PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
Células Primarias, Líneas Celulares y Condiciones de Crecimiento: Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de buffy coats (Western Province Blood Transfusion Service, Ciudad del Cabo, Sudáfrica) utilizando Ficoll-Paque™ Plus (Amersham Biosciences), como descrito anteriormente (14). Los macrófagos derivados de monocitos y las células dendríticas se generaron a partir de PBMCS como se describe (14). Fibroblastos NIH3T3 y HEK293T, RAW264.Se mantuvieron 7 macrófagos, líneas celulares de envasado retrovirales ecotrópicos Phoenix basados en HEK293T (un regalo del Dr. Gary Nolan, Universidad de Stanford), líneas celulares B deficientes en Syk (C35) y reconstituidas en Syk (WT8) (15) en medio Eagle modificado por Dulbecco o medio RPMI1640 (Cambrex) suplementado con suero fetal de ternera inactivado al 10% por calor (Invitrogen), HEPES de 20 mm, l-glutamina de 2 mm, 100 unidades/ml penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina (Cambrex). Todas las células se cultivaron a 37 ° C en un 5% de CO2.
Generación de Constructos y Líneas Celulares Transducidas: El marco de lectura abierto (ORF) CLEC9A completo se aisló del ADNc de PBMC humano mediante PCR y se clonó en el vector retroviral pFBneo (Estratageno) que contenía una etiqueta de HA (16) utilizando los siguientes cebadores: AAAGAATTCCCACCATGCAGGAAGAAATATAC y AAACTCGAGGACAGAGGATCTCAACGC. CLEC9A murino marcado con HA terminal C (mCLEC9A) fue clonado de manera similar a partir de ADNc esplénico de ratón utilizando los siguientes cebadores: AAAGTCGACCACCATGCATGCGGAAGAAATA y GTACTCGACGATGCAGGATCCAAATGC.
La quimera CLEC9A / Dectin – 1 en pFBneo se generó utilizando extensión de superposición PCR con cebadores CTGCTAAACTTTACAGAAAACCACAAGCCACA y TCTGGGCTTGGTTTTTTCTGTAAAGTTTAGCAG de tal manera que la secuencia se tradujo como CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84/Dectin-91NHKPTDECTINA-95. La construcción de expresión Fc-CLEC9A fue generada por PCR utilizando los siguientes cebadores; TTTGGTACCAGCAGCAAGAAAAACTC y GCGGAATTCGACAGAGGATCTCAACGC, y clonada en el vector pSecTag2 (Invitrogen) aguas arriba de la región Fc IgG1 humana, generada como se describe (17). La fidelidad de todos los constructos se verificó mediante secuenciación. CLEC9A e isoformas humanas y murinas se han depositado en GenBank™ con los siguientes números de adhesión: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mCLEC9Aß, EU339278; mCLEC9Ay, EU339279; mCLEC9Aδ, EU339280; mCLEC9Ae, EU339281.
Para generar líneas celulares estables, los constructos se empaquetaron en virones, utilizando células ecotrópicas Phoenix basadas en HEK293T, y las diversas líneas celulares se transducieron como se describió anteriormente (16). Todas las líneas celulares se utilizaron como poblaciones no clonales para reducir los efectos fundadores y se generaron y probaron al menos dos veces para confirmar el fenotipo. Cuando fue necesario, se seleccionaron líneas celulares y se mantuvieron en 0,6 mg/ml de Geneticina (G418) (Merck) o 4 µg/ml de puromicina (Invitrogen).
La expresión humana de CLEC9A se analizó mediante PCR de paneles de ADNc de tejido humano (Clontech) utilizando los siguientes cebadores que codifican todo el ORF, ATGCACGAGGAAGAAATATACACC y GACAGAGGATCTCAACGCATA. La expresión de mCLEC9A se analizó mediante PCR de paneles de ADNc de tejido de ratón (Clontech) utilizando los mismos cebadores murinos descritos anteriormente. Se utilizó la expresión de G3PDH como control positivo.
Generación de un anticuerpo monoclonal contra CLEC9A-El anticuerpo monoclonal (mAb), 9A11, específico para CLEC9A, se generó mediante inmunización de ratones de 129Sv con una proteína de fusión Fc-CLEC9A soluble. Se generaron hibridomas NS1 y los sobrenadantes de células diluidas clonalmente se examinaron mediante ELISA. Posteriormente, se seleccionó el mAb 9A11 (IgG1) en función de su capacidad para funcionar en ELISA, citometría de flujo y Western blot, en condiciones no reducidas.
Western Blotting y Desglicosilación: Para preparar extractos celulares, las células se lavaron con PBS y luego se lisaron en tampón Nonidet P—40 (1% Nonidet P-40, NaCl de 0,15 m, EDTA de 10 mm, NaN3 de 10 mm, Tris-HCl de 10 mm, pH 8), complementado con inhibidores de la proteasa (Roche Applied Science), durante 30 minutos a 4 °C. Los residuos/núcleos celulares se eliminaron por centrifugación, y los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron a -20 °C. Las concentraciones de proteínas de los extractos celulares se determinaron mediante el ensayo BCA (Pierce), y se ejecutaron cantidades iguales de proteínas en geles SDS-PAGE, de acuerdo con los protocolos estándar. Después de la transferencia a membranas de nitrocelulosa HybondC+ (Amersham Biosciences), se detectó CLEC9A mediante inmunotinción con 9A11 o anti-HA (clon 16B12, Covance) seguido de peroxidasa de rábano picante de cabra anti ratón (Jackson). Los blots se desarrollaron con el kit ECL-plus (Amersham Biosciences). Los lisados celulares se deglicosilaron con PNGasa F y / o O-glucosidasa (Roche Applied Science), según lo descrito por el fabricante.
Anticuerpos, Citometría de Flujo y Clasificación Celular—Las células se examinaron mediante citometría de flujo multicolor en un fascículo (BD Biosciences), realizado de acuerdo con protocolos convencionales a 4 °C en presencia de 2 mm NaN3. Antes de la adición de anticuerpos primarios, se bloquearon células en BP que contenían EDTA de 5 mm, ASC al 0,5% y suero de conejo inactivado por calor al 5% (células murinas) o suero murino (sangre periférica), y 50 µg/ml de IgG humana (Sigma; células humanas cultivadas in vitro y PBMC). Las células se fijaron con formaldehído al 1%, ASC al 0,25% en PBS antes del análisis.
Para aislar células 9A11 + para el análisis, se bloquearon 30 millones de PBMCs, aisladas como se describió anteriormente, con suero de ratón al 5% o IgG humana de 50 µg/ml durante 15 minutos a 4 °C. Las células se teñieron con 9A11 MAB biotinilados durante 30 minutos a 4 °C, seguidas de estreptavidina-APC (BD Pharmingen), y las células APC+ se clasificaron utilizando FACSVantage S.E. (Beckton Dickinson). Las celdas clasificadas se mantuvieron a 4 °C durante todo el procedimiento de clasificación y luego se teñieron para varios marcadores de superficie, como se describió anteriormente. Las células clasificadas representaron el 0,21% ± 0,07% de la población inicial de PBMCS y fueron de 72,89 ± 6.21% puro. Solo las células 9A11 + dentro de la población clasificada se analizaron más a fondo (ver Fig. 3B).
Expresión de hCLEC9A en BDCA3 + DC y un subconjunto de monocitos CD14+CD16. A, Análisis RT-PCR que muestra la expresión de CLEC9A en la mayoría de los tejidos, pero predominantemente en el cerebro, el bazo y el timo. B, utilizando un nuevo anticuerpo monoclonal (9A11), se encontró que CLEC9A se expresaba en una población menor de PBMC (ver suplemento Fig. S4C), y por lo tanto, las células que expresaban este receptor se clasificaron antes del análisis mediante citometría de flujo multicolor. Utilizando varios marcadores, como se indicó, se encontró que todas las células CLEC9A+ (gated) eran CD4+HLA-DR+CD11c+, y un análisis posterior indicó que el receptor se expresaba predominantemente en células dendríticas BDCA3+ (59 ± 10%), pero también en un subconjunto de monocitos CD64+CD11b+CD14+CD16 (14 ± 6%) y una tercera población de células CD64+CD11b+ CD14 – CD16 (23 ± 3%), que no se identificaron más a fondo. Los datos mostrados son representativos de los datos obtenidos de al menos seis donantes diferentes.
Ensayos de endocitosis: Para los ensayos de endocitosis, NIH3T3 transducido o RAW264.el día anterior al experimento se colocaron 7 celdas a 4 × 105 celdas/pozo y 5 × 105 celdas/pozo, respectivamente, en placas de 6 pocillos. Al inicio del ensayo, las células se lavaron y luego se bloquearon con PBS que contenían EDTA de 5 mm, NaN3 de 10 mm, ASC al 0,5% y suero de conejo inactivado por calor al 5% durante 30 minutos a 4 °C. Las células se teñieron con 9A11 biotinilado o anti-mdectina-1 (2A11; 10 µg/ml) y se incubaron durante 50 minutos a 4 °C y posteriormente se lavaron con lavado FACS (PBS, ASC al 05%, 10 mm NaN3 y EDTA de 5 mm), para eliminar anticuerpos no unidos. Un anticuerpo anti-ratón de oveja reticulado (Jackson; 5 µg / ml) y las células se incubaron durante otros 30 minutos a 4 °C. Después del lavado en medio de cultivo para eliminar el anticuerpo secundario no unido y la azida, las células se incubaron en medio de cultivo durante los tiempos indicados a 37 o 4 °C. Las células se teñieron con estreptavidina-PE (BD Pharmingen) y se examinaron para determinar la expresión de la superficie restante del receptor mediante citometría de flujo, como se describió anteriormente.
Para microscopía, las células se platearon a 2 × 105 / pocillo en cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos el día anterior al experimento. Las células se trataron de la misma manera que para el ensayo basado en el FACS, solo se teñieron con 9A11 durante 1 h a 4 °C y posteriormente se lavaron con el lavado del FACS para eliminar el anticuerpo no unido. Las células se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C o 4 °C en medio de cultivo. Después de la incubación, las células se fijaron en 1 ml de fijador (4% de paraformaldehído; HEPES de 250 mm en dH2O) durante 20 min. Los grupos aldehídos se apagaron con PBS-glicina (polvo de glicina de 25 mm en PBS) durante 10 min y luego se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,5% durante 20 min. Las células se lavaron con interpolación de PBS al 0,1% y luego se bloquearon con saponina al 0,5% durante 20 min. Las células se teñieron con LAMP-1 (clon ID4B; Banco de Estudios de Desarrollo de Hibridomas, Universidad de Iowa, Iowa City) durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron con interpolación de PBS al 0,1%. A continuación, se teñieron las células con asno anti ratón Cy3 y asno anti rata Alexa488 (dilución 1:100; ambas de Jackson) durante 50 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se lavaron con 0,1% de PBS-Tween. Los cubreobjetos se montaron con Vectashield (Laboratorios Vectoriales) y se examinaron mediante microscopía de fluorescencia convencional en un Zeiss Axiovert 40. Las imágenes se procesaron con Adobe Photoshop versión 6.0.
Ensayos de unión y citoquinas de Zymosán-los transfectantes RAW264.7 y NIH3T3 se platearon en 5 × 104 células/pocillo en placas de 24 pocillos el día anterior al experimento. Se lavaron las células, se agregaron β-glucanos solubles (glucano fosfato; un regalo amable de David Williams, ETSU; 5 µg/ml) cuando fue apropiado, y las células se incubaron durante 20 minutos a 4 °C para permitir la inhibición de la DRC Dectin-1 (18). Después de la adición de zymosan marcado con FITC (Invitrogen; 25 partículas/célula), las células se incubaron a 4 °C durante 60 minutos para permitir la unión, y luego se lavaron ampliamente para eliminar las partículas no unidas. Para la determinación del TNF, se incubaron 264,7 células CRUDAS durante otras 3 h, y la cantidad de TNF liberado en los sobrenadantes se determinó mediante ELISA (BD Biosciences). Para medir la unión de zimosán, se lisaron células en Tritón X-100 al 3% (Sigma), y la cantidad de zimosán unido se cuantificó mediante fluorometría utilizando un Titertek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.).
Para el análisis de las células B suficientes para Syk y deficientes para Syk, se estimularon 2 × 106 células transductas con zymosan sin etiquetar (Sigma; 1 partícula por célula) en placas de suspensión de 24 pocillos durante 24 h a 37 °C. La IL-2 secretada en los sobrenadantes se cuantificó mediante ELISA (BD Biosciences). Cuando estaba indicado, se incluyó piceatennol (Sigma) a 50 µm.
Ensayos de fagocitosis-Para cuantificar la fagocitosis por citometría de flujo, se sembraron fibroblastos NIH3T3 transducidos o macrófagos RAW264.7 a 2 × 105 células/pocillo en placas de 6 pocillos el día anterior al experimento. Cuando fue necesario, las células se pretrataron con citocalasina D de 5 µm (Calbioquem) durante 40 minutos a 37 °C, para inhibir la fagocitosis, y se mantuvieron durante todo el ensayo. Luego se lavaron las células y se añadió zymosan marcado con FITC (1 partícula/célula) y se permitió que se uniera durante 1 h a 4 °C. Después de esta incubación, se eliminó el zymosan sin unir mediante lavado, y las células se incubaron a 37°C durante 2 h (células NIH3T3) o 30 min (células RAW264, 7) para permitir la absorción de partículas. La cantidad de zymosan internalizado se determinó mediante citometría de flujo, como se describió anteriormente (19). Brevemente, el zymosan externo se tiñó con anti-zimosano policlonal de conejo (Invitrogen), que posteriormente se detectó con anticuerpos anti-conejo de cabra marcados con APC (Invitrogen). El análisis citométrico de flujo se realizó mediante compuertas en las poblaciones de células FITC positivas, que se habían unido a zymosan, y el porcentaje de internalización se determinó comparando las poblaciones de células APC negativas (partículas internalizadas) frente a las poblaciones de células APC positivas (partículas no internalizadas).
El examen de fagocitosis por microscopía de inmunofluorescencia se realizó de manera similar, excepto que las células transducidas se sembraron a 3 × 104 células/pocillo en cubreobjetos de vidrio, se agregaron 10 partículas por célula de zymosan marcado con FITC y se permitió que las células internalizaran las partículas durante 45 min a 37 °C. Después de esta incubación, las células se lavaron, se fijaron con 4% de paraformaldehído y se permeabilizaron con 0,25% de Saponina en el bloque FACS para 30 min a temperatura ambiente. La actina se tiñó con faloidina marcada con isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) de 1 µm (Sigma). Los cubreobjetos se montaron con Vectashield (Laboratorios Vectoriales) y se examinaron mediante microscopía de fluorescencia convencional en un Zeiss Axiovert 40. Las imágenes se procesaron con Adobe Photoshop versión 6.0.
Inmunoprecipitaciones—1 × 107 células CRUDAS264, 7 se estimularon con pervanadato durante 1 min a 37 °C, y las células se lisaron en tampón de lisis helado (25 mm Tris, pH 8,0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1,1% Nonidet P-40, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) con inhibidores de proteasa (Roche Applied Science). Los núcleos y restos de células se eliminaron por centrifugación, y los sobrenadantes recuperados se agregaron a perlas de estreptavidina (Sigma), preacopladas con péptidos fosforilados o no fosforilados biotinilados (25 µm). Los péptidos CLEC9A se generaron comercialmente (Sigma) y correspondieron a la siguiente región de la cola citoplasmática del receptor, 1MHEEEIYRSLQWD13. Los péptidos Dectin-1 se han descrito previamente (11). Las perlas se giraron durante 2 h a 4 °C y luego se lavaron, antes del análisis por Western blot. Se detectaron proteínas en los inmunoprecipitados con antifosfotirosina (clon 4G10) y anti-Syk o anti-Lyn (Biotecnología de Santa Cruz), seguidas de anticuerpos secundarios asociados a peroxidasa de rábano picante apropiados (Jackson).