kísérleti eljárások
elsődleges sejtek, sejtvonalak és növekedési feltételek—perifériás vér mononukleáris sejteket (Pbmc) izoláltunk buffy coats-ból (Western Province Blood Transfusion Service, Cape Town, Dél-Afrika) Ficoll-Paque ++ Plus (Amersham biotudományok), amint azt korábban leírtuk (14). Monocita eredetű makrofágokat és dendritikus sejteket állítottak elő Pbmc-kből a leírtak szerint (14). Nih3t3 és hek293t fibroblasztok, RAW264.7 makrofágot, Hek293t alapú Phoenix ecotropic retroviral packaging sejtvonalakat (Dr. Gary Nolan, Stanford Egyetem ajándéka), Syk-hiányos (C35) és Syk-rekonstruált (WT8) B-sejtvonalakat (15) tartottak fenn Dulbecco módosított Eagle táptalajában vagy RPMI1640 táptalajban (Cambrex), kiegészítve 10% hő-inaktivált magzati borjú szérummal (Invitrogen), 20 mm HEPES, 2 mm l-glutamin, 100 egység/ml penicillint és 0,1 mg/ml sztreptomicint (cambrex). Az összes sejtet 37cc-n tenyésztettük 5% CO2-ban.
konstrukciók és Transzdukált sejtvonalak létrehozása—a teljes CLEC9A nyílt leolvasási keretet (ORF) PCR-rel izoláltuk humán PBMC cDNS-ből, és a következő primerek alkalmazásával klónoztuk a HA-tagot (16) tartalmazó pfbneo (Stratagene) retrovírus vektorba: aaagaattcccaccatgcacgaggaagaaatatac és AAACTCGAGGACAGAGGATCTCAACGC. A C-terminálisan HA-tagged egér CLEC9A-t (mCLEC9A) hasonlóan klónozták egér lép cDNS-ből a következő primerek felhasználásával: aaagtcgaccaccatgcatgcggaagaaata és GTACTCGACGATGCAGGATCCAAATGC.
a CLEC9A/Dectin-1 kimérát a pFBneo-ban ctgctaaactttacagaaaaccacaagccaca és TCTGGGCTTTGTGTTTTTTCTGTAAAGTTTAGCAG primerekkel végzett átfedési extenziós PCR-rel állítottuk elő, így a szekvenciát CLEC9A-79llnfteclec9a-84/Dectin-91nhkptdektin-95-re fordították. Az Fc-CLEC9A expressziós konstrukciót PCR-rel állítottuk elő a következő primerek felhasználásával: TTTGGTACCAGCAGCAAGAAAAACTC és GCGGAATTCGACAGAGGATCTCAACGC, majd a humán IgG1 Fc régiótól felfelé a psectag2 vektorba (Invitrogén) klónoztuk, a leírtak szerint (17). Az összes konstrukció hűségét szekvenálással igazoltuk. Az emberi és egér CLEC9A és izoformáit a GenBank xhamsternél helyezték letétbe a következő csatlakozási számok alatt: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mclec9a GmbH, eu339278; mCLEC9Ay, EU339279; mclec9a GmbH, eu339280; mCLEC9Ae, EU339281.
stabil sejtvonalak létrehozásához a konstrukciókat vironokba csomagolták, Hek293t alapú Phoenix ecotrop sejtek felhasználásával, és a különböző sejtvonalakat a korábban leírtak szerint transzdukálták (16). Az összes sejtvonalat nemklonális populációként használták az alapító hatások csökkentésére, és legalább kétszer generálták és tesztelték a fenotípus megerősítésére. Ahol szükséges volt, a sejtvonalakat Kiválasztottuk és 0,6 mg/ml Geneticinben (G418) (Merck) vagy 4 6G/ml puromicinben (Invitrogén) tartottuk fenn.
a humán CLEC9A expressziót humán szöveti cDNS panelek (Clontech) PCR-jével elemeztük a teljes ORF-et, ATGCACGAGGAAGAAATATACACC-t és GACAGAGGATCTCAACGCATA-t kódoló következő primerek felhasználásával. az mCLEC9A expressziót egérszövet cDNS panelek (Clontech) PCR-jével elemeztük a fent leírt egér primerek alkalmazásával. A G3PDH expresszióját pozitív kontrollként használtuk.
a CLEC9A elleni monoklonális antitest (MAB), a 9A11, amely a CLEC9A—ra specifikus, 129sv egerek oldható Fc-CLEC9A fúziós fehérjével történő immunizálásával jött létre. NS1 hibridomák keletkeztek, és a klónosan hígított sejtekből származó felülúszókat ELISA-val szűrtük. Ezt követően a mAb 9A11-et (IgG1) az ELISA-ban, áramlási citometriában és Western blottban való működési képessége alapján választottuk ki, nem redukált körülmények között.
Western blot és Deglikozilezés—a sejtkivonatok elkészítéséhez a sejteket PBS-sel mostuk, majd Nonidet P-40 pufferben (1% Nonidet P-40, 0,15 m NaCl, 10 mm EDTA, 10 mm NaN3, 10 mm Tris-HCl, pH 8) lizáltuk, proteázgátlókkal kiegészítve (Roche Applied Science), 30 percig, 4 .. C. a sejttörmeléket/magokat centrifugálással távolítottuk el, és a felülúszókat a sejtkivonatok fehérje koncentrációját BCA Assay-vel (Pierce) határoztuk meg, és egyenlő mennyiségű fehérjét futtattunk SDS-Page géleken, a standard protokollok szerint. A HybondC+ nitrocellulóz membránokba (Amersham Biosciences) történő átvitel után a CLEC9A-t immunfestéssel detektáltuk 9A11-gyel vagy anti-HA-val (klón 16b12, Covance), majd kecske anti-egér torma peroxidázzal (Jackson). A blot-okat az ECL-plus kit (Amersham Biosciences) segítségével fejlesztették ki. A sejtlizátumokat a gyártó leírása szerint deglikoziláltuk Pngáz F-vel és/vagy O-glikozidázzal (Roche Applied Science).
antitesteket, áramlási Citometriát és Sejtválogatást—a sejteket Többszínű áramlási citometriával vizsgáltuk egy Fasckaliberen (BD Biosciences), amelyet a hagyományos protokollok szerint végeztünk 4CC-n, 2 mm NaN3 jelenlétében. A primer antitestek hozzáadása előtt 5 mm EDTA-t, 0,5% BSA-t és 5% hő-inaktivált nyúlszérumot (egérsejtek) vagy egérszérumot (perifériás vér), valamint 50 ^ g/ml humán IgG-t (Sigma; in vitro tenyésztett humán sejtek és Pbmc-K) tartalmazó PBS-ben blokkolták a sejteket. A sejteket az elemzés előtt 1% formaldehiddel, 0,25% BSA-val rögzítettük PBS-ben.
a 9a11+ sejtek analízishez történő izolálásához 30 millió Pbmc-t izoláltunk a fent leírtak szerint, 5% egérszérummal vagy 50 Ft/ml humán IgG-vel blokkoltunk 15 percig 4 ~ c-n keresztül.a sejteket ezután biotinilezett 9A11 mAb-val festettük 30 percig 4 ~ c-n keresztül, majd sztreptavidin-APC-vel (BD Pharmingen), és az APC+ sejteket facsvantage S. E. (Beckton Dickinson) segítségével válogattuk. A válogatott cellákat a válogatási eljárás során 4CC-n tartottuk, majd különféle felületi markerekre festettük, a fent leírtak szerint. A rendezett sejtek a Pbmc-k kezdő populációjának 0,21% – át, 0,07% – át tették ki, és 72,89 6 volt.21% tisztaságú. A válogatott populáción belül csak 9A11+ sejteket elemeztünk tovább (Lásd az ábrát. 3B).
a hCLEC9A expressziója a BDCA3+ DC – n és a CD14+CD16-monociták egy részhalmazán. A, RT-PCR analízis a CLEC9A expresszióját mutatja a legtöbb szövetben, de elsősorban az agyban, a lépben és a csecsemőmirigyben. B, egy új monoklonális antitest (9A11) alkalmazásával a CLEC9A-t egy kisebb pbmc populációban expresszálták (lásd a kiegészítő ábrát. S4C), és az ezt a receptort expresszáló sejteket ezért az elemzés előtt Többszínű áramlási citometriával válogattuk. Különböző markerek alkalmazásával, amint jeleztük, az összes clec9a+ sejtet (kapuzott) CD4+HLA-DR+CD11c+ – nak találtuk, és a további elemzés azt mutatta, hogy a receptor túlnyomórészt a BDCA3+ dendritikus sejteken expresszálódott (59 ~ 10%), hanem a CD64+CD11b+CD14+CD16 – monociták egy részhalmazán (14 ~ 6%) és a CD64+CD11b+ CD14 – CD16-sejtek harmadik populációján (23%) is 3%), amelyeket tovább nem azonosítottak. A bemutatott adatok reprezentatívak a legalább hat különböző donortól kapott adatokra.
endocitózis vizsgálatok-az endocitózis vizsgálatokhoz transzdukált NIH3T3 vagy RAW264.A kísérlet előtti napon 7 sejtet vontunk be 4 db 105 sejt/kút, illetve 5 db 105 sejt/kút 6 lyukú lemezeken. A vizsgálat kezdetén a sejteket 5 mm EDTA-t, 10 mm NaN3-at, 0,5% BSA-t és 5% hő-inaktivált nyúlszérumot tartalmazó PBS-sel mostuk, majd 30 percen keresztül blokkoltuk 4 db C-N.A sejteket biotinilezett 9A11-gyel vagy anti-mdektin-1-gyel festettük (2a11; 10 db/ml), és 50 percig inkubáltuk 4 db C-n, majd ezt követően FACS-mosással (PBS, 05% BSA, 10 mm NaN3 és 5 mm EDTA), a nem kötött antitest eltávolítására. Egy térhálósító juh anti-egér antitest (Jackson; 5 6G/ml) adunk hozzá, és a sejteket további 30 percig inkubáljuk 4 0c-n. a nem kötött szekunder antitest és azid eltávolítása céljából táptalajban végzett mosás után a sejteket 37 vagy 4C-N jelzett ideig inkubáljuk táptalajban.a sejteket ezután streptavidin-PE-vel (BD Pharmingen) festjük, és áramlási citometriával vizsgáljuk meg a receptor felszíni expressziójának megmaradását, a fent leírtak szerint.
mikroszkópos vizsgálathoz a sejteket a kísérlet előtti napon 2 db 105/lyukú üvegborítókon, 6 lyukú lemezeken borítottuk. A sejteket ugyanúgy kezeltük, mint a FACS-alapú vizsgálat esetében, csak 9a11-gyel festettük 1 órán át 4CC-n, majd ezt követően FACS-mosással mossuk a nem kötött antitest eltávolítása érdekében. A sejteket 30 percig inkubáltuk 37 6CC vagy 4ccc hőmérsékleten a táptalajban. Inkubálás után a sejteket 1 ml Fixálószerben (4% paraformaldehid; 250 mm HEPES dH2O-ban) rögzítettük 20 percig. Az aldehidcsoportokat PBS-glicinnel (25 mm-es glicin por PBS-ben) 10 percig leállítottuk, majd 0,5% – os Triton X-100-mal permeabilizáltuk 20 percig. A sejteket 0,1% PBS-Tween-nel mossuk, majd 0,5% szaponinnal blokkoljuk 20 percig. A sejteket LAMP-1-gyel (ID4B klón; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City) festettük 1 órán át szobahőmérsékleten, majd 0,1% PBS-Tween-nel mossuk. A sejteket ezután donkey Anti-mouse Cy3-mal és donkey Anti-rat Alexa488-Mal festettük (1:100 hígítás; mindkettő Jackson-tól) 50 percig szobahőmérsékleten, majd 0,1% PBS-Tween-nel mossuk. A fedőlapokat Vectashield-el (Vector Laboratories) szereltük fel, és hagyományos fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk egy Zeiss Axiovert 40-en. A képeket az Adobe Photoshop 6.0 verziójával dolgoztuk fel.
Zimozán kötési és citokin vizsgálatok—RAW264.7 és NIH3T3 transzfektánsokat vontunk be 5 db 104 sejt/kút 24 lyukú lemezeken a kísérlet előtti napon. A sejteket megmossuk, oldható (glükán-foszfát; egy kedves ajándék David Williams-től, ETSU; 5 .. g/ml) adott esetben hozzáadtuk, és a sejteket 20 percig inkubáltuk 4 .. C-on, hogy lehetővé tegyük a Dectin-1 CRD gátlását (18). FITC-vel jelölt zimosan (Invitrogén; 25 részecske/sejt) hozzáadását követően a sejteket 4-en inkubáltuk 60 percig KB, hogy lehetővé tegye a kötődést, majd alaposan megmossuk, hogy eltávolítsuk a nem kötött részecskéket. A TNF meghatározásához a raw264.7 sejteket további 3 órán át inkubáltuk, és a felülúszókba felszabaduló TNF mennyiségét ELISA-val (BD Biosciences) határoztuk meg. A zimozán kötődés méréséhez a sejteket 3%-os Triton X-100-ban (Sigma) lizáltuk, majd a megkötött zimozán mennyiségét titertek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.) alkalmazásával fluorometriával határoztuk meg.).
a Syk-elegendő és Syk-hiányos B-sejtek analíziséhez 2 db 106 transzdukált sejtet stimuláltunk jelöletlen zymosan-nal (Sigma; 1 részecske sejtenként) 24-lyukú szuszpenziós lemezeken 24 órán át 37 db C-on. A felülúszókba szekretált IL-2-t az ELISA (BD Biosciences) segítségével számszerűsítettük. Ahol jelezték, a piceatennol (Sigma)50 km-en volt benne.
fagocitózis—vizsgálatok-a fagocitózis áramlási citometriával történő számszerűsítéséhez transzdukált NIH3T3 fibroblasztokat vagy RAW264, 7 makrofágokat vetettünk be 2-nél 6cell/kút a kísérlet előtti napon. Amikor szükséges volt, a sejteket előkezeltük 5 MHz-es cytochalasin D-vel (Calbiochem) 40 percen át 37 6c-on, hogy gátoljuk a fagocitózist, és az egész vizsgálat során fennmaradtunk. A sejteket ezután megmossuk, majd FITC-vel jelölt zimozánt adunk hozzá (1 részecske/sejt), és hagyjuk, hogy 1 órán át kötődjön 4 6CC-n.ezt az inkubációt követően a nem kötött zimozánt mosással eltávolítottuk, és a sejteket 37 DCC-n inkubáltuk 2 órán át (NIH3T3 sejtek) vagy 30 percig (RAW264,7 sejtek), hogy lehetővé tegyük a részecskék felvételét. Az internalizált zimosan mennyiségét ezután áramlási citometriával határoztuk meg, amint azt korábban leírtuk (19). Röviden, a külső zimozánt poliklonális nyúl anti-zimozánnal (Invitrogen) festettük, amelyet ezt követően APC-vel jelölt kecske anti-nyúl antitestekkel (Invitrogen) detektáltunk. Az áramlási citometriás analízist a fitc-pozitív sejtpopulációk kapuzásával végeztük, amelyek megkötötték a zimozánt, és az internalizáció százalékos arányát az APC-negatív (internalizált részecskék) és az APC-pozitív (nem internalizált részecskék) sejtpopulációk összehasonlításával határoztuk meg.
a fagocitózis vizsgálatát immunfluoreszencia mikroszkóppal hasonlóan végeztük, azzal a különbséggel, hogy a transzdukált sejteket 3 db 104 dB sejt/kút üvegborításon vetettük be, 10 db fitc-vel jelölt zimosan sejtenként 10 részecskét adtunk hozzá, és a sejteket 45 percig 37 db C-on internalizáltuk.ezt az inkubációt követően a sejteket mostuk, 4% paraformaldehiddel rögzítettük, és 0,25% szaponinnal permeabilizáltuk FACS-ben blokk 30 percig szobahőmérsékleten. Az aktint 1 ~ m tetrametil-rodamin-izotiocianát (TRITC) – jelölt falloidinnal (Sigma) festettük. A fedőlapokat Vectashield-el (Vector Laboratories) szereltük fel, és hagyományos fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk egy Zeiss Axiovert 40-en. A képeket az Adobe Photoshop 6.0 verziójával dolgoztuk fel.
Immunprecipitációk—1 ons 107 RAW264, 7 sejteket pervanadáttal stimuláltunk 1 percig 37 Ca-n, és a sejteket jéghideg lízis pufferben lizáltuk (25 mm Tris, pH 8,0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1,1% Nonidet P-40, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) proteáz inhibitorokkal (Roche Applied Science). Az atommagokat és a sejttörmeléket centrifugálással távolítottuk el, és a kinyert felülúszókat sztreptavidin gyöngyökhöz (Sigma) adtuk, biotinilezett foszforilált vagy nem foszforilált peptidekkel (25 MHz) előpéldálva. A clec9a peptidek kereskedelmi forgalomban (Sigma) keletkeztek, és megfeleltek a receptor citoplazmatikus farkának következő régiójának, az 1MHEEEIYRSLQWD13-nak. A Dektin-1 peptideket korábban leírtuk (11). A gyöngyöket 2 órán át forgattuk 4 c-n, majd mossuk, a Western blotting elemzésével. Az immunprecipitátumokban lévő fehérjéket anti-foszfotirozinnal (4g10 klón) és anti-Syk vagy anti-Lyn (Santa Cruz Biotechnológia) detektálták, majd megfelelő torma-peroxidázhoz kapcsolt másodlagos antitestekkel (Jackson).