eksperimentelle procedurer
primære celler, cellelinjer og vækstbetingelser—perifere blodmononukleære celler (PBMC) blev isoleret fra buffy coats (vestlige provins Blodtransfusionstjeneste, Kapstaden, Sydafrika) ved hjælp af Ficoll-Paka kar Plus (Amersham Biosciences), som tidligere beskrevet (14). Monocytafledte makrofager og dendritiske celler blev genereret fra Pbmc ‘ er som beskrevet (14). NIH3T3 og HEK293T fibroblaster, RÅ264.7 makrofager, HEK293T-baserede Føniks økotropiske retrovirale emballagecellelinjer (en gave fra Dr. Gary Nolan, Stanford University), Syk-mangelfuld (C35) og Syk-rekonstitueret (VÆGT8) B-cellelinjer (15) blev opretholdt i dulbeccos modificerede Ørnemedium eller RPMI1640-medium (Cambreks) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtal kalveserum (Invitrogen), 20 mm HEPES, 2 mm l-glutamin, 100 enheder/ml penicillin og 0,1 mg/ml streptomycin. Alle celler blev dyrket ved 37 liter C i 5% CO2.
generering af konstruktioner og Transducerede cellelinjer—den komplette CLEC9A open reading frame (ORF) blev isoleret fra human pbmc cDNA ved PCR og klonet ind i pfbneo (Stratagene) retroviral vektor indeholdende et HA-tag (16) ved hjælp af følgende primere; AAAGAATTCCCCACCATGCACGARGAAGAAATATAC og aaactcgaggacagaggatctcaacgc. C-terminalt HA-mærket murine CLEC9A (mCLEC9A) blev ligeledes klonet fra mus milt cDNA under anvendelse af følgende primere; AAAGTCGACCACCATGCATGCGGAAGAAATA og GTACTCGACGATGCAGGATCCAAATGC.
CLEC9A/Dectin-1 chimera i pFBneo blev genereret ved hjælp af overlappende forlængelse PCR med primere CTGCTAAACTTACAGAAAACCACAAGCCCACA og TCTGGGCTTGTTTTCTCTGTAAAGTTTAGCAG således at sekvensen oversat som CLEC9A-79llnfteclec9a-84/Dectin-91nhkptdectin-95. Fc-CLEC9A-ekspressionskonstruktionen blev genereret ved PCR under anvendelse af følgende primere; TTTGGTACCAGCAGCAAGAAAAACTC og GCGGAATTCGACAGAGGATCTCAACGCOG klonet ind i pSecTag2-vektoren (Invitrogen) opstrøms fra den humane IgG1 Fc-region, genereret som beskrevet (17). Troværdigheden af alle konstruktioner blev verificeret ved sekventering. Menneskelige og murine CLEC9A og isoformer er blevet deponeret hos GenBank Kristian under følgende tiltrædelsesnumre: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mclec9a Kristian, EU339278; mCLEC9Ay, EU339279; mclec9a Kristian, EU339280; mCLEC9Ae, EU339281.
for at generere stabile cellelinjer blev konstruktioner pakket i vironer ved hjælp af HEK293T-baserede Føniks økotrope celler, og de forskellige cellelinjer blev transduceret som tidligere beskrevet (16). Alle cellelinjer blev brugt som ikke-klonale populationer for at reducere grundlæggereffekter og blev genereret og testet mindst to gange for at bekræfte fænotype. Hvor det var nødvendigt, blev cellelinjerne udvalgt og vedligeholdt i 0,6 mg/ml Geneticin (G418) (Merck) eller 4 liter/ml puromycin (Invitrogen).
Human CLEC9A-ekspression blev analyseret ved PCR af humant væv cDNA-paneler (Clontech) under anvendelse af følgende primere, der koder for hele ORF, atgcacgaggaagaaatatacacc og GACAGAGGATCTCAACGCATA. mCLEC9A-ekspression blev analyseret ved PCR af cDNA-paneler med musevæv (Clontech) under anvendelse af de samme murine primere beskrevet ovenfor. Ekspression af G3PDH blev brugt som en positiv kontrol.
generering af et monoklonalt antistof mod CLEC9A—det monoklonale antistof (Mab), 9a11, specifikt for CLEC9A, blev genereret ved immunisering af 129sv-mus med et opløseligt Fc-CLEC9A-fusionsprotein. Ns1 hybridomer blev genereret, og supernatanter fra klonalt fortyndede celler blev screenet af ELISA. MAb 9A11 (IgG1) blev efterfølgende valgt ud fra dets evne til at fungere i ELISA, strømningscytometri og vestlig blotting under ikke-reducerede betingelser.
vestlig Blotting og Deglycosylering—for at fremstille cellulære ekstrakter blev celler vasket med PBS og derefter lyseret i Nonidet P-40-buffer (1% Nonidet P-40, 0,15 m NaCl, 10 mm EDTA, 10 mm NaN3, 10 mm Tris-HCl, pH 8) suppleret med proteasehæmmere (Roche Applied Science) i 30 minutter ved 4 liter C. cellulært affald/kerner blev fjernet ved centrifugering, og supernatanter blev fjernet ved hjælp af C. proteinkoncentrationer af Celleekstrakter blev bestemt ved BCA-analyse (Pierce), og lige store mængder protein blev kørt på SDS-side geler i henhold til standardprotokoller. Efter overførsel til HybondC+ nitrocellulosemembraner (Amersham Biosciences) blev CLEC9A påvist ved immunfarvning med 9A11 eller anti-HA (klon 16b12, Covance) efterfulgt af gedemuseperrodsperidase (Jackson). Blots blev udviklet med ECL-plus kit (Amersham Biosciences). Cellelysater blev deglycosyleret med PNGase F og / eller O-glycosidase (Roche Applied Science) som beskrevet af producenten.
antistoffer, Strømningscytometri og Cellesortering—celler blev undersøgt ved flerfarvet strømningscytometri på en FASCCaliber (BD Biosciences), udført i henhold til konventionelle protokoller ved 4 liter C i nærvær af 2 mm NaN3. Celler blev blokeret i PBS indeholdende 5 mm EDTA, 0,5% BSA og 5% varmeinaktiveret kaninserum (murinceller) eller murinserum (perifert blod) og 50 liter/ml humant IgG (Sigma; in vitro dyrkede humane celler og Pbmc ‘ er) inden tilsætning af primære antistoffer. Celler blev fikseret med 1% formaldehyd, 0,25% BSA i PBS før analyse.
for at isolere 9a11+-celler til analyse blev 30 millioner Pbmc ‘ er, isoleret som beskrevet ovenfor, blokeret med 5% museserum eller 50 liter/ml humant IgG i 15 minutter ved 4 liter C. celler blev derefter farvet med biotinyleret 9a11 mAb i 30 minutter ved 4 liter C efterfulgt af streptavidin-APC (BD Pharmingen), og APC+ – celler blev sorteret ved hjælp af FACSVantage S. E. (Beckton Dickinson). De sorterede celler blev holdt ved 4 liter C under hele sorteringsproceduren og derefter farvet for forskellige overflademarkører, som beskrevet ovenfor. De sorterede celler repræsenterede 0,21% liter 0,07% af startpopulationen af Pbmc ‘ er og var 72,89 liter 6.21% ren. Kun 9a11 + celler inden for den sorterede population blev analyseret yderligere (Se Fig. 3B).
ekspression af hCLEC9A på BDCA3 + DC og en delmængde af CD14+CD16 – monocytter. A, RT-PCR-analyse, der viser ekspression af CLEC9A i de fleste væv, men overvejende i hjernen, milten og thymus. B, ved anvendelse af et nyt monoklonalt antistof (9a11), blev CLEC9A fundet at være udtrykt på en mindre population af PBMC (se supplerende Fig. S4C), og celler, der udtrykker denne receptor, blev derfor sorteret før analyse ved flerfarvet strømningscytometri. Ved anvendelse af forskellige markører viste det sig, at alle CLEC9A+-celler (gated) var CD4+HLA – DR+CD11c+, og yderligere analyse viste, at receptoren overvejende blev udtrykt på BDCA3+ dendritiske celler (59 ren 10%), men også på en delmængde af CD64+CD11b+CD14+CD16 – monocytter (14 ren 6%) og en tredje population af CD64+CD11b+ CD14 – CD16-celler (23 ren 3%), som ikke blev identificeret yderligere. De viste data er repræsentative for data fra mindst seks forskellige donorer.
endocytose Assays-for endocytose assays, transduceret NIH3T3 eller RÅ264.7 celler blev forgyldt ved henholdsvis 4 liter 105 celler/brønd og 5 liter 105 celler / brønd i 6-brøndsplader dagen før eksperimentet. Ved starten af analysen blev cellerne vasket og derefter blokeret med PBS indeholdende 5 mm EDTA, 10 mm NaN3, 0,5% BSA og 5% varmeinaktiveret kaninserum i 30 minutter ved 4 kg C. celler blev farvet med biotinyleret 9A11 eller anti-mdectin-1 (2a11; 10 kg/ml) og inkuberet i 50 minutter ved 4 kg C og derefter vasket med FACS vask (PBS, 05% BSA, 10 mm NaN3 og 5 mm EDTA), for at fjerne ubundet antistof. Et tværbindende anti-musantistof for får (Jackson; 5 liter/ml) blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i yderligere 30 minutter ved 4 liter C. Efter vask i dyrkningsmedium for at fjerne ubundet sekundært antistof og acid blev cellerne inkuberet i dyrkningsmedium i de angivne tider ved enten 37 eller 4 liter C. cellerne blev derefter farvet med streptavidin-PE (BD Pharmingen) og undersøgt for resterende receptoroverfladeekspression ved strømningscytometri, som beskrevet ovenfor.
til mikroskopi blev celler belagt med 2 liter 105/brønd på glasdækslips i 6-brøndsplader dagen før eksperimentet. Celler blev behandlet på samme måde som for det FACS-baserede assay, kun farvet med 9A11 i 1 time ved 4 liter C og efterfølgende vasket med FACS vask for at fjerne ubundet antistof. Celler blev inkuberet i 30 minutter ved enten 37 liter C eller 4 liter C i dyrkningsmedium. Efter inkubation blev cellerne fikseret i 1 ml fikseringsmiddel (4% paraformaldehyd; 250 mm HEPES i dH2O) i 20 minutter. Aldehydgrupperne blev standset med PBS-glycin (25 mm glycinpulver i PBS) i 10 minutter og derefter permeabiliseret med 0,5% Triton-100 i 20 minutter. Cellerne blev vasket med 0,1% PBS-mellem og derefter blokeret med 0,5% Saponin i 20 minutter. Celler blev farvet med lampe-1 (klon ID4B; udviklingsstudier Hybridoma Bank, University of Iova, Iova City) i 1 time ved stuetemperatur og vasket med 0,1% PBS-mellem. Celler blev derefter farvet med æsel anti-mus Cy3 og æsel anti-Rotte Aleksa488 (1:100 fortynding; begge fra Jackson) i 50 minutter ved stuetemperatur og efterfølgende vasket med 0,1% PBS-mellem. Dækglas blev monteret med Vectashield (Vektorlaboratorier) og undersøgt ved konventionel fluorescensmikroskopi på en Aksiovert 40. Billeder blev behandlet ved hjælp af Adobe Photoshop version 6.0.
bindings—og Cytokinanalyser-RÅ264.7-og NIH3T3-transfektanter blev belagt ved 5-eller 104-celler/brønd i 24-brøndsplader dagen før eksperimentet. Celler blev vasket, opløselige cholagogue-glucaner (glucanphosphat; en venlig gave fra David Vilhelm, ETSU; 5 cholagogue/ml) blev tilsat, hvor det var relevant, og cellerne blev inkuberet i 20 minutter ved 4 cholagogue C for at muliggøre inhibering af Dectin-1 CRD (18). 25 partikler / celle) blev cellerne inkuberet ved 4 liter C i 60 minutter for at tillade binding og derefter vasket grundigt for at fjerne ubundne partikler. Til bestemmelse af TNF blev RÅ264, 7 celler inkuberet i yderligere 3 timer, og mængden af TNF frigivet i supernatanterne blev bestemt af ELISA (BD Biosciences). Til måling af bindingen blev cellerne lyseret i 3% Triton H-100 (Sigma), og mængden af bundet cymosan blev kvantificeret ved fluorometri ved anvendelse af en Titertek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.).
til analyse af de Syk-tilstrækkelige og Syk-deficiente B-celler blev 2 ren 106 transducerede celler stimuleret med ikke-mærket cymosan (Sigma; 1 partikel pr. celle) i 24-brønds suspensionsplader i 24 timer ved 37 ren C. IL – 2 udskilt i supernatanterne blev kvantificeret af ELISA (BD Biosciences). Hvor det er angivet, piceatennol (Sigma) blev inkluderet ved 50 liter.
Fagocytoseanalyser—for at kvantificere fagocytose ved strømningscytometri blev transducerede NIH3T3 fibroblaster eller RÅ264, 7 makrofager podet ved 2 liter 105celler/brønd i 6-brøndplader dagen før eksperimentet. Når det var nødvendigt, blev cellerne forbehandlet med 5 LHR cytochalasin D (Calbiochem) i 40 minutter ved 37 LHR C for at hæmme fagocytose og blev opretholdt gennem hele analysen. Celler blev derefter vasket, og FITC-mærket blev tilsat (1 partikel / celle) og fik lov til at binde i 1 time ved 4 liter C. Efter denne inkubation blev ubundet vitamin C fjernet ved vask, og cellerne inkuberede ved 37 liter C i 2 timer (NIH3T3 celler) eller 30 minutter (RÅ264, 7 celler) for at tillade partikeloptagelse. Mængden af internaliseret cymosan blev derefter bestemt ved strømningscytometri som tidligere beskrevet (19). Kort sagt blev det ydre kaninstof farvet med polyklonalt kaninantistof (Invitrogen), som efterfølgende blev påvist med APC-mærkede anti-kaninantistoffer (Invitrogen). Denne analyse blev udført ved hjælp af gating på de FITC-positive cellepopulationer, som havde bundet cesosan, og procentdelen af internalisering blev bestemt ved at sammenligne de APC-negative (internaliserede partikler) versus de APC-positive (ikke-internaliserede partikler) cellepopulationer.
undersøgelsen af fagocytose ved immunfluoresensmikroskopi blev udført på lignende måde, bortset fra at de transducerede celler blev podet ved 3 liter 104 celler/brønd på glasdækslip, 10 partikler pr.celle af FITC-mærket cymosan blev tilsat, og cellerne fik lov til at internalisere partiklerne i 45 minutter ved 37 liter C. Efter denne inkubation blev cellerne vasket, fikseret med 4% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,25% Saponin i FACS-blok i 30 minutter ved stuetemperatur. Actin blev farvet med 1 liter tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC)-mærket phalloidin (Sigma). Dækglas blev monteret med Vectashield (Vektorlaboratorier) og undersøgt ved konventionel fluorescensmikroskopi på en Aksiovert 40. Billeder blev behandlet ved hjælp af Adobe Photoshop version 6.0.
Immunopræcipitationer—1 liter 107 RÅ264, 7 celler blev stimuleret med pervanadat i 1 min ved 37 liter C, og cellerne lysede i iskold lysisbuffer (25 mm Tris, pH 8,0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1,1% Nonidet P-40, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) med proteasehæmmere (Roche Applied Science). Kerner og celleaffald blev fjernet ved centrifugering, og de genvundne supernatanter blev tilsat til streptavidinperler (Sigma), forkoblet med biotinylerede phosphorylerede eller ikke-phosphorylerede peptider (25 liter). CLEC9A-peptiderne blev genereret kommercielt (Sigma) og svarede til den følgende region af den cytoplasmatiske hale af receptoren, 1MHEEIYRSLAVD13. Dectin – 1 peptiderne er blevet beskrevet tidligere (11). Perlerne blev roteret i 2 timer ved 4 liter C og derefter vasket, før analyse ved vestlig blotting. Proteiner i immunopræcipitaterne blev påvist med anti-phosphotyrosin (klon 4g10) og anti-Syk eller anti-Lyn (bioteknologi) efterfulgt af passende peberrodsperidasebundne sekundære antistoffer (Jackson).