EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Primäre Zellen, Zelllinien und Wachstumsbedingungen – Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden aus Buffy Coats (Western Province Blood Transfusion Service, Kapstadt, Südafrika) unter Verwendung von Ficoll-Paque ™ Plus (Amersham Biowissenschaften), wie zuvor beschrieben (14). Monozyten-abgeleitete Makrophagen und dendritische Zellen wurden wie beschrieben aus PBMCs erzeugt (14). NIH3T3 und HEK293T Fibroblasten, RAW264.7 Makrophagen, HEK293T-basierte Phoenix ecotrope retrovirale Verpackungszelllinien (ein Geschenk von Dr. Gary Nolan, Stanford University), Syk-defiziente (C35) und Syk-rekonstituierte (WT8) B-Zelllinien (15) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle’s Medium oder RPMI1640 Medium (Cambrex), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (Invitrogen), 20 mm HEPES, 2 mm l-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin (Cambrex). Alle Zellen wurden bei 37°C in 5% CO2 gezüchtet.
Erzeugung von Konstrukten und transduzierten Zelllinien — Der vollständige offene CLEC9A-Leserahmen (ORF) wurde aus humaner PBMC-cDNA durch PCR isoliert und in den pFBneo (Stratagene) retroviralen Vektor kloniert, der einen HA-Tag (16) enthält, unter Verwendung der folgenden Primer; AAAGAATTCCCACCATGCACGAGGAAGAAATATAC und AAACTCGAGGACAGAGGATCTCAACGC. C-terminal HA-markiertes murines CLEC9A (mCLEC9A) wurde in ähnlicher Weise aus Maus-Milz-cDNA unter Verwendung der folgenden Primer kloniert; AAAGTCGACCACCATGCATGCGGAAGAAATA und GTACTCGACGATGCAGGATCCAAATGC.
Die CLEC9A/Dectin-1-Chimäre in pFBneo wurde mittels Overlap Extension PCR mit den Primern CTGCTAAACTTTACAGAAAACCACAAGCCCACA und TCTGGGCTTGTGGTTTTCTGTAAAGTTTAGCAG erzeugt, so dass die Sequenz als CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84/Dectin-91NHKPTDectin-95 übersetzt wurde. Das Fc-CLEC9A-Expressionskonstrukt wurde durch PCR unter Verwendung der folgenden Primer erzeugt; TTTGGTACCAGCAGCAAGAAAAACTC und GCGGAATTCGACAGAGGATCTCAACGC, und in den pSecTag2-Vektor (Invitrogen) stromaufwärts der humanen IgG1-Fc-Region kloniert, erzeugt wie beschrieben (17). Die Treue aller Konstrukte wurde durch Sequenzierung verifiziert. Menschliche und murine CLEC9A und Isoformen wurden bei GenBank™ unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mCLEC9Aß, EU339278; mCLEC9Ay, EU339279; mCLEC9Aδ, EU339280; mCLEC9Ae, EU339281.
Zur Erzeugung stabiler Zelllinien wurden Konstrukte unter Verwendung von HEK293T-basierten Phoenix Ecotropic-Zellen in Vironen verpackt und die verschiedenen Zelllinien wie zuvor beschrieben transduziert (16). Alle Zelllinien wurden als nichtklonale Populationen verwendet, um Nebenwirkungen zu reduzieren, und wurden mindestens zweimal generiert und getestet, um den Phänotyp zu bestätigen. Bei Bedarf wurden Zelllinien selektiert und in 0,6 mg/ml Geneticin (G418) (Merck) oder 4 µg/ml Puromycin (Invitrogen) gehalten.
Die menschliche CLEC9A-Expression wurde durch PCR von cDNA-Panels aus menschlichem Gewebe (Clontech) unter Verwendung der folgenden Primer analysiert, die den gesamten ORF codieren: ATGCACGAGGAAGAAATATACACC und GACAGAGGATCTCAACGCATA. Die mCLEC9A-Expression wurde durch PCR von Mausgewebe-cDNA-Panels (Clontech) unter Verwendung der gleichen oben beschriebenen murinen Primer analysiert. Die Expression von G3PDH wurde als Positivkontrolle verwendet.
Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen CLEC9A — Der für CLEC9A spezifische monoklonale Antikörper (mAb) 9A11 wurde durch Immunisierung von 129Sv-Mäusen mit einem löslichen Fc-CLEC9A-Fusionsprotein erzeugt. NS1-Hybridome wurden erzeugt, und Überstände aus klonal verdünnten Zellen wurden durch ELISA gescreent. Der mAb 9A11 (IgG1) wurde anschließend basierend auf seiner Funktionsfähigkeit in ELISA, Durchflusszytometrie und Western Blotting unter nicht reduzierten Bedingungen ausgewählt.
Western Blotting und Deglykosylierung—Zur Herstellung von Zellextrakten wurden Zellen mit PBS gewaschen und anschließend in Nonidet P-40 Puffer (1% Nonidet P-40, 0,15 m NaCl, 10 mm EDTA, 10 mm NaN3, 10 mm Tris-HCl, pH 8), ergänzt mit Proteaseinhibitoren (Roche Applied Science), für 30 min bei 4°C lysiert. Zelltrümmer/Zellkerne wurden durch Zentrifugation entfernt und Überstände gesammelt und gelagert bei -20 ° C. Proteinkonzentrationen von Zellextrakten wurden durch BCA-Assay (Pierce) bestimmt, und gleiche Mengen Protein wurden auf SDS-PAGE-Gelen gemäß Standardprotokollen ausgeführt. Nach Transfer auf HybondC+ Nitrozellulosemembranen (Amersham Biosciences) wurde CLEC9A durch Immunfärbung mit 9A11 oder Anti-HA (Klon 16B12, Covance) gefolgt von Ziegen-Anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase (Jackson) nachgewiesen. Blots wurden mit dem ECL-plus Kit (Amersham Biosciences) entwickelt. Zelllysate wurden, wie vom Hersteller beschrieben, mit PNGase F und/oder O-Glycosidase (Roche Applied Science) deglykosyliert.
Antikörper, Durchflusszytometrie und Zellsortierung—Die Zellen wurden mittels Multicolor-Durchflusszytometrie an einem FASZCaliber (BD Biosciences) untersucht, durchgeführt nach konventionellen Protokollen bei 4 °C in Gegenwart von 2 mm NaN3. Die Zellen wurden in PBS mit 5 mm EDTA, 0,5% BSA und 5% hitzeinaktiviertem Kaninchenserum (Mauszellen) oder Mausserum (peripheres Blut) und 50 µg / ml humanem IgG (Sigma; in vitro kultivierte menschliche Zellen und PBMCs) vor der Zugabe von Primärantikörpern blockiert. Die Zellen wurden vor der Analyse mit 1% Formaldehyd, 0,25% BSA in PBS fixiert.
Zur Isolierung von 9A11+ -Zellen für die Analyse wurden 30 Millionen PBMCs, isoliert wie oben beschrieben, mit 5% Maus-Serum oder 50 µg/ml humanem IgG für 15 min bei 4 °C blockiert. Die Zellen wurden dann mit biotinyliertem 9A11 mAb für 30 min bei 4 °C gefärbt, gefolgt von Streptavidin-APC (BD Pharmaceuticals), und APC+ -Zellen wurden mit FACSVantage S.E. (Beckton Dickinson) sortiert. Die sortierten Zellen wurden während des gesamten Sortiervorgangs bei 4 °C gehalten und dann wie oben beschrieben für verschiedene Oberflächenmarker angefärbt. Die sortierten Zellen repräsentierten 0,21% ± 0,07% der Ausgangspopulation von PBMCs und waren 72,89 ± 6.21% rein. Nur 9A11+ Zellen innerhalb der sortierten Population wurden weiter analysiert (siehe Abb. 3B).
Expression von hCLEC9A auf BDCA3 + DC und einer Teilmenge von CD14 + CD16- Monozyten. EINE RT-PCR-Analyse zeigt die Expression von CLEC9A in den meisten Geweben, vorwiegend jedoch im Gehirn, in der Milz und im Thymus. B, unter Verwendung eines neuen monoklonalen Antikörpers (9A11), wurde gefunden, dass CLEC9A auf einer kleinen Population von PBMC exprimiert wurde (siehe ergänzende Abb. S4C), und Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren, wurden daher vor der Analyse durch Mehrfarbendurchflusszytometrie sortiert. Unter Verwendung verschiedener Marker wurde, wie angegeben, festgestellt, dass alle CLEC9A + -Zellen (gated) CD4 + HLA-DR + CD11c + waren, und weitere Analysen zeigten, dass der Rezeptor überwiegend auf BDCA3 + -dendritischen Zellen exprimiert wurde (59 ± 10%), aber auch auf einer Teilmenge von CD64 + CD11b + CD14 + CD16- Monozyten (14 ± 6%) und einer dritten Population von CD64 + CD11b + CD14- CD16- Zellen (23 ± 3%), die nicht weiter identifiziert wurden. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für Daten, die von mindestens sechs verschiedenen Spendern erhalten wurden.
Endozytose-Assays – Für die Endozytose-Assays transduziert NIH3T3 oder RAW264.7 Zellen wurden am Tag vor dem Experiment mit 4 × 105 Zellen / Well bzw. 5 × 105 Zellen / Well in 6-Well-Platten plattiert. Zu Beginn des Assays wurden die Zellen gewaschen und anschließend mit PBS enthaltend 5 mm EDTA, 10 mm NaN3, 0,5% BSA und 5% hitzeinaktiviertes Kaninchenserum für 30 min bei 4°C blockiert. Die Zellen wurden mit biotinyliertem 9A11 oder Anti-mDectin-1 (2A11; 10 µg/ml) gefärbt und für 50 min bei 4°C inkubiert und anschließend mit FACS Wash (PBS, 05% BSA, 10 mm NaN3 und 5 mm EDTA), um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Ein vernetzender Schaf-Anti-Maus-Antikörper (Jackson; 5 µg/ml) zugegeben und die Zellen weitere 30 min bei 4°C inkubiert. Nach Waschen in Kulturmedium zur Entfernung von ungebundenem Sekundärantikörper und Azid wurden die Zellen für die angegebenen Zeiten entweder bei 37 oder 4°C in Kulturmedium inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Streptavidin-PE (BD Pharmingen) angefärbt und wie oben beschrieben durchflusszytometrisch auf verbleibende Rezeptoroberflächenexpression untersucht.
Für die Mikroskopie wurden Zellen am Tag vor dem Experiment mit 2 × 105 / Well auf Glasdeckgläsern in 6-Well-Platten plattiert. Die Zellen wurden wie für den FACS-basierten Assay behandelt, nur 1 h bei 4°C mit 9A11 gefärbt und anschließend mit FACS Wash gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Die Zellen wurden für 30 min bei 37°C oder 4°C in Kulturmedium inkubiert. Nach Inkubation wurden die Zellen in 1 ml Fixiermittel (4% Paraformaldehyd; 250 mm HEPES in dH2O) für 20 min fixiert. Die Aldehydgruppen wurden mit PBS-Glycin (25 mm Glycinpulver in PBS) für 10 min gequencht und anschließend mit 0,5% Triton X-100 für 20 min permeabilisiert. Die Zellen wurden mit 0,1% PBS-Tween gewaschen und danach mit 0,5% Saponin für 20 min blockiert. Die Zellen wurden mit LAMP-1 (Klon ID4B; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City) 1 h bei Raumtemperatur gefärbt und mit 0,1% PBS-Tween gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit Donkey anti-mouse Cy3 und donkey anti-rat Alexa488 (Verdünnung 1:100; beide von Jackson) 50 min bei Raumtemperatur gefärbt und anschließend mit 0,1% PBS-Tween gewaschen. Deckgläser wurden mit Vectashield (Vector Laboratories) montiert und mittels konventioneller Fluoreszenzmikroskopie auf einem Zeiss Axiovert 40 untersucht. Die Bilder wurden mit Adobe Photoshop Version 6.0 verarbeitet.
Zymosan—Bindungs- und Zytokin-Assays – RAW264.7- und NIH3T3-Transfektanten wurden am Tag vor dem Experiment mit 5 × 104 Zellen / Well in 24-Well-Platten plattiert. Die Zellen wurden gewaschen, gegebenenfalls mit löslichen β-Glucanen (Glucanphosphat; eine Art Geschenk von David Williams, ETSU; 5 µg/ml) versetzt und die Zellen für 20 min bei 4°C inkubiert, um eine Hemmung des Dectin-1 CRD zu ermöglichen (18). Nach Zugabe von FITC-markiertem Zymosan (Invitrogen; 25 Partikel /Zelle) wurden die Zellen 60 min bei 4 °C inkubiert, um eine Bindung zu ermöglichen, und dann ausgiebig gewaschen, um ungebundene Partikel zu entfernen. Zur Bestimmung von TNF wurden RAW264.7 Zellen für weitere 3 h inkubiert und die Menge an in die Überstände freigesetztem TNF mittels ELISA (BD Biosciences) bestimmt. Zur Messung der Zymosanbindung wurden Zellen in 3% Triton X-100 (Sigma) lysiert und die Menge an gebundenem Zymosan fluorometrisch mit einem Titertek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.).
Zur Analyse der Syk-ausreichenden und Syk-defizienten B-Zellen wurden 2 × 106 transduzierte Zellen mit unmarkiertem Zymosan (Sigma; 1 Partikel pro Zelle) in 24-well Suspensionsplatten für 24 h bei 37°C stimuliert. In die Überstände sekretiertes IL-2 wurde mittels ELISA (BD Biosciences) quantifiziert. Wo angegeben, wurde Piceatennol (Sigma) bei 50 µm eingeschlossen.
Phagozytose—Assays – Zur Quantifizierung der Phagozytose durch Durchflusszytometrie wurden am Tag vor dem Experiment transduzierte NIH3T3-Fibroblasten oder RAW264.7-Makrophagen bei 2 × 105 Zellen / Well in 6-Well-Platten ausgesät. Bei Bedarf wurden die Zellen mit 5 µm Cytochalasin D (Calbiochem) für 40 min bei 37 ° C vorbehandelt, um die Phagozytose zu hemmen, und wurden während des gesamten Assays aufrechterhalten. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und FITC-markiertes Zymosan zugegeben (1 Partikel/Zelle) und 1 h bei 4°C binden gelassen. Im Anschluss an diese Inkubation wurde ungebundenes Zymosan durch Waschen entfernt und die Zellen 2 h (NIH3T3-Zellen) oder 30 min (RAW264.7-Zellen) bei 37°C inkubiert, um eine Partikelaufnahme zu ermöglichen. Die Menge an internalisiertem Zymosan wurde dann wie zuvor beschrieben durchflusszytometrisch bestimmt (19). Kurz gesagt, externes Zymosan wurde mit polyklonalem Kaninchen-Anti-Zymosan (Invitrogen) gefärbt, das anschließend mit APC-markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpern (Invitrogen) nachgewiesen wurde. Die durchflusszytometrische Analyse wurde durch Gating an den APC-positiven Zellpopulationen durchgeführt, die Zymosan gebunden hatten, und der Prozentsatz der Internalisierung wurde durch Vergleich der APC-negativen (internalisierten Partikel) mit den APC-positiven (nicht internalisierten Partikel) Zellpopulationen bestimmt.
Die Untersuchung der Phagozytose mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wurde analog durchgeführt, jedoch wurden die transduzierten Zellen bei 3×104 Zellen/Well auf Glasdeckgläsern ausgesät, 10 Partikel pro Zelle FITC-markiertes Zymosan zugegeben und die Zellen 45 min bei 37°C internalisieren gelassen. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen gewaschen, mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit 0,25% Saponin in FACS permeabilisiert. für 30 min bei Raumtemperatur. Aktin wurde mit 1 µm Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC)-markiertem Phalloidin (Sigma) gefärbt. Deckgläser wurden mit Vectashield (Vector Laboratories) montiert und mittels konventioneller Fluoreszenzmikroskopie auf einem Zeiss Axiovert 40 untersucht. Die Bilder wurden mit Adobe Photoshop Version 6.0 verarbeitet.
Immunpräzipitationen—1 × 107 RAW264.7 Zellen wurden mit Pervanadat für 1 min bei 37°C stimuliert und die Zellen in eiskaltem Lysepuffer (25 mm Tris, pH 8,0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1,1% Nonidet P-40, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) mit Proteaseinhibitoren (Roche Applied Science) lysiert. Kerne und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt und die gewonnenen Überstände zu Streptavidin-Beads (Sigma) gegeben, die mit biotinylierten phosphorylierten oder unphosphorylierten Peptiden (25 µm) vorgekoppelt waren. Die CLEC9A-Peptide wurden kommerziell erzeugt (Sigma) und entsprachen der folgenden Region des cytoplasmatischen Schwanzes des Rezeptors, 1MHEEEIYRSLQWD13. Die Dectin-1-Peptide wurden zuvor beschrieben (11). Die Perlen wurden 2 h bei 4°C gedreht und anschließend gewaschen, bevor sie durch Western-Blotting analysiert wurden. Proteine in den Immunpräzipitaten wurden mit Anti-Phosphotyrosin (Klon 4G10) und Anti-Syk oder Anti-Lyn (Santa Cruz Biotechnology) nachgewiesen, gefolgt von geeigneten Meerrettich-Peroxidase-gebundenen Sekundärantikörpern (Jackson).