × 107 RAW264, 7 cellen werden gestimuleerd met pervanadaat gedurende 1 min bij 37 °C, en de cellen lyseerden in ijskoude lysis buffer (25 mm Tris, pH 8,0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1,1% Nonidet P-40, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) met proteaseremmers (Roche Applied Science). Kernen en celresten werden verwijderd door middel van centrifugering, en de teruggewonnen supernatanten werden toegevoegd aan streptavidin parels (Sigma), vooraf gekoppeld met gebiotinyleerde gefosforyleerde of niet-gefosforyleerde peptiden (25 µm). De CLEC9A peptiden werden commercieel gegenereerd (Sigma) en kwamen overeen met het volgende gebied van de cytoplasmatische staart van de receptor, 1MHEEEIYRSLQWD13. De dectin-1 peptiden zijn eerder beschreven (11). De parels werden 2 uur bij 4 °C gedraaid en vervolgens gewassen, voorafgaand aan analyse door Western blotting. Eiwitten in de immunoprecipitaten werden gedetecteerd met anti-fosfotyrosine (kloon 4G10), en anti-Syk of anti-Lyn (Santa Cruz Biotechnologie), gevolgd door geschikte mierikswortel peroxidase-gebonden secundaire antilichamen (Jackson).