PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Primário de Células, Linhas de Células, e que as Condições de Crescimento—células mononucleares de sangue Periférico (PBMC) foram isolados a partir de buffy, a coats (Província Ocidental de Transfusões de Sangue, Cidade do Cabo, África do Sul), utilizando Ficoll-Paque™ Plus (Amersham Biosciences), como descrito anteriormente (14). Os macrófagos e as células dendríticas derivadas de monócitos foram gerados a partir de CPSP, tal como descrito em (14). NIH3T3 e HEK293T fibroblastos, RAW264.7 macrófagos, HEK293T baseada em Phoenix ecotropic retroviral de embalagem linhas de células (um presente do Dr. Gary Nolan, da Universidade de Stanford), Syk-deficiente (C35) e Syk-reconstituído (WT8) B-linhas de células (15) foram mantidos em Dulbecco modificado de Águia médio ou RPMI1640 médio (Cambrex) suplementado com 10% inactivadas pelo calor de soro fetal de bezerro (Invitrogen), 20 mm de HEPES, 2 mm de l-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina e de 0,1 mg/ml de estreptomicina (Cambrex). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO2.
Geração de Construções e Transformados Linhas de Células—completa CLEC9A de quadros de leitura aberta (ORF) foi isolada de humanos PBMC cDNA por PCR e clonado no pFBneo (Stratagene) vetor retroviral contendo um HA tag (16), utilizando os seguintes primers; AAAGAATTCCCACCATGCACGAGGAAGAAATATAC e AAACTCGAGGACAGAGGATCTCAACGC. C-terminally HA-tagged murine CLEC9A (mCLEC9A) was similarly cloned from mouse splenic cDNA using the following primers; AAAGTCGACCACCATGCGGAAGAAATA and GTACTCGACGATGCAGGATCAAATGC.
O CLEC9A/Dectin-1 quimera em pFBneo foi gerado utilizando sobreposição de extensão de PCR com primers CTGCTAAACTTTACAGAAAACCACAAGCCCACA e TCTGGGCTTGTGGTTTTCTGTAAAGTTTAGCAG tal que a sequência traduzido como CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84/Dectin-91NHKPTDectin-95. A construção de expressão Fc-CLEC9A foi gerada pela PCR usando os seguintes iniciadores: TTTGGTACAGCAGCAAGAAAAACTC e GCGAATTCGACAGAGAGAGAGAGGATCTCAACGC, e clonado para o vetor pSecTag2 (Invitrogen) a montante da região Fc IgG1 humana, gerado como descrito (17). A fidelidade de todas as construções foi verificada pela sequenciação. Humano e murino CLEC9A e isoformas foram depositados no GenBank™, sob os seguintes números de adesão: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mCLEC9Aß, EU339278; mCLEC9Ay, EU339279; mCLEC9Aδ, EU339280; mCLEC9Ae, EU339281.
para gerar linhas celulares estáveis, construções foram embaladas em virões, usando células Ecotrópicas de Fénix baseadas em HEK293T, e as várias linhas celulares foram transduzidas como descrito anteriormente (16). Todas as linhas celulares foram usadas como populações não-clonais para reduzir os efeitos fundadores e foram geradas e testadas pelo menos duas vezes para confirmar fenótipo. Quando necessário, as linhas celulares foram seleccionadas e mantidas em 0, 6 mg/ml de Geneticina (G418) (Merck) ou 4 µg/ml de puromicina (Invitrogen).
a expressão Clec9a humana foi analisada por PCR de painéis cDNA de tecidos humanos (Clontech) usando os seguintes iniciadores que codificam toda a ORF, ATGCACGAGAGAAATATACC e GACAGAGAGAGAGAGAGGATCTCAACGCATA. a expressão mCLEC9A foi analisada por PCR de painéis cDNA de tecido do mouse (Clontech) usando os mesmos primers murine descritos acima. A expressão do G3PDH foi usada como um controle positivo.
Geração de um Anticorpo Monoclonal contra CLEC9A—O anticorpo monoclonal (mAb), 9A11, específico para CLEC9A, foi gerado pela imunização de 129Sv ratos com uma solúveis Fc-CLEC9A proteína de fusão. Foram gerados hibridomas NS1, e sobrenadantes de células diluídas clonalmente foram rastreados por ELISA. O mAb 9A11 (IgG1) foi posteriormente selecionado com base em sua capacidade de funcionar em ELISA, citometria de fluxo e blotting Ocidental, em condições não-reduzidas.
Western Blotting e Deglycosylation—Para a preparação de extratos celulares, as células foram lavadas com PBS e então lisadas em Nonidet P-40 (buffer de 1% de Nonidet P-40, de 0,15 m de NaCl, 10 mm EDTA, 10 mm de NaN3, 10 mm de Tris-HCl, pH 8), suplementado com inibidores de protease (Roche applied Science), por 30 min a 4 °C. os restos Celulares/núcleos foram removidas por centrifugação, e sobrenadante foram coletados e armazenados a -20 °C. as concentrações de Proteínas da célula extratos foram determinados pelo BCA ensaio (Pierce), e quantidades iguais de proteína foram executados em SDS-PAGE géis, de acordo com protocolos padrão. Após a transferência para HybondC+ membranas de nitrocelulose (Amersham Biosciences), CLEC9A foi detectado por immunostaining com 9A11 ou anti-HA (clone 16B12, Covance), seguido pelo de cabra anti-mouse peroxidase de rábano (Jackson). Blots foram desenvolvidos com o ECL-plus kit (Amersham Biosciences). Os lisatos celulares foram deglicosilados com PNGase F e/ou o-glicosidase (Roche Applied Science), como descrito pelo fabricante.Anticorpos ,Citometria de fluxo e células de triagem celular foram examinados por citometria de fluxo multicolor num FASCCaliber (Biociências BD), realizado de acordo com protocolos convencionais a 4 °C na presença de 2 mm NaN3. As células foram bloqueadas em PBS contendo 5 mm EDTA, 0, 5% BSA e 5% de soro de coelho inactivado pelo calor (células murinas) ou soro Murino (sangue periférico), e 50 µg/ml de IgG humana (Sigma; células humanas em cultura in vitro e PBMCs) antes da adição de anticorpos primários. As células foram fixadas com 1% de formaldeído, 0,25% de ASC em PBS antes da análise.
Para isolar 9A11+ células para análise, de 30 milhões de PBMCs, isolado, como descrito acima, foram bloqueadas com 5% de soro de ratinho ou 50 µg/ml de IgG humana por 15 min a 4 °C. as Células foram então coradas com o 9A11 mAb por 30 min a 4 °C, seguido por estreptavidina-APC (BD Pharmingen), e a APC+ células foram classificados usando FACSVantage S.E. (Beckton Dickinson). As células triadas foram mantidas a 4 ° C durante todo o processo de triagem e, em seguida, manchadas para vários marcadores de superfície, como descrito acima. As células ordenadas representaram 0, 21% ± 0, 07% da população inicial de CPSP e foram 72, 89 ± 6.21% pura. Apenas 9A11+ células dentro da população ordenada foram analisadas mais aprofundadamente(ver Fig. 3B).
Expression of hCLEC9A on BDCA3+ DC and a subset of CD14+CD16-monocytes. A, RT-PCR analysis showing expression of CLEC9A in most tissues, but predominantly in the brain, spleen, and thymus. B, utilizando um novo anticorpo monoclonal (9A11), verificou-se que CLEC9A é expresso numa população menor de PBMC (ver figura suplementar). S4C), e as células que expressam este receptor foram, portanto, ordenadas antes da análise por citometria de fluxo multicolor. Utilizando-se de vários marcadores, como indicado, todas as CLEC9A+ células (fechado) foram encontrados para ser CD4+HLA-DR+CD11c+, e ainda a análise indicou que o receptor foi predominantemente expressa no BDCA3+ células dendríticas (59 ± 10%), mas também em um subconjunto de CD64+CD11b+CD14+CD16 – monócitos (14 ± 6%) e um terço da população de CD64+CD11b+ CD14 – CD16 – células (23 ± 3%), que não foram identificadas ainda. Os dados apresentados são representativos dos dados obtidos de pelo menos seis dadores diferentes.
ensaios de endocitose-para os ensaios de endocitose, NIH3T3 transduced ou RAW264.7 células foram revestidas a 4 × 105 células/alvéolo e 5 × 105 células / alvéolo, respectivamente, em placas de 6 alvéolos no dia anterior à experiência. No início do ensaio, as células foram lavadas e, em seguida, bloqueadas com PBS contendo 5 mm de EDTA, 10 mm de NaN3, 0,5% de BSA, e 5% inactivadas pelo calor de soro de coelho, por 30 min a 4 °C. as Células foram coradas com o 9A11 ou anti-mDectin-1 (2A11; 10 µg/ml) e incubadas por 50 min a 4 °C e, posteriormente, lavadas com FACS de lavagem (PBS, 05% BSA, 10 mm de NaN3, e 5 mm de EDTA), para remover independente de anticorpos. Um anticorpo anti-rato de ligação cruzada (Jackson; 5 µg/ml) foi adicionado e as células incubadas por 30 min a 4 °C. Após a lavagem com meio de cultura para remover independente anticorpo secundário e azida, as células foram incubadas em meio de cultura para os tempos indicados no 37 ou 4 °C. as Células foram então coradas com estreptavidina-PE (BD Pharmingen), e analisadas para os restantes receptores de superfície da expressão, citometria de fluxo, como descrito acima.
para microscopia, as células foram revestidas a 2 × 105/alvéolo em tampas de vidro em placas de 6 alvéolos no dia anterior à experiência. As células foram tratadas da mesma forma que para o ensaio FACS, apenas manchadas com 9A11 durante 1 h a 4 °C e subsequentemente lavadas com lavagem FACS para remover o anticorpo não ligado. As células foram incubadas durante 30 minutos a 37 ° C ou 4 °C em meio de cultura. Após incubação, as células foram fixadas em 1 ml de fixador (4% de paraformaldeído; 250 mm de HEPES em dH2O) durante 20 minutos. Os grupos aldeídos foram extintos com PBS-glicina (pó de glicina de 25 mm em PBS) durante 10 minutos e depois permeabilizados com Triton X-100 a 0, 5% durante 20 minutos. As células foram lavadas com 0, 1% de PBS-Tween e bloqueadas posteriormente com 0, 5% de saponina durante 20 minutos. As células foram manchadas com LAMP-1 (clone ID4B; estudos de desenvolvimento Hybridoma Bank, Universidade de Iowa, Cidade de Iowa) por 1 h à temperatura ambiente e lavadas com 0,1% PBS-Tween. As células foram então manchadas com CY3 anti-rato de burro e Alexa488 anti-rato de burro (diluição de 1:100; ambas de Jackson) durante 50 minutos à temperatura ambiente e, subsequentemente, lavadas com 0, 1% de PBS-Tween. As tampas foram montadas com Vectashield (laboratórios vetoriais) e examinadas por microscopia de fluorescência convencional em um Zeiss Axiovert 40. Imagens foram processadas usando Adobe Photoshop versão 6.0.
Zymosan Binding and Cytokine Assays-RAW264. 7 and NIH3T3 transfectants were plated at 5 × 104 cells / well in 24-well plates the day before the experiment. As células foram lavadas, foram adicionados β-glucanos solúveis (fosfato glucano; um presente do tipo de David Williams, ETSU; 5 µg/ml), quando adequado, e as células incubadas durante 20 minutos a 4 °C, a fim de permitir a inibição da DECTIN-1 CRD (18). Após a adição de zimosano marcado com FITC (Invitrogénio; 25 partículas/célula), as células foram incubadas a 4 °C durante 60 minutos para permitir a ligação, e depois lavadas extensivamente para remover as partículas não ligadas. Para a determinação do TNF, incubaram-se células RAW264.7 para mais 3 h, e a quantidade de TNF libertada nos sobrenadantes foi determinada por ELISA (Biociências BD). Para medir a ligação do zimosano, as células foram lisadas em Tritão X-100 (Sigma) a 3%, e a quantidade de zimosano ligado foi quantificada por fluorometria utilizando um Titertek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.).
para a análise das células B suficientes e deficientes em Syk, 2 × 106 células transdutoras foram estimuladas com zimosano não marcado (Sigma; 1 partícula por célula) em placas de suspensão de 24 h a 37 ° C. O IL-2 secretado nos sobrenadantes foi quantificado por ELISA (Biociências BD). Quando indicado, o piceatennol (Sigma) foi incluído a 50 µm.Os ensaios de fagocitose—para quantificar a fagocitose por citometria de fluxo, os fibroblastos nih3t3 transdutores ou o RAW264.7 Os macrófagos foram semeados a 2 × 105células/alvéolo em placas de 6 alvéolos no dia anterior à experiência. Quando necessário, as células foram pré-tratadas com citocalasina D (Calbiochem) de 5 µm durante 40 minutos a 37 °C, para inibir a fagocitose e mantiveram-se durante todo o ensaio. Após esta incubação, o zimosano não ligado foi removido por lavagem e as células incubadas a 37°C para 2 h (células NIH3T3) ou 30 min (células RAW264.7) para permitir a absorção de partículas. A quantidade de zimosano internalizado foi então determinada por citometria de fluxo, como descrito anteriormente (19). Brevemente, o zimosano externo foi manchado com anti-zimosano de coelho policlonal (Invitrogen), que foi subsequentemente detectado com anticorpos anti-coelho de cabra marcados com APC (Invitrogen). A análise citométrica do fluxo foi realizada por gating nas populações celulares FITC-positivas, que tinham ligado o zimosano, e a porcentagem de internalização foi determinada comparando a APC-negativo (partículas internalizadas) versus as populações celulares APC-positivas (partículas não internalizadas).
O exame da fagocitose por immunofluoresence microscopia foi realizada de forma semelhante, exceto que o transduzidas foram semeadas em 3 × 104 células/poço em lamelas de vidro, 10 partículas por célula de FITC-rotulado zymosan foram adicionados, e as células permitido para internalizar as partículas de 45 min a 37 °C. a Seguir este processo de incubação, as células foram lavadas, fixa com 4% de paraformaldeído e permeabilized com 0,25% de Saponin em FACS bloco de 30 min à temperatura ambiente. A actina foi manchada com isotiocianato de tetrametilrhodamina (TRITC) marcado com falloidina (Sigma) de 1 µm. As tampas foram montadas com Vectashield (laboratórios vetoriais) e examinadas por microscopia de fluorescência convencional em um Zeiss Axiovert 40. Imagens foram processadas usando Adobe Photoshop versão 6.0.As células foram estimuladas com pervanadato durante 1 min a 37 °C, e as células lisadas em tampão de lise frio com gelo (Tris de 25 mm, pH 8,0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1, 1% Nonidet P—40, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) com inibidores da protease (Roche Applied Science). Os núcleos e os detritos celulares foram removidos por centrifugação e os sobrenadantes recuperados foram adicionados às esferas de estreptavidina (Sigma), pré-combinados com péptidos fosforilados biotinilados ou não-fosforilados (25 µm). Os peptídeos CLEC9A foram gerados comercialmente (Sigma) e correspondiam à seguinte região da cauda citoplasmática do receptor, 1MHEEEIYRSLQWD13. Os peptídeos de Dectin – 1 foram descritos anteriormente (11). As contas foram rodadas durante 2 h a 4 ° C e depois lavadas, antes da análise por Western blotting. Foram detectadas proteínas nos imunoprecipitados com anti-fosfotirosina (clone 4G10) e anti-Syk ou anti-Lyn (biotecnologia de Santa Cruz), seguidas de anticorpos secundários adequados associados à peroxidase do rábano silvestre (Jackson).