kokeelliset toimenpiteet
Primaarisolut, solulinjat ja kasvuolosuhteet-perifeerisen veren mononukleaarisolut (Pbmc) eristettiin buffy coatsista (Western Province Blood Transfusion Service, Kapkaupunki, Etelä—Afrikka) Ficoll-Paque™ Plus-ohjelmalla (Amersham biotieteet), kuten edellä on kuvattu (14). Monosyyttijohdannaiset makrofagit ja dendriittisolut on tuotettu pbmc: stä kuvatulla tavalla (14). Nih3t3 ja HEK293T fibroblastit, RAW264.7 makrofagia, Hek293t-pohjaista Phoenixin ekotrooppista retroviraalista pakkaussolulinjaa (lahja Dr. Gary Nolanilta Stanfordin yliopistosta), Syk-puutteellista (C35) ja Syk-rekonstruoitua (WT8) B-solulinjaa (15) säilytettiin dulbeccon modifioidussa Eagle-Mediumissa tai Rpmi1640-Mediumissa (Cambrex) täydennettynä 10% lämpö inaktivoidulla sikiön vasikkaseerumilla (Invitrogen), 20 mm HEPES, 2 mm L-glutamiinilla, 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja 0, 1 mg/ml streptomysiiniä (cambrex). Kaikki solut kasvatettiin 37 °C: n lämpötilassa 5% CO2: ssa.
konstruktioiden ja Transdukoitujen solulinjojen muodostus—täydellinen CLEC9A-avoin lukukehys (ORF) eristettiin ihmisen pbmc cDNA: sta PCR: llä ja kloonattiin pfbneo-retrovirusvektoriksi, joka sisältää HA-tunnisteen (16), käyttäen seuraavia alukkeita: AAAGAATTCCACCACGAGGAAGGAATATAC ja AAACTCGAGGACAGGAGGATCTCAACGC. C-terminaalisesti HA-koodattu hiiren CLEC9A (mCLEC9A) kloonattiin vastaavasti hiiren pernan cDNA: sta käyttäen seuraavia alukkeita; AAAAGTCGACCACCATGCGGAAGAATA ja GTACTCGACGATGCAGGAATGC.
pFBneo: n CLEC9A/Dectin-1-kimaira luotiin käyttämällä päällekkäistä laajennusta PCR alukkeiden CTGCTAACTTACAGAACCACACACA ja TCTGGGGCTGTTGTAAGTAGCAG siten, että sekvenssi käännettiin CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84/Dectin-91NHKPTDectin-95 kanssa. Fc-CLEC9A-lausekkeen konstruktio on tuotettu PCR: llä käyttäen seuraavia alukkeita: TTTGGTACCAGCAGCAAGAAACTC ja GCGGAATTCGACAGGATCTCAACGC, ja kloonattu pSecTag2-vektoriin (Invitrogen) yläjuoksulla ihmisen IgG1 Fc-alueelta, tuotettu kuvatulla tavalla (17). Kaikkien konstruktioiden uskollisuus varmistettiin sekvensoimalla. Ihmisen ja hiiren CLEC9A ja isoforms on talletettu GenBank™: iin seuraavilla liittymisnumeroilla: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mCLEC9Aß, EU339278; mCLEC9Ay, EU339279; mCLEC9Aδ, EU339280; mCLEC9Ae, EU339281.
stabiilien solulinjojen aikaansaamiseksi konstruktiot pakattiin vironeiksi käyttäen HEK293T-pohjaisia Feeniks-ekotrooppisia soluja, ja eri solulinjat transdukoitiin edellä kuvatulla tavalla (16). Kaikkia solulinjoja käytettiin epäklonaalisina populaatioina perustajavaikutusten vähentämiseksi, ja niitä tuotettiin ja testattiin vähintään kahdesti fenotyypin vahvistamiseksi. Tarvittaessa solulinjat valittiin ja säilytettiin 0, 6 mg/ml Geneticiinissä (G418) (Merck) tai 4 µg/ml puromysiinissä (Invitrogeeni).
ihmisen CLEC9A-ekspressio analysoitiin ihmisen kudoksen cDNA-paneelien PCR: llä (Kloonitech) käyttäen seuraavia alukkeita, jotka koodaavat koko ORF: n, ATGCACGAGGAAGAATATACC: n ja GACAGAGGATCTCAACGCATAN. mCLEC9A expression analysoitiin PCR of mouse tissue cDNA panels (Clontech) käyttäen samoja hiiren alukkeita kuin edellä on kuvattu. Positiivisena kontrollina käytettiin g3pdh: n ilmaisua.
monoklonaalisen vasta—aineen muodostuminen CLEC9A-monoklonaalista vasta-ainetta (MAB) vastaan, 9a11, spesifinen CLEC9A: lle, syntyi immunisoimalla 129sv-hiiriä liukoisella Fc-CLEC9A-fuusioproteiinilla. Syntyi NS1 hybridejä ja kloonisesti laimennettujen solujen supernatantteja seulottiin ELISA-menetelmällä. MAB 9A11 (IgG1) valittiin myöhemmin sen perusteella, miten se toimii ELISA -, virtaussytometria-ja Western blotting-olosuhteissa, jotka eivät ole vähentyneet.
Western Blotting ja Deglycosylation—soluuutteiden valmistamiseksi solut pestiin PBS: llä ja sitten lysättiin Nonidet P-40-puskuriin (1% Nonidet P-40, 0, 15 m NaCl, 10 mm EDTA, 10 mm NaN3, 10 mm Tris-HCl, pH 8), jota täydennettiin proteaasinestäjillä (Roche Applied Science) 30 minuutin ajan 4 °C: ssa.solujätteet/ytimet poistettiin sentrifugoimalla ja supernatantit kerättiin ja varastoitiin -20 °C: ssa. Soluuutteiden proteiinipitoisuudet määritettiin BCA-määrityksellä (Pierce), ja yhtä suuri määrä proteiinia suoritettiin SDS-sivun geeleillä standardiprotokollien mukaisesti. HybondC+-nitroselluloosakalvoihin (Amersham Biosciences) siirtymisen jälkeen CLEC9A havaittiin immunostasoivalla 9a11: llä tai anti-HA: lla (klooni 16b12, Covance), jota seurasi vuohien anti-hiiri-piparjuuriperoksidaasi (Jackson). Blotit kehitettiin ECL-plus-pakkauksella (Amersham Biosciences). Solulysaatit deglysyloitiin pngaasi F: llä ja/tai O-glykosidaasilla (Roche Applied Science) valmistajan kuvaamalla tavalla.
vasta—aineet, Virtaussytometria ja Solulajittelu-solut tutkittiin monivärisellä Virtaussytometrialla Fascaliberilla (BD Biosciences), joka tehtiin tavanomaisten protokollien mukaisesti 4 °C: ssa 2 mm NaN3: n läsnä ollessa. Solut blokattiin PBS: ssä, joka sisälsi 5 mm EDTA: ta, 0, 5% BSA: ta ja 5% heat-inaktivoitua kanin seerumia (hiiren solut) tai hiiren seerumia (perifeerinen veri) ja 50 µg/ml ihmisen IgG: tä (Sigma; in vitro viljellyt ihmisen solut ja Pbmc: t) ennen primaaristen vasta-aineiden lisäämistä. Soluissa oli 1% formaldehydiä, 0,25% BSA: ta PBS: ssä ennen analyysiä.
9a11+-solujen eristämiseksi analyysia varten 30 miljoonaa edellä kuvatulla tavalla eristettyä Pbmc: tä estettiin 5-prosenttisella hiiren seerumilla tai 50 µg/ml ihmisen IgG: llä 15 minuutin ajan 4 °C: ssa.tämän jälkeen solut värjättiin biotinyloidulla 9A11 mAb: lla 30 minuutin ajan 4 °C: ssa, minkä jälkeen solut värjättiin streptavidin-APC: llä (BD Pharmingen), ja APC+ – solut lajiteltiin FACSVantage s: n (Beckton Dickinson) avulla. Lajitellut kennot säilytettiin 4 °C: ssa koko lajittelun ajan, minkä jälkeen ne värjättiin erilaisten pintamerkkien varalta edellä kuvatulla tavalla. Lajitellut solut edustivat 0,21% ± 0,07% pbmcs: n aloituspopulaatiosta ja olivat 72,89 ± 6.21% puhdasta. Lajitellun populaation sisällä analysoitiin edelleen vain 9A11+ – soluja(KS. 3b).
Hclec9a: n ilmentyminen bdca3+ DC: ssä ja CD14+CD16 – monosyyttien osajoukko. A, RT-PCR-analyysi, joka osoittaa clec9a: n ilmentymisen useimmissa kudoksissa, mutta pääasiassa aivoissa, pernassa ja kateenkorvassa. B, käyttäen uutta monoklonaalista vasta-ainetta (9A11), CLEC9A: n havaittiin ilmentyvän pienellä PBMC: n populaatiolla (KS. S4C), ja tätä reseptoria ilmentävät solut lajiteltiin siksi ennen analyysiä monivärivirtaussytometrialla. Eri merkkiaineiden avulla todettiin kaikkien (aidattujen) CLEC9A+-solujen olevan CD4+HLA – DR+CD11c+, ja tarkempi analyysi osoitti, että reseptori ilmeni pääasiassa BDCA3+ Dendriittisoluissa (59 ± 10%), mutta myös cd64+CD11b+CD14+CD16 – monosyyteissä (14 ± 6%) ja kolmannessa populaatiossa CD64+CD11b+ CD14 – CD16-soluissa (23 ± 3%), joita ei yksilöity tarkemmin. Esitetyt tiedot edustavat ainakin kuudelta eri luovuttajalta saatuja tietoja.
Endosytoosimääritykset-endosytoosimäärityksiä varten transduced NIH3T3 tai RAW264.7 solua pinnoitettiin 4 × 105 solua/kuoppa ja 5 × 105 solua/kuoppa vastaavasti 6-kuoppalevyillä koetta edeltävänä päivänä. Testin alussa solut pestiin ja blokattiin PBS: llä, joka sisältää 5 mm EDTA: ta, 10 mm NaN3: A, 0, 5% BSA: ta ja 5% lämpö inaktivoitua kaniseerumia 30 minuutin ajan 4 °C: ssa.solut värjättiin biotinyloidulla 9A11: llä tai anti-mdektiini-1: llä (2A11; 10 µg/ml), inkuboitiin 50 minuutin ajan 4 °C: ssa ja pestiin sen jälkeen FACS wash: lla (PBS, 05% BSA, 10 mm NaN3 ja 5 mm EDTA: ta).), sitoutumattoman vasta-aineen poistamiseksi. Ristiinlinkittävä lampaan anti-hiiri-vasta-aine (Jackson; 5 µg/ml) lisättiin, ja soluja inkuboitiin vielä 30 minuuttia 4 °C: ssa.kun solut oli pesty viljelyaineessa sitoutumattoman sekundaarisen vasta-aineen ja atsidin poistamiseksi, niitä inkuboitiin viljelyaineessa joko 37 tai 4 °C: ssa ilmoitetut ajat. tämän jälkeen solut värjättiin streptavidiini-PE: llä (BD Pharmingen) ja tutkittiin jäljellä olevan reseptorin pinnan ilmentymisen varalta virtaussytometrialla edellä kuvatulla tavalla.
mikroskopiaa varten solut pinnoitettiin 2 × 105/kaivo lasikerroksessa 6 kaivon levyillä koetta edeltävänä päivänä. Soluja käsiteltiin samalla tavalla kuin FACS-pohjaista määritystä varten, vain ne värjättiin 9A11: llä 1 tunnin ajan 4 °C: ssa ja pestiin sen jälkeen FACS washilla sitoutumattoman vasta-aineen poistamiseksi. Soluja inkuboitiin 30 minuutin ajan joko 37 °C: ssa tai 4 °C: ssa viljelyaineessa. Inkubaation jälkeen solut kiinnitettiin 1 ml: aan Fiksatiivia (4% paraformaldehydiä; 250 mm HEPES dH2O: ssa) 20 minuutin ajan. Aldehydiryhmät sammutettiin PBS-glysiinillä (25 mm glysiinijauhe PBS: ssä) 10 minuutin ajan ja sitten permeabiloitiin 0,5% Triton X-100: lla 20 minuutin ajan. Solut pestiin 0,1% PBS-Tweenillä ja tukittiin sen jälkeen 0,5% Saponiinilla 20 minuutin ajan. Solut värjättiin LAMP – 1: llä (klooni ID4B; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja pestiin 0,1% PBS-Tweenillä. Solut värjättiin donkey anti-mouse Cy3: lla ja donkey anti-Rotta Alexa488:lla (1: 100 laimennosta, molemmat Jacksonista) 50 minuutin ajan huoneenlämmössä ja pestiin 0,1% PBS-Tweenillä. Coverslips asennettiin vectashield (Vector Laboratories) ja tutkittiin perinteisellä fluoresenssimikroskopialla Zeiss Axiovert 40. Kuvia käsiteltiin Adobe Photoshopin versiolla 6.0.
Zymosan Binding and Cytokine Assays—RAW264.7 ja NIH3T3 transfektantit pinnoitettiin 5 × 104 solua/kuoppa 24-kuoppalevyissä koetta edeltävänä päivänä. Solut pestiin, liukoisia β-glukaaneja (glukaanifosfaatti; eräänlainen lahja David Williamsilta, ETSU; 5 µg/ml) lisättiin tarvittaessa, ja soluja inkuboitiin 20 minuutin ajan 4 °C: ssa, jotta Destin-1 CRD: n estyminen (18) olisi mahdollista. FITC-merkityn tsymosaanin (Invitrogen; 25 partikkelia/solu) lisäämisen jälkeen soluja inkuboitiin 4 °C: ssa 60 minuutin ajan sitoutumisen mahdollistamiseksi ja pestiin sitten laajasti sitoutumattomien partikkelien poistamiseksi. TNF: n määrittämistä varten raw264.7-soluja inkuboitiin vielä 3 tunnin ajan, ja supernatantteihin vapautuneen TNF: n määrän määritti ELISA (BD Biosciences). Tsymosaanin sitoutumisen mittaamista varten solut lysoitiin 3-prosenttiseen Triton X-100: aan (Sigma), ja sitoutuneen tsymosaanin määrä kvantifioitiin fluorometrialla tittertek Fluoroskan II: lla (Labsystems Group Ltd.).
Syk-riittävien ja-puutteellisten B-solujen määrityksessä 2 × 106 transdukoitua solua stimuloitiin merkitsemättömällä tsymosaanilla (Sigma; 1 hiukkanen solua kohti) 24-kuoppasuspensiolevyissä 24 tunnin ajan 37 °C: ssa. Elisa (Bd Biosciences) määritti SUPERNATANTTEIHIN erittyneen IL-2: n. Jos Ilmoitettu, piceatennoli (Sigma) sisällytettiin 50 µm: n pitoisuuteen.
fagosytoosimääritykset—fagosytoosin kvantifioimiseksi virtaussytometrialla, transdukoiduilla nih3t3 fibroblasteilla tai RAW264.7 makrofageilla kylvettiin 2 × 105 solua/kuoppa 6 kuopan levyissä koetta edeltävänä päivänä. Tarvittaessa soluja esikäsiteltiin 5 µm sytokalasiini D: llä (Kalbiokemia) 40 minuutin ajan 37 °C: ssa fagosytoosin estämiseksi ja se säilyi koko määrityksen ajan. Tämän inkubaation jälkeen sitoutumaton tsymosa poistettiin pesemällä ja soluja inkuboitiin 37°C: ssa 2 tunnin ajan (NIH3T3-solut) tai 30 minuutin ajan (RAW264.7-solut) hiukkasten sisäänoton mahdollistamiseksi. Tämän jälkeen sisäistetyn tsymosaanin määrä määritettiin virtaussytometrialla, kuten aiemmin on kuvattu (19). Ulkoinen tsymosaani värjättiin lyhyesti polyklonaalisella kaniiniantisymosaanilla (Invitrogen), joka myöhemmin havaittiin APC-merkityillä vuohi-antikaniinivasta-aineilla (Invitrogen). Virtaussytometrinen analyysi suoritettiin gatoimalla FITC-positiivisille solupopulaatioille, jotka olivat sitoutuneet zymosaniin, ja internalisaation prosenttiosuus määritettiin vertaamalla APC-negatiivisia (internalisoidut hiukkaset) verrattuna APC-positiivisiin (ei-internalisoidut hiukkaset) solupopulaatioihin.
fagosytoosi tutkittiin immunofluoresenssimikroskopialla samalla tavalla, paitsi että transduktiiviset solut kylvettiin 3 × 104 soluun/kuoppaan lasikerroksessa, niihin lisättiin 10 partikkelia FITC-merkittyä tsymosaania solua kohti ja solut saivat sisäistää partikkelit 45 minuutin ajan 37 °C: ssa.tämän inkubaation jälkeen solut pestiin, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja permeabiloitiin 0, 25% Saponiinilla FACS-lohkossa. 30 min huoneenlämmössä. Aktiini värjättiin 1 µm tetrametyylirhodamiini-isotiosyanaatti (TRITC) – merkityllä falloidiinilla (Sigma). Coverslips asennettiin vectashield (Vector Laboratories) ja tutkittiin perinteisellä fluoresenssimikroskopialla Zeiss Axiovert 40. Kuvia käsiteltiin Adobe Photoshopin versiolla 6.0.
Immunoprecipitations—1 × 107 RAW264.7-soluja stimuloitiin pervanadaatilla 1 minuutin ajan 37 °C: ssa, ja soluja lysoitiin jääkylmässä lyysipuskurissa (25 mm Tris, pH 8, 0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1, 1% Nonidet P-40, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) proteaasinestäjillä (Roche Applied Science). Tumat ja solujätteet poistettiin sentrifugoimalla, ja talteen otetut supernatantit lisättiin streptavidiinihelmiin (Sigma), jotka esikuorittiin biotinyloiduilla fosforyloiduilla tai fosforyloimattomilla peptideillä (25 µm). CLEC9A-peptidit syntyivät kaupallisesti (Sigma) ja vastasivat reseptorin sytoplasmahännän seuraavaa aluetta, 1MHEEIYRSLQWD13. Dertin-1-peptidejä on kuvattu aiemmin (11). Helmiä pyöritettiin 2 tuntia 4 °C: n lämpötilassa, minkä jälkeen ne pestiin ennen Western blotting-analyysiä. Immunopresipitaattien proteiineja havaittiin antifosfotyrosiinilla (klooni 4G10) ja anti-Sykillä tai anti-Lynillä (Santa Cruzin biotekniikka), joita seurasivat asianmukaiset piparjuuriperoksidaasiin liittyvät sekundaariset vasta-aineet (Jackson).