PROCEDURE SPERIMENTALI
Celle Primarie, Linee cellulari e Condizioni di Crescita—cellule mononucleate di sangue Periferico (PBMC) sono stati isolati da buffy coats (Provincia Occidentale Servizio Trasfusionale, Città del Capo, Sud Africa) utilizzando Ficoll-Paque™ Plus (Amersham Biosciences), come descritto in precedenza (14). Macrofagi monociti e cellule dendritiche sono stati generati da PBMC come descritto (14). Fibroblasti NIH3T3 e HEK293T, RAW264.7 macrofagi, cellule HEK293T a base di Phoenix ecotropic imballaggio retrovirale linee di cellule (un regalo da parte del Dr. Gary Nolan, Stanford University), Syk-carenti (C35) e Syk ricostituito (WT8) linee di cellule B (15) sono stati mantenuti in Dulbecco’s modified eagle’s medium o RPMI1640 medio (Cambrex) supplementato con 10% inattivati siero fetale di vitello (Invitrogen), 20 mm HEPES, 2 mm l-glutammina, 100 unità/ml di penicillina, e 0,1 mg/ml di streptomicina (Cambrex). Tutte le cellule sono state coltivate a 37 °C in 5% CO2.
Generazione di costrutti e linee cellulari trasdotte—L’ORF (Open Reading frame) completo di CLEC9A è stato isolato dal cDNA PBMC umano mediante PCR e clonato nel vettore retrovirale pFBneo (Stratagene) contenente un tag HA (16) utilizzando i seguenti primer; AAAGAATTCCCACCATGCACGAGGAAGAAATATAC e AAACTCGAGGACAGAGGATCTCAACGC. CLEC9A murino C-terminale con tag HA (mCLEC9A) è stato similmente clonato da cDNA splenico di topo usando i seguenti primer; AAAGTCGACCACCATGCATGCGGAAGAAATA e GTACTCGACGATGCAGGATCCAAATGC.
La chimera CLEC9A/Dectin-1 in pFBneo è stata generata utilizzando l’estensione di sovrapposizione PCR con primer CTGCTAAACTTTACAGAAAACCACAAGCCCACA e TCTGGGCTTGTGTTTTCTGTAAAGTTTAGCAG tale che la sequenza tradotta come CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84/Dectin-91NHKPTDectin-95. Il costrutto di espressione Fc-CLEC9A è stato generato mediante PCR utilizzando i seguenti primer; TTTGGTACCAGCAGCAAGAAAAACTC e GCGGAATTCGACAGAGGATCTCAACGC, e clonato nel vettore pSecTag2 (Invitrogen) a monte della regione Fc human1 umana, generata come descritto (17). La fedeltà di tutti i costrutti è stata verificata dal sequenziamento. CLEC9A e isoforme umane e murine sono state depositate presso GenBank™ con i seguenti numeri di adesione: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mCLEC9Aß, EU339278; mCLEC9Ay, EU339279; mCLEC9Aδ, EU339280; mCLEC9Ae, EU339281.
Per generare linee cellulari stabili, i costrutti sono stati impacchettati in vironi, utilizzando cellule ecotropiche Phoenix basate su HEK293T, e le varie linee cellulari sono state trasdotte come descritto in precedenza (16). Tutte le linee cellulari sono state utilizzate come popolazioni non clonali per ridurre gli effetti del fondatore e sono state generate e testate almeno due volte per confermare il fenotipo. Ove necessario, le linee cellulari sono state selezionate e mantenute in 0,6 mg/ml di geneticina (G418) (Merck) o 4 µg/ml di puromicina (Invitrogen).
L’espressione di CLEC9A umana è stata analizzata mediante PCR di pannelli cDNA di tessuto umano (Clontech) utilizzando i seguenti primer che codificano l’intero ORF, ATGCACGAGGAAGAAATATACACC e GACAGAGGATCTCAACGCATA. L’espressione mCLEC9A è stata analizzata mediante PCR di pannelli cDNA di tessuto murino (Clontech) utilizzando gli stessi primer murini sopra descritti. L’espressione di G3PDH è stata utilizzata come controllo positivo.
Generazione di un anticorpo monoclonale contro CLEC9A—L’anticorpo monoclonale (mAb), 9A11, specifico per CLEC9A, è stato generato mediante immunizzazione di topi 129Sv con una proteina di fusione Fc-CLEC9A solubile. Sono stati generati ibridomi NS1 e i supernatanti provenienti da cellule diluite clonalmente sono stati sottoposti a screening ELISA. Il mAb 9A11 (I1) è stato successivamente selezionato in base alla sua capacità di funzionare in ELISA, citometria a flusso e Western blotting, in condizioni non ridotte.
Western Blotting e Deglycosylation—Per preparare estratti cellulari, le cellule sono state lavate con PBS e poi lisati in Nonidet P-40 buffer (1% Nonidet P-40, 0.15 m NaCl, 10 mm EDTA 10 mm di NaN3, 10 mm Tris-HCl, pH 8), integrato con inibitori della proteasi (Roche Applied Science), per 30 min a 4 °C. detriti Cellulari/nuclei sono stati rimossi mediante centrifugazione, e supernatanti sono stati raccolti e conservati a -20 °C. le concentrazioni di Proteina di estratti cellulari sono stati determinati da BCA dosaggio (Pierce), e uguale quantità di proteina sono stati eseguiti su SDS-PAGE gel, secondo protocolli standard. Dopo il trasferimento alle membrane di nitrocellulosa HybondC+ (Amersham Biosciences), CLEC9A è stato rilevato immunotenente con 9A11 o anti-HA (clone 16B12, Covance) seguito da perossidasi di rafano di capra anti-topo (Jackson). Le macchie sono state sviluppate con il kit ECL-plus (Amersham Biosciences). I lisati cellulari sono stati deglicosilati con PNGasi F e / o O-glicosidasi (Roche Applied Science), come descritto dal produttore.
Anticorpi, citometria a flusso e ordinamento cellulare—Le cellule sono state esaminate mediante citometria a flusso multicolore su un FASCCaliber (BD Biosciences), eseguito secondo i protocolli convenzionali a 4 °C in presenza di 2 mm NaN3. Le cellule sono state bloccate in PBS contenenti 5 mm EDTA, 0,5% BSA e 5% siero di coniglio inattivato dal calore (cellule murine) o siero murino (sangue periferico) e 50 µg/ml di IgG umane (Sigma; cellule umane coltivate in vitro e PBMC) prima dell’aggiunta di anticorpi primari. Le cellule sono state fissate con 1% di formaldeide, 0,25% di BSA in PBS prima dell’analisi.
Per isolare 9A11+ cellule per l’analisi, 30 milioni di PBMCs, isolato, come sopra descritto, sono stati bloccati con il 5% di siero di topo o di 50 µg/ml di IgG umane per 15 min a 4 °C. le Cellule sono state poi colorate con anticorpo 9A11 mAb per 30 min a 4 °C, seguita da streptavidina-APC (BD Pharmingen), e APC+ cellule sono state ordinate FACSVantage SE (Beckton Dickinson). Le celle ordinate sono state mantenute a 4 °C durante tutta la procedura di selezione e poi colorate per vari marcatori di superficie, come descritto sopra. Le celle ordinate rappresentavano lo 0,21% ± 0,07% della popolazione iniziale di PBMC ed erano 72,89 ± 6.21% puro. Solo le cellule 9A11+ all’interno della popolazione ordinata sono state ulteriormente analizzate (vedi Fig. 3 TER).
Espressione di hCLEC9A su BDCA3 + DC e un sottoinsieme di CD14 + CD16 – monociti. A, analisi RT-PCR che mostra l’espressione di CLEC9A nella maggior parte dei tessuti, ma prevalentemente nel cervello, nella milza e nel timo. B, utilizzando un nuovo anticorpo monoclonale (9A11), CLEC9A è risultato essere espresso su una popolazione minore di PBMC (vedere Fig. S4C) e le cellule che esprimono questo recettore sono state quindi ordinate prima dell’analisi mediante citometria a flusso multicolore. Utilizzando vari indicatori, come indicato, tutti i CLEC9A+ cellule (recintato) sono stati trovati per essere CD4+HLA-DR+CD11c+, e un’ulteriore analisi ha indicato che il recettore è stata espressa prevalentemente su BDCA3+ cellule dendritiche (59 ± 10%), ma anche su un sottoinsieme di CD64+CD11b+CD14+CD16 – monociti (14 ± 6%) e un terzo della popolazione di CD64+CD11b+ CD14 – CD16 – cellule (23 ± 3%), che non sono state identificate ulteriori. I dati mostrati sono rappresentativi dei dati ottenuti da almeno sei diversi donatori.
Analisi di endocitosi-Per i saggi di endocitosi, trasdotto NIH3T3 o RAW264.7 celle sono state placcate a 4 × 105 celle / pozzetto e 5 × 105 celle/pozzetto, rispettivamente, in piastre a 6 pozzetti il giorno prima dell’esperimento. All’inizio del test, le cellule sono state lavate e poi bloccate con PBS contenente 5 mm EDTA 10 mm di NaN3, 0,5% di BSA, e il 5% inattivati al calore di siero di coniglio per 30 min a 4 °C. le Cellule sono state colorate con anticorpo 9A11 o anti-mDectin-1 (2A11; 10 µg/ml) e incubate per 50 min a 4 °C e successivamente lavato con FACS di lavaggio (PBS, 05% BSA, 10 mm NaN3, e 5 mm EDTA), per rimuovere unbound anticorpo. Un anticorpo anti-topo di pecora cross-linking (Jackson; 5 µg/ml) è stato aggiunto e le cellule incubate per 30 min a 4 °C. Dopo il lavaggio nel mezzo di coltura per rimuovere unbound anticorpo secondario e azide, le cellule sono state incubate nel terreno di coltura per i tempi indicati sia a 37 o a 4 °C. le Cellule sono state poi colorate con streptavidina-PE (BD Pharmingen), ed esaminato per la restante espressione dei recettori superficiali mediante citometria a flusso, come descritto sopra.
Per la microscopia, le cellule sono state placcate a 2 × 105/pozzetto su copri vetro in piastre a 6 pozzetti il giorno prima dell’esperimento. Le cellule sono state trattate come per il test basato su FACS, solo colorate con 9A11 per 1 ora a 4 ° C e successivamente lavate con FACS wash per rimuovere l’anticorpo non legato. Le cellule sono state incubate per 30 min a 37 °C o 4 °C nel mezzo di coltura. Dopo l’incubazione, le cellule sono state fissate in 1 ml di Fissativo (4% paraformaldeide; 250 mm HEPES in dH2O) per 20 min. I gruppi aldeidici sono stati estinti con PBS-glicina (polvere di glicina da 25 mm in PBS) per 10 min e quindi permeabilizzati con 0,5% Triton X-100 per 20 min. Le cellule sono state lavate con lo 0,1% di PBS-Tween e successivamente bloccate con lo 0,5% di saponina per 20 min. Le cellule sono state macchiate con LAMP-1 (clone ID4B; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City) per 1 h a temperatura ambiente e lavate con 0.1% PBS-Tween. Le cellule sono state poi macchiate con asino anti-topo Cy3 e asino anti-ratto Alexa488 (diluizione 1:100; entrambi da Jackson) per 50 min a temperatura ambiente e successivamente lavate con 0,1% PBS-Tween. I coverslips sono stati montati con Vectashield (Vector Laboratories) ed esaminati mediante microscopia a fluorescenza convenzionale su uno Zeiss Axiovert 40. Le immagini sono state elaborate utilizzando Adobe Photoshop versione 6.0.
Zymosan Binding and Citochine Assays—RAW264.7 and NIH3T3 transfectants were plated at 5 × 104 cells/well in 24-well plates the day before the experiment. Le cellule sono state lavate, β-glucani solubili (glucano fosfato; un dono gentile da David Williams, ETSU; 5 µg/ml) aggiunto se del caso, e le cellule incubate per 20 min a 4 °C per consentire l’inibizione della Dectin-1 CRD (18). Dopo l’aggiunta di zymosan marcato con FITC (Invitrogen; 25 particelle/cellula), le cellule sono state incubate a 4 °C per 60 min per consentire il legame e poi lavate estesamente per rimuovere le particelle non legate. Per la determinazione del TNF, le cellule RAW264.7 sono state incubate per altre 3 h e la quantità di TNF rilasciata nei supernatanti è stata determinata mediante ELISA (BD Biosciences). Per misurare il legame con zymosan, le cellule sono state lisate in 3% Triton X-100 (Sigma) e la quantità di zymosan legato è stata quantificata mediante fluorometria utilizzando un Titertek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.).
Per l’analisi delle cellule B Syk-sufficienti e Syk-carenti, le cellule trasdotte 2 × 106 sono state stimolate con zymosan non etichettato (Sigma; 1 particella per cellula) in piastre di sospensione a 24 pozzetti per 24 h a 37 °C. IL-2 secreto nei supernatanti è stato quantificato da ELISA (BD Biosciences). Dove indicato, piceatennol (Sigma) è stato incluso a 50 µm.
Analisi di fagocitosi—Per quantificare la fagocitosi mediante citometria a flusso, i fibroblasti NIH3T3 trasdotti o i macrofagi RAW264.7 sono stati seminati a 2 × 105cellule/pozzetto in piastre a 6 pozzetti il giorno prima dell’esperimento. Quando necessario, le cellule sono state pretrattate con 5 µm di citocalasina D (Calbiochem) per 40 min a 37 °C, per inibire la fagocitosi e sono state mantenute per tutto il test. Le cellule sono state quindi lavate e zymosan marcato FITC è stato aggiunto (1 particella / cellula) e lasciato legare per 1 h a 4 °C. Dopo questa incubazione, zymosan non legato è stato rimosso mediante lavaggio e le cellule incubate a 37°C per 2 h (cellule NIH3T3) o 30 min (cellule RAW264.7) per consentire l’assorbimento delle particelle. La quantità di zymosan interiorizzato è stata quindi determinata dalla citometria a flusso, come descritto in precedenza (19). In breve, lo zymosan esterno è stato macchiato con anti-zymosan policlonale di coniglio (Invitrogen), che è stato successivamente rilevato con anticorpi anti-coniglio di capra marcati con APC (Invitrogen). L’analisi citometrica di flusso è stata eseguita gating sulle popolazioni di cellule FITC-positive, che avevano legato zymosan, e la percentuale di internalizzazione è stata determinata confrontando le popolazioni di cellule APC-negative (particelle internalizzate) rispetto alle popolazioni di cellule APC-positive (particelle non internalizzate).
L’esame di fagocitosi da immunofluoresence microscopia è stata eseguita in modo simile, tranne che le cellule trasdotte sono state seminate in 3 × 104 cellule/pozzetto in lamelle di vetro, 10 particelle per ogni cella di FITC-etichetta zymosan sono stati aggiunti, e le cellule permesso di interiorizzare le particelle per 45 min a 37 °C. dopo questa incubazione, le cellule sono state lavate, fissate con paraformaldeide 4%, e permeabilized 0,25% in Saponine in FACS blocco per 30 min a temperatura ambiente. Actina è stato macchiato con 1 µm tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC)-marcato falloidina (Sigma). I coverslips sono stati montati con Vectashield (Vector Laboratories) ed esaminati mediante microscopia a fluorescenza convenzionale su uno Zeiss Axiovert 40. Le immagini sono state elaborate utilizzando Adobe Photoshop versione 6.0.
Immunoprecipitazioni-1 × 107 cellule RAW264.7 sono state stimolate con pervanadato per 1 min a 37 °C e le cellule sono state lisate in tampone di lisi ghiacciato (25 mm Tris, pH 8,0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1,1% Nonidet P-40, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) con inibitori della proteasi (Roche Applied Science). Nuclei e detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione e i supernatanti recuperati sono stati aggiunti a perle di streptavidina (Sigma), precoppiati con peptidi fosforilati o non fosforilati biotinilati (25 µm). I peptidi CLEC9A sono stati generati commercialmente (Sigma) e corrispondevano alla seguente regione della coda citoplasmatica del recettore, 1MHEEEIYRSLQWD13. I peptidi Dectin-1 sono stati descritti in precedenza (11). Le perle sono state ruotate per 2 h a 4 °C e poi lavate, prima dell’analisi con Western blotting. Le proteine negli immunoprecipitati sono state rilevate con anti-fosfotirosina (clone 4G10) e anti-Syk o anti-Lyn (Santa Cruz Biotechnology), seguiti da appropriati anticorpi secondari collegati alla perossidasi di rafano (Jackson).