proceduri experimentale
celule primare, linii celulare și Condiții de creștere-celulele mononucleare din sângele periferic (PBMC) au fost izolate din buffy coats (Western Province Blood Transfusion Service, Cape Town, Africa de Sud) folosind Ficoll-Paque Biosciences), așa cum s—a descris anterior (14). Macrofagele derivate din monocite și celulele dendritice au fost generate din CMSP conform descrierii (14). Fibroblaste NIH3T3 și hek293t, RAW264.7 macrofage, linii celulare de ambalare retrovirale Phoenix Ecotropice pe bază de Hek293t (un cadou de la Dr.Gary Nolan, Universitatea Stanford), SYK-deficit (C35) și SYK-reconstituit (WT8) linii de celule B (15) au fost menținute în mediul Eagle modificat Dulbecco sau în mediul RPMI1640 (Cambrex) suplimentat cu 10% ser de vițel fetal inactivat termic (Invitrogen), 20 mm HEPES, 2 mm L-glutamină, 100 penicilină și 0,1 mg/ml streptomicină (cambrex). Toate celulele au fost cultivate la 37 C în 5% CO2.
generarea de construcții și linii celulare Transduse—cadrul complet de citire deschis CLEC9A (ORF) a fost izolat de ADNc pbmc uman prin PCR și clonat în vectorul retroviral pFBneo (Stratagene) care conține o etichetă HA (16) folosind următorii primeri; AAAGAATTCCCACCATGCACGAGGAAGAAATATAC și aaactcgaggacaggatctcaacgc. C-terminal ha-tagged murine CLEC9A (mCLEC9A) a fost clonat în mod similar din ADNc splenic de șoarece folosind următorii primeri; AAAGTCGACCACCATGCATGCGGAAGAAATA și GTACTCGACGATGCAGGATCCAAATGC.
chimera CLEC9A/Dectin-1 din pFBneo a fost generată folosind extensia de suprapunere PCR cu primeri CTGCTAAACTTTACAGAAAACCACAAGCCCACA și TCTGGGCTTGTGTTTTTTTTTTTGTTAAAGTTTAGCAG astfel încât secvența tradusă ca CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84/Dectin-91NHKPTDectin-95. Constructul de Expresie Fc-CLEC9A a fost generat prin PCR folosind următorii primeri; TTTGGTACCAGCAGCAAGAAAAACTC și GCGGAATTCGACAGGATCTCAACGC și clonat în vectorul pSecTag2 (Invitrogen) în amonte de regiunea umană IgG1 Fc, generată așa cum este descris (17). Fidelitatea tuturor constructelor a fost verificată prin secvențiere. Clec9a și izoformele umane și murine au fost depuse la GenBank sec 9a sub următoarele numere de aderare: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mclec9a, eu339278; mCLEC9Ay, EU339279; mclec9a, eu339280; mCLEC9Ae, eu339281.
pentru a genera linii celulare stabile, construcțiile au fost ambalate în vironi, folosind celule Ecotrope Phoenix bazate pe HEK293T, iar diferitele linii celulare au fost transduse așa cum s-a descris anterior (16). Toate liniile celulare au fost utilizate ca populații nonclonale pentru a reduce efectele fondatorului și au fost generate și testate cel puțin de două ori pentru a confirma fenotipul. Acolo unde a fost necesar, liniile celulare au fost selectate și menținute în 0,6 mg/ml Geneticină (G418) (Merck) sau 4 ectoxg/ml puromicină (Invitrogen).
expresia umană CLEC9A a fost analizată prin PCR a panourilor ADNc de țesut uman (Clontech) folosind următorii primeri care codifică întregul ORF, ATGCACGAGGAAGAAATATACACC și GACAGAGGATCTCAACGCATA. expresia mCLEC9A a fost analizată prin PCR a panourilor ADNc de țesut de șoarece (Clontech) folosind aceiași primeri murini descriși mai sus. Expresia G3PDH a fost folosită ca un control pozitiv.
generarea unui anticorp Monoclonal împotriva CLEC9A—anticorpul monoclonal (MAB), 9a11, specific pentru CLEC9A, a fost generat prin imunizarea șoarecilor 129Sv cu o proteină de fuziune FC-CLEC9A solubilă. Au fost generate hibridomuri NS1, iar supernatanții din celulele diluate clonal au fost examinați prin ELISA. MAb 9A11 (IgG1) a fost ulterior selectat pe baza capacității sale de a funcționa în ELISA, citometrie în flux, și Western blotting, în condiții nereduse.
Western Blotting și Deglicozilare—pentru a prepara extracte celulare, celulele au fost spălate cu PBS și apoi lizate în tampon Nonidet P-40 (1% Nonidet P-40, 0,15 m NaCl, 10 mm EDTA, 10 mm NaN3, 10 mm Tris-HCl, pH 8), suplimentat cu inhibitori de protează (Roche Applied Science), timp de 30 min la 4 au fost colectate și depozitate la -20 C. concentrațiile proteice ale extractelor celulare au fost determinate prin testul BCA (Pierce), iar cantități egale de proteine au fost rulate pe geluri SDS-Page, conform protocoalelor standard. După transferul la membranele hybondc+ nitroceluloză (Amersham Biosciences), CLEC9A a fost detectat prin imunosupresie cu 9a11 sau anti-HA (clona 16b12, Covance) urmată de peroxidază de hrean anti-șoarece de capră (Jackson). Bloturile au fost dezvoltate cu kitul ECL-plus (Amersham Biosciences). Lizatele celulare au fost deglicozilate cu Pngaza F și / sau o-glicozidaza (Roche Applied Science), așa cum este descris de producător.
anticorpii, citometria în flux și sortarea celulelor—celulele au fost examinate prin citometrie în flux multicolor pe un FASCCaliber (bd Biosciences), efectuat conform protocoalelor convenționale la 4 centimetrie C în prezența a 2 mm NaN3. Celulele au fost blocate în PBS conținând 5 mm EDTA, 0,5% BSA și 5% ser inactivat termic de iepure (celule murine) sau ser murin (sânge periferic) și 50 de IgG umane (Sigma; celule umane cultivate in vitro și Pbmc) înainte de adăugarea anticorpilor primari. Celulele au fost fixate cu 1% formaldehidă, 0,25% BSA în PBS înainte de analiză.
pentru a izola 9a11+ celule pentru analiză, 30 de milioane de celule Pbmc, izolate așa cum s-a descris mai sus, au fost blocate cu 5% ser de șoarece sau 50 de IgG/ml uman timp de 15 minute la 4 C. celulele au fost apoi colorate cu 9a11 MAB biotinilat timp de 30 de minute la 4 C. C., urmate de streptavidin-APC (bd Pharmingen), iar celulele APC+ au fost sortate folosind FACSVantage S. E. (Beckton Dickinson). Celulele sortate au fost păstrate la 4 centimetrii C pe tot parcursul procedurii de sortare și apoi colorate pentru diferiți markeri de suprafață, așa cum s-a descris mai sus. Celulele sortate au reprezentat 0,21% 0,07% din populația de pornire a Pbmc-urilor și au reprezentat 72,89% 6.21% pur. Doar 9a11 + celule din populația sortată au fost analizate în continuare (vezi Fig. 3B).
expresia hCLEC9A pe BDCA3 + DC și un subset de cd14 + CD16 – monocite. A, analiza RT-PCR care arată expresia CLEC9A în majoritatea țesuturilor, dar predominant în creier, splină și timus. B, folosind un anticorp monoclonal nou (9A11), s-a constatat că CLEC9A este exprimat pe o populație minoră de PBMC (vezi fig. S4C), iar celulele care exprimă acest receptor au fost, prin urmare, sortate înainte de analiză prin citometrie în flux multicolor. Folosind diferiți markeri, după cum s-a indicat, toate celulele CLEC9A+ (închise) s – au dovedit a fi CD4+HLA – DR+CD11c+, iar analizele ulterioare au indicat că receptorul a fost exprimat predominant pe BDCA3+ celule dendritice (59% 10%), dar și pe un subset de CD64+CD11b+CD14+CD16 – monocite (14% 6%) și o a treia populație de CD64+CD11b+ CD14-CD16-celule (23% 3%), care nu au fost identificate în continuare. Datele prezentate sunt reprezentative pentru datele obținute de la cel puțin șase donatori diferiți.
teste de endocitoză—pentru testele de endocitoză, transduse NIH3T3 sau RAW264.7 celule au fost placate la 4 105 celule / sondă, respectiv 5 105 celule/sondă, în plăci cu 6 godeuri cu o zi înainte de experiment. La începutul testului, celulele au fost spălate și apoi blocate cu PBS conținând 5 mm EDTA, 10 mm NaN3, 0,5% BSA și 5% ser de iepure inactivat termic timp de 30 min la 4 C. C. celulele au fost colorate cu 9a11 biotinilat sau anti-mDectin-1 (2A11; 10 ectg/ml) și incubate timp de 50 min la 4 C și ulterior spălate cu FACS wash (PBS, 05% BSA, 10 mm NaN3 și 5 mm EDTA), pentru a elimina anticorpul nelegat. Un anticorp anti-șoarece de oaie reticulat (Jackson; S-au adăugat 5 hectolitri/ml), iar celulele au fost incubate timp de încă 30 min la 4 centimetrii C. După spălarea în mediu de cultură pentru îndepărtarea anticorpilor secundari nelegați și a azidei, celulele au fost incubate în mediu de cultură pentru timpii indicați fie la 37, fie la 4 centimetrii C. celulele au fost apoi colorate cu streptavidin-PE (bd Pharmingen) și examinate pentru expresia suprafeței receptorului rămas prin citometrie în flux, așa cum s-a descris mai sus.
pentru microscopie, celulele au fost placate la 2 centi 105/sondă pe capace de sticlă în plăci cu 6 godeuri cu o zi înainte de experiment. Celulele au fost tratate la fel ca pentru testul pe bază de FACS, colorate doar cu 9A11 timp de 1 oră la 4 centimetric C și ulterior spălate cu FACS wash pentru a îndepărta anticorpii nelegați. Celulele au fost incubate timp de 30 min, fie la 37 C, fie la 4 C, în mediu de cultură. După incubare, celulele au fost fixate în 1 ml de fixativ (4% paraformaldehidă; 250 mm HEPES în dH2O) timp de 20 min. Grupările aldehidice au fost stinse cu PBS-glicină (pulbere de glicină de 25 mm în PBS) timp de 10 min și apoi permeabilizate cu 0,5% Triton X-100 timp de 20 min. Celulele au fost spălate cu 0,1% PBS-Tween și blocate ulterior cu 0,5% saponină timp de 20 min. Celulele au fost colorate cu LAMP-1 (clona ID4B; studii de dezvoltare Hybridoma Bank, Universitatea din Iowa, Iowa City) timp de 1 oră la temperatura camerei și spălate cu 0,1% PBS-Tween. Celulele au fost apoi colorate cu donkey Anti-mouse Cy3 și donkey Anti-rat Alexa488 (diluție 1:100; ambele de la Jackson) timp de 50 min la temperatura camerei și ulterior spălate cu 0,1% PBS-Tween. Capacele au fost montate cu Vectashield (Vector Laboratories) și examinate prin microscopie fluorescentă convențională pe un Zeiss Axiovert 40. Imaginile au fost procesate folosind Adobe Photoshop versiunea 6.0.
teste de legare a Zymosanului și citokine—transfectanții RAW264.7 și nih3t3 au fost placați la 5 celule 104/godeu în plăci cu 24 de godeuri cu o zi înainte de experiment. S-au spălat celulele, s-au adăugat acolo unde a fost cazul și s-au incubat celulele timp de 20 min la 4 C pentru a permite inhibarea Dectin-1 CRD (18). În urma adăugării de zymosan marcat cu FITC (Invitrogen; 25 particule/celulă), celulele au fost incubate la 4 centimetric C timp de 60 min pentru a permite legarea și apoi spălate extensiv pentru a îndepărta particulele nelegate. Pentru determinarea TNF, celulele RAW264.7 au fost incubate pentru încă 3 ore, iar cantitatea de TNF eliberată în supernatanți a fost determinată de ELISA (bd Biosciences). Pentru măsurarea legării zymosan, celulele au fost lizate în 3% Triton X-100 (Sigma), iar cantitatea de zymosan Legat a fost cuantificată prin fluorometrie utilizând un Titrtek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.).
pentru analiza celulelor B cu deficit de Syk și SYK, au fost stimulate 2 celule transduse de 106 de celule cu zymosan neetichetat (Sigma; 1 particulă pe celulă) în plăci de suspensie cu 24 de godeuri timp de 24 de ore la 37 de centuri C. IL-2 secretat în supernatanți a fost cuantificat prin ELISA (bd Biosciences). În cazul în care este indicat, piceatennol (Sigma) a fost inclus la 50 de metri cubi.
teste de fagocitoză—pentru a cuantifica fagocitoza prin citometrie în flux, fibroblastele transduse nih3t3 sau macrofagele RAW264.7 au fost însămânțate la 2 105 celule/godeu în plăci cu 6 godeuri cu o zi înainte de experiment. Atunci când a fost necesar, celulele au fost pretratate cu citochalasină D (Calbiochem) de 5 micrograme timp de 40 min la 37 micrograme C, pentru a inhiba fagocitoza și s-a menținut pe tot parcursul testului. Celulele au fost apoi spălate și s-a adăugat zymosan marcat cu FITC (1 particulă/celulă) și s-a lăsat să se lege timp de 1 h la 4 centimetric C. După această incubare, zymosan nelegat a fost îndepărtat prin spălare, iar celulele au fost incubate la 37 centimetric C timp de 2 h (celule NIH3T3) sau 30 min (celule RAW264.7) pentru a permite absorbția particulelor. Cantitatea de zymosan internalizat a fost apoi determinată prin citometrie în flux, așa cum s-a descris anterior (19). Pe scurt, zymosanul extern a fost colorat cu anti-zymosan de iepure policlonal (Invitrogen), care a fost detectat ulterior cu anticorpi anti-iepure de capră marcați cu APC (Invitrogen). Analiza citometrică în flux a fost efectuată prin gating pe populațiile de celule FITC-pozitive, care au legat zymosan, iar procentul de internalizare a fost determinat prin compararea populațiilor de celule APC-negative (particule internalizate) față de populațiile de celule APC-pozitive (particule neinternalizate).
examinarea fagocitozei prin microscopie de imunofluorezență s-a efectuat în mod similar, cu excepția faptului că celulele transduse au fost însămânțate la 3% 104 celule/puț pe capace de sticlă, s-au adăugat 10 particule pe celulă de zymosan marcat cu FITC, iar celulele au permis interiorizarea particulelor timp de 45 min la 37% C. În urma acestei incubări, celulele au fost spălate, fixate cu 4% paraformaldehidă și permeabilizate cu 0,25% saponină în blocul FACS 30 min la temperatura camerei. Actina a fost colorată cu faloidină (Sigma) marcată cu tetrametilrodamină izotiocianat (TRITC) de 1 centimm. Capacele au fost montate cu Vectashield (Vector Laboratories) și examinate prin microscopie fluorescentă convențională pe un Zeiss Axiovert 40. Imaginile au fost procesate folosind Adobe Photoshop versiunea 6.0.
Immunoprecipitations—1 inkt 107 RAW264.7 celule au fost stimulate cu pervanadat timp de 1 min la 37 int C, iar celulele lizate în tampon de liză rece ca gheața (25 mm Tris, pH 8,0, 140 mm NaCI, 4 mm EDTA, 1,1% Nonidet P-40, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) cu inhibitori de protează (Roche Applied Science). Nucleele și resturile celulare au fost îndepărtate prin centrifugare, iar supernatanții recuperați au fost adăugați la bilele de streptavidină (Sigma), precuplate cu peptide biotinilate fosforilate sau nefosforilate (25 centimm). Peptidele CLEC9A au fost generate comercial (Sigma) și corespundeau următoarei regiuni a cozii citoplasmatice a receptorului, 1MHEEEIYRSLQWD13. Peptidele Dectin – 1 au fost descrise anterior (11). Perlele au fost rotite timp de 2 ore la 4 centimetrii și apoi spălate, înainte de analiză prin Western blotting. Proteinele din imunoprecipitate au fost detectate cu anti-fosfotirozină (clona 4G10) și anti-Syk sau anti-Lyn (biotehnologia Santa Cruz), urmate de anticorpi secundari legați de peroxidază de hrean (Jackson).