PROCÉDURES EXPÉRIMENTALES
Cellules primaires, Lignées cellulaires et Conditions de croissance – Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été isolées à partir de buffy coats (Western Province Blood Transfusion Service, Cape Town, Afrique du Sud) en utilisant Ficoll—Paque™ Plus (Amersham Biosciences), comme décrit précédemment (14). Des macrophages dérivés de monocytes et des cellules dendritiques ont été générés à partir de PBMC comme décrit (14). Fibroblastes NIH3T3 et HEK293T, RAW264.7 macrophages, des lignées de cellules de conditionnement rétrovirales écotropes Phoenix à base de HEK293T (un cadeau du Dr Gary Nolan, Université de Stanford), des lignées de cellules B déficientes en Syk (C35) et reconstituées en Syk (WT8) (15) ont été maintenues dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco ou milieu RPMI1640 (Cambrex) additionné de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur à 10% (Invitrogen), d’HEPES de 20 mm, de l-glutamine de 2 mm, 100 unités / ml de pénicilline et 0,1 mg / ml de streptomycine (Cambrex). Toutes les cellules ont été cultivées à 37 °C dans 5% de CO2.
Génération de Constructions et de Lignées cellulaires transduites — Le cadre de lecture ouvert (ORF) CLEC9A complet a été isolé de l’ADNc de PBMC humain par PCR et cloné dans le vecteur rétroviral pFBneo (Stratagene) contenant une étiquette HA (16) en utilisant les amorces suivantes : AAAGAATTCCACCATGCACGAGGAAGAAATATAC et AAACTCGAGGACAGGATCTCTCAACGC. CLEC9A murin marqué en phase terminale HA (mCLEC9A) a été cloné de manière similaire à partir d’ADNc splénique de souris en utilisant les amorces suivantes : AAAGTCGACCACCATGCATGCGGAAGAAATA et GTACTCGACGATGCAGGATCCAAATGC.
La chimère CLEC9A/Dectin-1 dans pFBneo a été générée à l’aide d’une PCR à extension de chevauchement avec les amorces CTGCTAAACTTTACAGAAAACCACAAGCCACA et TCTGGGCTTGTGGTTTTCTGTAAAGTTTAGCAG de sorte que la séquence se traduise par CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84 /Dectin-91NHKPTDectin-95. La construction d’expression Fc-CLEC9A a été générée par PCR en utilisant les amorces suivantes; TTTGGTACCAGCAGCAAGAAAAACTC et GCGGAATTCGACAGGATCTCAACGC, et clonée dans le vecteur pSecTag2 (Invitrogen) en amont de la région Fc IgG1 humaine, générée comme décrit (17). La fidélité de toutes les constructions a été vérifiée par séquençage. Les CLEC9A et isoformes humaines et murines ont été déposées chez GenBank™ sous les numéros d’accession suivants: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mCLEC9Aß, EU339278; mCLEC9Ay, EU339279; mCLEC9Aδ, EU339280; mCLEC9Ae, EU339281.
Pour générer des lignées cellulaires stables, des constructions ont été conditionnées en virons, en utilisant des cellules écotropes Phoenix à base de HEK293T, et les différentes lignées cellulaires ont été transduites comme décrit précédemment (16). Toutes les lignées cellulaires ont été utilisées comme populations non clonales pour réduire les effets fondateurs et ont été générées et testées au moins deux fois pour confirmer le phénotype. Au besoin, des lignées cellulaires ont été sélectionnées et maintenues dans 0,6 mg/ml de généticine (G418) (Merck) ou 4 µg/ml de puromycine (Invitrogen).
L’expression humaine de CLEC9A a été analysée par PCR de panneaux d’ADNc de tissus humains (Clontech) en utilisant les amorces suivantes codant l’ensemble de l’ORF, ATGCACGAGGAAGAAATATACACC et GACAGGATCTCAACGCATA. L’expression de mCLEC9A a été analysée par PCR de panneaux d’ADNc de tissus de souris (Clontech) en utilisant les mêmes amorces murines décrites ci-dessus. L’expression de G3PDH a été utilisée comme témoin positif.
Génération d’un anticorps monoclonal contre CLEC9A — L’anticorps monoclonal (mAb), 9A11, spécifique de CLEC9A, a été généré par immunisation de souris 129Sv avec une protéine de fusion Fc-CLEC9A soluble. Des hybridomes NS1 ont été générés et des surnageants de cellules diluées clonalement ont été criblés par ELISA. Le mAb 9A11 (IgG1) a ensuite été sélectionné en fonction de sa capacité à fonctionner en ELISA, en cytométrie de flux et en Western blot, dans des conditions non réduites.
Western Blot et Déglycosylation — Pour préparer des extraits cellulaires, les cellules ont été lavées avec du PBS puis lysées dans du tampon Nonidet P-40 (1% de Nonidet P-40, NaCl 0,15 m, EDTA 10 mm, NaN3 10 mm, Tris-HCl 10 mm, pH 8), additionné d’inhibiteurs de protéase (Roche Applied Science), pendant 30 min à 4 °C. Les débris/noyaux cellulaires ont été éliminés par centrifugation, et des surnageants ont été collectés et stockés à -20 ° C. Les concentrations protéiques des extraits cellulaires ont été déterminées par test BCA (Pierce), et des quantités égales de protéines ont été exécutées sur des gels SDS-PAGE, selon des protocoles standard. Après transfert sur des membranes de nitrocellulose HybondC+ (Amersham Biosciences), le CLEC9A a été détecté par immunocoloration avec du 9A11 ou de l’anti-HA (clone 16B12, Covance) suivi de la peroxydase de raifort de chèvre anti-souris (Jackson). Les blots ont été développés avec le kit ECL-plus (Amersham Biosciences). Les lysats cellulaires ont été déglycosylés avec de la PNGase F et/ou de l’O-glycosidase (Roche Applied Science), comme décrit par le fabricant.
Anticorps, Cytométrie en flux et Tri cellulaire – Les cellules ont été examinées par cytométrie en flux multicolore sur un FASCCalibre (BD Biosciences), réalisée selon des protocoles classiques à 4 °C en présence de 2 mm NaN3. Les cellules ont été bloquées dans du PBS contenant 5 mm d’EDTA, 0,5% de BSA et 5% de sérum de lapin inactivé par la chaleur (cellules murines) ou de sérum murin (sang périphérique) et 50 µg/ml d’IgG humaines (Sigma; cellules humaines cultivées in vitro et PBMC) avant l’ajout d’anticorps primaires. Les cellules ont été fixées avec 1% de formaldéhyde, 0,25% de BSA dans le PBS avant analyse.
Pour isoler les cellules 9A11+ pour analyse, 30 millions de PBMC, isolées comme décrit ci-dessus, ont été bloquées avec du sérum de souris à 5% ou 50 µg/ml d’IgG humaines pendant 15 min à 4 °C. Les cellules ont ensuite été colorées avec du mAb 9A11 biotinylé pendant 30 min à 4 °C, suivi de la streptavidine-APC (BD Pharmingen), et les cellules APC+ ont été triées à l’aide de FACSVantage S.e. (Beckton Dickinson). Les cellules triées ont été maintenues à 4 ° C tout au long de la procédure de tri, puis colorées pour divers marqueurs de surface, comme décrit ci-dessus. Les cellules triées représentaient 0,21 % ± 0,07 % de la population de départ des PBMC et étaient de 72,89 ± 6.21% pur. Seules les cellules 9A11+ de la population triée ont été analysées plus avant (voir Fig. 3B).
Expression de hCLEC9A sur BDCA3+ DC et un sous-ensemble de monocytes CD14+ CD16. A, Analyse RT-PCR montrant l’expression de CLEC9A dans la plupart des tissus, mais principalement dans le cerveau, la rate et le thymus. B, en utilisant un nouvel anticorps monoclonal (9A11), on a constaté que le CLEC9A était exprimé sur une population mineure de PBMC (voir la fig. S4C), et les cellules exprimant ce récepteur ont donc été triées avant analyse par cytométrie en flux multicolore. En utilisant divers marqueurs, comme indiqué, toutes les cellules CLEC9A + (fermées) se sont avérées CD4 + HLA-DR + CD11c +, et une analyse plus approfondie a indiqué que le récepteur était principalement exprimé sur les cellules dendritiques BDCA3 + (59 ± 10%), mais également sur un sous-ensemble de monocytes CD64 + CD11b + CD14 + CD16 (14 ± 6%) et une troisième population de cellules CD64 + CD11b + CD14-CD16 (23 ± 3 %), qui n’ont pas été identifiées plus avant. Les données présentées sont représentatives des données obtenues auprès d’au moins six donneurs différents.
Tests d’endocytose – Pour les tests d’endocytose, transduits NIH3T3 ou RAW264.7 cellules ont été plaquées à 4 × 105 cellules / puits et 5 × 105 cellules / puits, respectivement, dans des plaques à 6 puits la veille de l’expérience. Au début du test, les cellules ont été lavées puis bloquées avec du PBS contenant 5 mm d’EDTA, 10 mm de NaN3, 0,5% de BSA et 5% de sérum de lapin inactivé à la chaleur pendant 30 min à 4 °C. Les cellules ont été colorées avec du 9A11 biotinylé ou de l’anti-mdectine-1 (2A11; 10 µg/ ml) et incubées pendant 50 min à 4 ° C puis lavées avec du lavage FACS (PBS, 05% de BSA, 10 mm de NaN3 et 5 mm EDTA), pour éliminer les anticorps non liés. Un anticorps anti-souris de mouton réticulé (Jackson; 5 µg/ml) ont été ajoutés et les cellules incubées pendant encore 30 min à 4 °C. Après lavage en milieu de culture pour éliminer l’anticorps secondaire non lié et l’azoture, les cellules ont été incubées en milieu de culture pendant les temps indiqués à 37 ou 4 °C. Les cellules ont ensuite été colorées à la streptavidine-PE (BD Pharmingen), et examinées pour l’expression de surface restante du récepteur par cytométrie en flux, comme décrit ci-dessus.
Pour la microscopie, les cellules ont été plaquées à 2 × 105/puits sur des lamelles de verre dans des plaques à 6 puits la veille de l’expérience. Les cellules ont été traitées de la même manière que pour le test à base de FACS, seulement colorées avec du 9A11 pendant 1 h à 4 ° C et ensuite lavées avec du lavage FACS pour éliminer les anticorps non liés. Les cellules ont été incubées pendant 30 min à 37 °C ou 4 °C en milieu de culture. Après incubation, les cellules ont été fixées dans 1 ml de Fixateur (4% de paraformaldéhyde ; HEPES 250 mm dans dH2O) pendant 20 min. Les groupes aldéhyde ont été trempés avec de la PBS-glycine (poudre de glycine de 25 mm dans du PBS) pendant 10 min puis perméabilisés avec du Triton X-100 à 0,5% pendant 20 min. Les cellules ont été lavées avec 0,1% de Tween PBS et bloquées par la suite avec 0,5% de saponine pendant 20 min. Les cellules ont été colorées avec LAMP-1 (clone ID4B; Banque d’Hybridomes des études de développement, Université de l’Iowa, Iowa City) pendant 1 h à température ambiante et lavées avec 0,1% de PBS-Tween. Les cellules ont ensuite été colorées avec du Cy3 anti-souris d’âne et du Alexa488 anti-rat d’âne (dilution 1: 100; tous deux de Jackson) pendant 50 min à température ambiante et ensuite lavées avec du Tween PBS à 0,1%. Des lamelles de couverture ont été montées avec Vectashield (Vector Laboratories) et examinées par microscopie à fluorescence conventionnelle sur un Zeiss Axiovert 40. Les images ont été traitées à l’aide d’Adobe Photoshop version 6.0.
Tests de liaison au zymosane et aux cytokines – Les transfectants RAW264.7 et NIH3T3 ont été plaqués à 5 × 104 cellules / puits dans des plaques à 24 puits la veille de l’expérience. Les cellules ont été lavées, des β-glucanes solubles (phosphate de glucane; un don aimable de David Williams, ETSU; 5 µg/ml) ajoutés le cas échéant, et les cellules incubées pendant 20 min à 4 °C pour permettre l’inhibition du CRD de la Dectine-1 (18). Après l’ajout de zymosane marqué au FITC (Invitrogène; 25 particules /cellule), les cellules ont été incubées à 4 ° C pendant 60 min pour permettre la liaison, puis lavées abondamment pour éliminer les particules non liées. Pour la détermination du TNF, des cellules RAW264.7 ont été incubées pendant encore 3 h, et la quantité de TNF libérée dans les surnageants a été déterminée par ELISA (BD Biosciences). Pour mesurer la liaison au zymosane, des cellules ont été lysées dans du Triton X-100 à 3% (Sigma) et la quantité de zymosane lié a été quantifiée par fluorométrie à l’aide d’un Fluoroskan II de Titertek (Labsystems Group Ltd.).
Pour l’analyse des cellules B suffisantes et déficientes en Syk, 2 × 106 cellules transduites ont été stimulées avec du zymosan non marqué (Sigma; 1 particule par cellule) dans des plaques de suspension à 24 puits pendant 24 h à 37 °C. L’IL-2 sécrétée dans les surnageants a été quantifiée par ELISA (BD Biosciences). Lorsque cela est indiqué, le picéatennol (Sigma) a été inclus à 50 µm.Tests de phagocytose
– Pour quantifier la phagocytose par cytométrie en flux, des fibroblastes NIH3T3 transduits ou des macrophages RAW264.7 ont été ensemencés à 2 × 105 cellules / puits dans des plaques à 6 puits la veille de l’expérience. Au besoin, les cellules ont été prétraitées avec de la cytochalasine D de 5 µm (Calbiochem) pendant 40 min à 37 °C, pour inhiber la phagocytose et ont été maintenues tout au long du test. Les cellules ont ensuite été lavées et du zymosan marqué au FITC a été ajouté (1 particule/cellule) et laissé se lier pendant 1 h à 4 °C. Suite à cette incubation, le zymosan non lié a été éliminé par lavage, et les cellules incubées à 37 °C pendant 2 h (cellules NIH3T3) ou 30 min (cellules RAW264.7) pour permettre l’absorption des particules. La quantité de zymosane internalisé a ensuite été déterminée par cytométrie en flux, comme décrit précédemment (19). Brièvement, le zymosane externe a été coloré avec de l’anti-zymosane polyclonal de lapin (Invitrogen), qui a ensuite été détecté avec des anticorps anti-lapin de chèvre marqués par APC (Invitrogen). L’analyse cytométrique en flux a été réalisée par gating sur les populations cellulaires FITC-positives, qui avaient lié le zymosan, et le pourcentage d’internalisation a été déterminé en comparant les populations cellulaires APC-négatives (particules internalisées) aux populations cellulaires APC-positives (particules non internalisées).
L’examen de la phagocytose par microscopie d’immunofluorésence a été effectué de manière similaire, sauf que les cellules transduites ont été ensemencées à 3 × 104 cellules/puits sur des lamelles de verre, 10 particules par cellule de zymosane marqué FITC ont été ajoutées, et les cellules ont été autorisées à internaliser les particules pendant 45 min à 37 °C. Suite à cette incubation, les cellules ont été lavées, fixées avec 4% de paraformaldéhyde, et perméabilisées avec 0,25% de saponine en bloc FACS pendant 30 min à température ambiante. L’actine a été colorée avec de la phalloïdine marquée par l’isothiocyanate de tétraméthylrhodamine (TRITC) de 1 µm (Sigma). Des lamelles de couverture ont été montées avec Vectashield (Vector Laboratories) et examinées par microscopie à fluorescence conventionnelle sur un Zeiss Axiovert 40. Les images ont été traitées à l’aide d’Adobe Photoshop version 6.0.
Immunoprécipitations – 1 × 107 cellules RAW264.7 ont été stimulées avec du pervanadate pendant 1 min à 37 ° C, et les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse à froid (Tris 25 mm, pH 8,0, NaCl 140 mm, EDTA 4 mm, Nonidet P-40 1,1%, NaF 10 mm, Na3VO4 1 mm) avec des inhibiteurs de protéase (Roche Applied Science). Les noyaux et les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation, et les surnageants récupérés ont été ajoutés à des billes de streptavidine (Sigma), précouplées avec des peptides biotinylés phosphorylés ou non phosphorylés (25 µm). Les peptides CLEC9A ont été générés commercialement (Sigma) et correspondaient à la région suivante de la queue cytoplasmique du récepteur, 1MHEEEIYRSLQWD13. Les peptides Dectin-1 ont été décrits précédemment (11). Les billes ont été mises en rotation pendant 2 h à 4 °C puis lavées, avant analyse par Western blot. Des protéines dans les immunoprécipités ont été détectées avec de l’anti-phosphotyrosine (clone 4G10) et de l’anti-Syk ou anti-Lyn (biotechnologie de Santa Cruz), suivies d’anticorps secondaires appropriés liés à la peroxydase de raifort (Jackson).