CLEC9A ER En Ny Aktiverings-C-Type Lektinlignende Reseptor Uttrykt på BDCA3+ Dendritiske Celler og En Undergruppe Av Monocytter | Anne Marie

EKSPERIMENTELLE PROSEDYRER

Primære Celler, Cellelinjer og Vekstforhold—Perifere blodmononukleære celler (PBMC) ble isolert Fra buffy-frakker (Western Province Blood Transfusion Service, Cape Town, Sør-Afrika) ved Hjelp Av Ficoll-Paque™ Plus (Amersham Biosciences), SOM TIDLIGERE BESKREVET (14). Monocytt-avledede makrofager og dendrittiske celler ble generert fra Pbmcer som beskrevet (14). NIH3T3 og HEK293T fibroblaster, RAW264.7 makrofager, HEK293T-baserte Phoenix ecotropic retroviral emballasje cellelinjer (en gave Fra Dr. Gary Nolan, Stanford University), Syk-mangelfull (C35) OG Syk-rekonstituert (WT8) B-cellelinjer (15) ble opprettholdt I Dulbeccos modifiserte Eagle ‘ s medium eller Rpmi1640 medium (Cambrex) supplert med 10% varmeinaktivert føtal kalv serum (Invitrogen), 20 mm HEPES, 2 mm l-glutamin, 100 enheter/ml penicillin OG 0,1 MG/ml streptomycin (cambrex). Alle celler ble dyrket ved 37 °C i 5% CO2.

Generering Av Konstruksjoner Og Transduserte Cellelinjer—DEN komplette clec9a open reading frame (ORF) ble isolert fra menneskelig PBMC cDNA VED PCR og klonet inn i pFBneo (Stratagene) retroviral vektor inneholdende EN HA tag (16) ved hjelp av følgende primere; AAAGAATTCCCACCATGCACGAGGAAGAAATATAC og AAACTCGAGGACAGAGGATCTCAACGC. C-terminalt HA-merket murine CLEC9A (mCLEC9A) ble på samme måte klonet fra mus milt cDNA ved hjelp av følgende primere; AAAGTCGACCACCATGCATGCGGAAGAAATA og GTACTCGACGATGCAGGATCCAAATGC.

CLEC9A / Dectin – 1 chimera i pFBneo ble generert ved hjelp av overlapping forlengelse PCR med primere CTGCTAAACTTTACAGAAAAACCACAAGCCACA og TCTGGGGCTTGTGGTTTTCTGTAAAGTTTAGCAG slik at sekvensen oversatt SOM CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84/Dectin-91NHKPTDectin-95. Fc-CLEC9A-uttrykkskonstruksjonen ble generert AV PCR ved hjelp av følgende primere; TTTGGTACCAGCAGCAGCAAGAAAAACTC og GCGGAATTCGACAGAGGATCTCAACGC, og klonet inn i pSecTag2-vektoren (Invitrogen) oppstrøms fra Den menneskelige IgG1 Fc-regionen, generert som beskrevet (17). Trofastheten til alle konstruksjoner ble verifisert ved sekvensering. Menneskelige OG murine CLEC9A OG isoformer er deponert hos GenBank™ under følgende tiltredelsesnumre: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mCLEC9Aß, EU339278; mCLEC9Ay, EU339279; mCLEC9Aδ, EU339280; mCLEC9Ae, EU339281.

for å generere stabile cellelinjer ble konstruksjoner pakket inn i vironer ved HJELP AV HEK293T-baserte Phoenix ecotropic-celler, og de forskjellige cellelinjene ble transdusert som tidligere beskrevet (16). Alle cellelinjer ble brukt som ikke-klonale populasjoner for å redusere grunnleggereffekter og ble generert og testet minst to ganger for å bekrefte fenotype. Ved behov ble cellelinjer valgt og opprettholdt i 0,6 mg/ml Geneticin (G418) (Merck) eller 4 µ / ml puromycin (Invitrogen).

Human CLEC9A uttrykk ble analysert VED PCR av humant vev cDNA paneler (Clontech) ved hjelp av følgende primere koding HELE ORF, ATGCACGAGGAAGAAATATACACC OG GACAGAGGATCTCAACGCATA. mCLEC9A uttrykk ble analysert VED PCR av mus vev cDNA paneler (Clontech) ved hjelp av de samme murine primere beskrevet ovenfor. Uttrykk FOR G3PDH ble brukt som en positiv kontroll.

Generering Av Et Monoklonalt Antistoff mot CLEC9A—det monoklonale antistoffet (mab), 9a11, spesifikt FOR CLEC9A, ble generert ved immunisering av 129sv mus med et Oppløselig Fc-CLEC9A fusjonsprotein. NS1 hybridomer ble generert, og supernatanter fra klonalt fortynnede celler ble screenet AV ELISA. MAb 9A11 (IgG1) ble deretter valgt basert på dets evne til å fungere I ELISA, flowcytometri og Western blotting, under ikke-reduserte forhold.

Western Blotting og Deglykosylering—for å fremstille cellulære ekstrakter ble cellene vasket MED PBS og deretter lysert I Nonidet P-40 buffer (1% Nonidet P-40, 0,15 m NaCl, 10 mm EDTA, 10 Mm NaN3, 10 mm Tris-HCl, pH 8), supplert med proteasehemmere (Roche Applied Science), i 30 min ved 4 °C. Cellulær rusk/kjerner ble fjernet ved sentrifugering og supernatanter ble samlet og lagret ved -20 °c. Proteinkonsentrasjoner Av Celleekstrakter Ble Bestemt Ved bca-Analyse (pierce), og like mengder PROTEIN ble kjørt på sds-Side Geler, I henhold til standardprotokoller. ETTER overføring til HybondC+ nitrocellulose membraner (Amersham Biosciences), BLE CLEC9A påvist ved immunostaining MED 9A11 eller anti-HA (klon 16B12, Covance) etterfulgt av geit anti-mus pepperrot peroxidase (Jackson). Blots ble utviklet MED ECL-plus kit (Amersham Biosciences). Cellelysater ble deglykosylert Med med PNGase F Og / eller O-glykosidase (Roche Applied Science), som beskrevet av produsenten.

Antistoffer, Flowcytometri og Cellesortering—Celler ble undersøkt med flerfarget flowcytometri på En FASCCaliber (BD Biovitenskap), utført i henhold til konvensjonelle protokoller ved 4 °C i nærvær av 2 mm NaN3. Celler ble blokkert I PBS som inneholdt 5 mm EDTA, 0,5% BSA og 5% varmeinaktivert kaninserum (murine celler) eller murine serum (perifert blod), og 50 µ/ml humant IgG (Sigma; in vitro dyrkede humane celler og Pbmcer) før tilsetning av primære antistoffer. Celler ble fikset med 1% formaldehyd, 0,25% BSA i PBS før analyse.

for å isolere 9a11 + – celler for analyse ble 30 millioner Pbmcer, isolert som beskrevet ovenfor, blokkert med 5% museserum eller 50 µ/ml humant IgG i 15 minutter ved 4 °C. Celler ble deretter farget med biotinylert 9A11 mAb i 30 minutter ved 4 °C, etterfulgt av streptavidin-APC (BD Pharmingen), OG APC + – celler ble sortert Ved Hjelp Av FACSVantage S. E. (Beckton Dickinson). De sorterte cellene ble holdt på 4 °c gjennom sorteringsprosedyren og deretter farget for forskjellige overflatemarkører, som beskrevet ovenfor. De sorterte cellene representerte 0.21% ± 0.07% av startpopulasjonen Av Pbmc og var 72.89 ± 6.21% ren. Bare 9A11 + celler i den sorterte populasjonen ble analysert videre (Se Fig. 3B).

Endocytose Analyser – for endocytose analyser, transdusert NIH3T3 ELLER RAW264.7 celler ble belagt med henholdsvis 4 × 105 celler/brønn og 5 × 105 celler/brønn i 6-brønnplater dagen før forsøket. Ved starten av analysen ble cellene vasket og deretter blokkert MED PBS inneholdende 5 mm EDTA, 10 mm NaN3, 0,5% Bsa og 5% varmeinaktivert kaninserum i 30 min ved 4 °C. Cellene ble farget med biotinylert 9A11 eller anti-mdektin-1 (2a11; 10 µ/ml) og inkubert i 50 min ved 4 °C og deretter vasket med FACS wash (PBS, 05% BSA, 10 mm NaN3 og 5 mm EDTA), for å fjerne ubundet antistoff. Et tverrbindende sau anti-mus antistoff (Jackson; 5 µ / ml) ble tilsatt og cellene ble inkubert i ytterligere 30 minutter ved 4 °C. etter vasking i kulturmedium for å fjerne ubundet sekundært antistoff og azid, ble cellene inkubert i kulturmedium for tiden angitt ved enten 37 Eller 4 °C. Celler ble deretter farget med streptavidin-PE (BD Pharmingen), og undersøkt for gjenværende reseptoroverflateuttrykk ved flowcytometri, som beskrevet ovenfor.

for mikroskopi ble cellene belagt med 2 × 105/brønn på glassdeksler i 6-brønnplater dagen før forsøket. Cellene ble behandlet på samme måte som FOR FACS-basert analyse, kun farget MED 9A11 I 1 h ved 4 °c og deretter vasket med FACS vask for å fjerne ubundet antistoff. Cellene ble inkubert i 30 min ved enten 37 °C Eller 4 °C i kulturmedium. Etter inkubasjon ble cellene festet i 1 ml Fikseringsmiddel (4% paraformaldehyd; 250 mm HEPES i dH2O) i 20 min. Aldehydgruppene ble slukket MED PBS-glycin (25 mm glycinpulver I PBS) i 10 min og deretter permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i 20 min. Cellene ble vasket med 0,1% PBS-Tween og deretter blokkert med 0,5% Saponin i 20 minutter. Celler ble farget MED LAMP-1 (clone ID4B; Utviklingsstudier Hybridoma Bank, University Of Iowa, Iowa City) for 1 h ved romtemperatur og vasket med 0.1% PBS-Tween. Cellene ble deretter farget Med esel anti-mus Cy3 Og esel anti-rotte Alexa488 (1: 100 fortynning; begge Fra Jackson) i 50 min ved romtemperatur og deretter vasket med 0,1% PBS-Tween. Dekkglass ble montert Med Vectashield (Vector Laboratories) og undersøkt ved konvensjonell fluorescensmikroskopi På En Zeiss Axiovert 40. Bildene ble behandlet Med Adobe Photoshop versjon 6.0.

Zymosan Binding Og Cytokin Analyser—RAW264.7 og NIH3T3 transfectants ble belagt på 5 × 104 celler/brønn i 24-brønnplater dagen før forsøket. Cellene ble vasket, oppløselige β-glukaner (glukanfosfat; en slags gave Fra David Williams, ETSU; 5 µ/ml) tilsatt der det var hensiktsmessig, og cellene inkuberte i 20 min ved 4 °C for å tillate hemming Av DECTIN-1 CRD (18). Etter tilsetning AV FITC-merket zymosan (Invitrogen; 25 partikler/celle) ble cellene inkubert ved 4 °C i 60 min for å tillate binding, og deretter vasket grundig for å fjerne ubundne partikler. FOR bestemmelse AV TNF BLE RAW264. 7-celler inkubert for en annen 3 h, og mengden TNF frigjort i supernatantene ble bestemt AV ELISA (BD Biosciences). For måling av zymosanbinding ble celler lysert i 3% Triton X-100 (Sigma), og mengden bundet zymosan ble kvantifisert ved fluorometri ved Bruk Av En Titertek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.).

for analyse av Syk-tilstrekkelige Og Syk-mangelfulle B-celler ble 2 × 106 transduserte celler stimulert med umerket zymosan (Sigma; 1 partikkel per celle) i 24-brønnsopphengsplater i 24 timer ved 37 °C. IL-2 utskilt i supernatantene ble kvantifisert AV ELISA (BD Biosciences). Der det er angitt, var piceatennol (Sigma) inkludert til 50 µ.

Fagocytoseanalyser—for å kvantifisere fagocytose ved flowcytometri, transduserte NIH3T3 fibroblaster eller RAW264.7 makrofager ble sådd ved 2 × 105celler/brønn i 6-brønnplater dagen før forsøket. Ved behov ble cellene forbehandlet med 5 µ cytochalasin D (Calbiochem) i 40 min ved 37 °C for å hemme fagocytose og ble opprettholdt gjennom hele analysen. Cellene ble deretter vasket og FITC-merket zymosan ble tilsatt (1 partikkel / celle)og tillatt å binde i 1 time ved 4 °C. Etter denne inkubasjonen ble ubundet zymosan fjernet ved vasking, og cellene inkuberte ved 37°C for 2 timer (NIH3T3 celler) eller 30 min (RAW264.7 celler) for å tillate partikkelopptak. Mengden internalisert zymosan ble deretter bestemt ved flowcytometri, som tidligere beskrevet (19). Kort sagt ble ekstern zymosan farget med polyclonal rabbit anti – Zymosan (Invitrogen), som senere ble påvist MED APC-merkede geit-anti-kaninantistoffer (Invitrogen). Flowcytometrisk analyse ble utført ved å gating på FITC-positive cellepopulasjoner, som hadde bundet zymosan, og prosentandelen av internalisering ble bestemt ved å sammenligne APC-negative (internaliserte partikler) versus APC-positive (ikke-internaliserte partikler) cellepopulasjoner.

undersøkelsen av fagocytose ved immunfluoresensmikroskopi ble utført på samme måte, bortsett fra at de transduserte cellene ble sådd ved 3 × 104 celler/brønn på glassdeksler, 10 partikler per celle AV FITC-merket zymosan ble tilsatt, og cellene fikk lov til å internalisere partiklene i 45 min ved 37 °C. Etter denne inkubasjonen ble cellene vasket, festet med 4% paraformaldehyd og permeabilisert med 0,25% Saponin I FACS-blokk for 30 min ved romtemperatur. Actin ble farget med 1 µ tetrametylrhodamine isothiocyanate (TRITC)-merket phalloidin (Sigma). Dekkglass ble montert Med Vectashield (Vector Laboratories) og undersøkt ved konvensjonell fluorescensmikroskopi På En Zeiss Axiovert 40. Bildene ble behandlet Med Adobe Photoshop versjon 6.0.

Immunoprecipitasjoner—1 × 107 RAW264.7 celler ble stimulert med pervanadat i 1 min ved 37 °C, og cellene lyserte i iskald lysisbuffer (25 Mm Tris, pH 8,0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1,1% Nonidet P-40, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) med proteasehemmere (Roche Applied Science). Kjerner og cellerester ble fjernet ved sentrifugering, og de gjenvunnede supernatantene ble tilsatt streptavidinperler (Sigma), forhåndsdoblet med biotinylerte fosforylerte eller ikke-fosforylerte peptider (25 µ). CLEC9A-peptidene ble generert kommersielt (Sigma)og korresponderte med følgende region av cytoplasmatisk hale av reseptoren, 1MHEEEIYRSLQWD13. Dectin-1-peptidene er beskrevet tidligere (11). Perlene ble rotert for 2 h ved 4 °C og deretter vasket, før analyse Av Western blotting. Proteiner i immunoprecipitatene ble påvist med anti-fosfotyrosin (klon 4G10) og anti-Syk eller anti-Lyn (Santa Cruz Biotechnology), etterfulgt av passende pepperrotperoksidasebundne sekundære antistoffer (Jackson).