tulokset ja keskustelu
DNA-vaurion signalointia koskeneessa tutkimuksessamme (32, 33) havaitsimme chk1-immunobloteissa kaksi näkyvää vyöhykettä: Chk1-taajuusalue 56 kDa: ssa ja nopeammin siirtyvä 43 kDa: n taajuusalue. Nopeammin siirtyvä kaista havaittiin chk1-vasta-aineilla, jotka olivat reaktiivisia sisäiselle kinaasi-domeenille tai C-terminaaliselle sekvenssille, mutta ei N-terminaalin tunnistavilla Chk1-vasta-aineilla (Kuva. 1 A). Tätä yhtyettä ei tunnistettu Santa Cruzin biotekniikan g4-monoklonaalisesta vasta-aineesta, jota käytetään yleisesti chk1: n (24, 29) immunoblotianalyysiin. Knockdown of chk1 via siRNA johti sekä Chk1: n että 43-kDa: n katoamiseen, mikä vahvisti entisestään niiden merkitystä (Kuva. 1b). Proteasomi ja proteaasinestäjät eivät vaikuttaneet 43-kDa: n proteiiniin (SI-liite, Kuva. 1), nostamalla mahdollisuutta, että se voisi olla vaihtoehtoinen liitos muunnos Chk1. National Center for Biotechnology Information database listaa tällä hetkellä kolme vaihtoehtoisesti yhdistettyä ihmisen Chk1-mrnaa, joilla on vaihtelevia kääntämättömiä alueita, mutta jotka koodaavat samaa 476 aminohaposta koostuvaa täyspitkää Chk1-proteiinia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). Analyysimme, jossa käytettiin EST-pohjaista vaihtoehtoista liitosennustetietokantaa (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene), esitti kuitenkin mahdollisuuden chk1: n ainutlaatuiseen liitosvarianttiin, jossa ekson 3 vaihtoehtoisesti liitetään tai poistetaan. Suoraan testata tätä mahdollisuutta, suoritimme RT-PCR käyttäen alukkeet sisällä Chk1 koodaus sekvenssi (Kuva. 1C). RT-PCR käyttäen primer set P1, jossa forward primer oli suunniteltu sisällä exon 3, tuotti yhden amplikonin odotetun koon, kun taas RT-PCR kanssa P2 tai P3 primer set (molemmat perustuvat sekvenssit reunustavat exon 3) tuotti kaksi amplikonia, joista toinen oli odotettu koko Chk1 ja toinen ∼200 bp lyhyempi (Kuva. 1C). Sekvensointi vahvisti, että pidempi amplikoni oli todellakin Chk1 ja varsinkin lyhyempi amplikoni oli chk1: n vaihtoehtoinen liitosvariantti, josta puuttui exon 3 (kuva. 1D ja SI lisäys, Kuva. 2 A). Tämän liitosvariantin ennustettiin muuttuvan Chk1: n n-terminaalisesti katkaistuksi muodoksi, joka koostuu 382 aminohaposta, joille annoimme nimen Chk1-short eli Chk1-s (kuva. 1D ja SI lisäys, Kuva. 2). Geelielektroforeesissa in vitro translated Chk1-s vaelsi samalla tavalla kuin HEK293-solujen 43-kDa-proteiini (Kuva. 1 E). Immunopresipitoimme edelleen 43-kDa-proteiinia hek293-solulysaatista massaspektrometriaa varten ja varmistimme sen identiteetin Chk1-S: ksi. N-terminaalinen katkaisu Chk1-S: ssä on yhdenmukainen immunoblottitulosten kanssa, jotka osoittavat, että sitä eivät tunnistaneet vasta-aineet, jotka reagoivat Chk1: n n-terminaaliseen sekvenssiin (Kuva. 1 A). Reaaliaikainen ja RT-PCR-analyysi havaitsivat chk1-s mRNA-ilmentymän useissa ihmiskudoksissa, ja ilmentymä on yleensä korkeampi sikiön kudoksissa (SI-lisäys, Kuva. 3 A ja D). Immunoblottianalyysissä havaittiin edelleen Chk1-s-proteiinin ilmentymistä ihmisen, hiiren ja rotan solulinjoissa sekä myös ihmisen sikiökudoksissa (si-liite, Kuva. 3B) ja hiiren primaariset munuaistubulussolut (SI liite, Kuva. 3C). Chk1-s: n täyspitkä cDNA kloonattiin myös kolmesta normaalista ihmiskudoksesta (kateenkorva, paksusuoli, sikiön maksa) ja sekvensoitiin vahvistamaan, että se koodaa chk1: n n-terminaalisesti katkaistua liitosvarianttia. Yhdessä nämä kokeet ovat tunnistaneet ainutlaatuisen liitosvariantin Chk1: stä, joka on n-terminaalisesti katkaistu ja laajalti ilmaistu nisäkkäiden soluissa ja kudoksissa.
chk1-S: n tunnistaminen chk1: n ainutlaatuiseksi, n-terminaalisesti katkaistuksi liitosmuunnokseksi. A) hek293-solulysaatti analysoitiin immunoblottauksella käyttäen vasta-aineita, jotka tunnistivat erityisesti N-Terminuksen (α-Chk1-NT), kinaasidomeenin (α-Chk1-KD) tai Chk1: n C-Terminuksen (α-Chk1-CT). Chk1: n lisäksi 43-kDa-proteiinia paljastivat α-Chk1-KD ja α-Chk1-CT, mutta ei α-Chk1-NT. B) HEK293-solut transfektoitiin chk1 siRNA: lla (siChk1) tai kokkelisarjalla (siCon) 48 tunnin ajan kokosolulysaatin keräämiseksi immunoblottianalyysiä varten α-Chk1-KD: n avulla. siChk1 vähensi sekä Chk1: n että 43-kDa: n proteiinin ilmentymistä. (C) RNA eristettiin HEK293-soluista RT-PCR: ää varten käyttäen kolmea eri sarjaa chk1: n alukkeita: P1, P2 ja P3 (suhteellinen sekvenssin sijainti on esitetty kaaviossa). RT-PCR havaitsi kaksi amplikonia käyttämällä Exon 3: a (P2 ja P3) reunustavia primer-sarjoja, kun taas vain yksi amplikoni monistettiin käyttäen primer-sarjaa P1, josta eteenpäin oleva primer oli chk1: n ekson 3: ssa. D) Kaavamainen esitys Chk1: n vaihtoehtoisesta liitoksesta, joka johtaa n-terminaalisesti katkaistuun proteiiniin Chk1-S. (E) Chk1-s kloonattiin in vitro-translaatiota varten, ja käännetty proteiini yhdessä hek293-solulysaatin kanssa analysoitiin immunoblottianalyysillä. In vitro käännetty Chk1 vaelsi samalla tavalla 43-kDa bändi HEK293 soluissa.
mikä on tehtävä Chk1-s? Sääteleekö se solusyklin tarkistuspisteitä, kuten Chk1: tä? Näiden kysymysten avulla selvitimme ensin chk1-S: n ajalliset ja spatiaaliset ilmentymäkuviot solusyklissä. HEK293-solut synkronoitiin G1 -, G1/s-tai G2/M-vaiheissa seerumin nälkiintymisen, kaksinkertaisen tymidiinilohkon tai nokodatsolin avulla. Chk1-s oli alhainen G1-vaiheen soluissa ja korkeampi G1/s-ja G2/M-soluissa (SI-lisäys, Kuva. 4 A ja B). Lisäksi, kun solut synkronoitiin G1 / s-vaiheessa kaksinkertaisella tymidiinilohkolla ja sitten vapautettiin, sekä Chk1 että Chk1-S ekspressio lisääntyi S-vaiheeseen siirtymisen jälkeen (Fig. 2 A). Selvä ero Chk1: n ja Chk1-S: n lausekkeen välillä oli se, että siinä missä Chk1: n lauseke oli korkeimmillaan s-vaiheen puolivälissä, Chk1-s-lauseke kasvoi jatkuvasti S-vaiheesta M-vaiheeseen (Fig. 2 A). Mielenkiintoista on, että korkeat chk1-s-pitoisuudet havaittiin 7 tunnin kuluttua solusyklin vapautumisesta kaksinkertaisesta tymidiinilohkosta, aikapiste, jolloin solut eivät vielä olleet mitoottisia (SI-lisäys, Kuva. 4c). Lisäksi määritimme chk1-s: Chk1-suhteen asynkronisissa ja S-tai G2/M-synkronoiduissa soluissa. Huolimatta chk1-s:n ilmentymisen vaihteluista hek293: ssa, U2OS: ssa ja primäärisissä munuaistubulussoluissa, chk1-s: Chk1-suhde oli yli 1 kaikissa soluissa G2/M-vaiheessa (SI liite, Kuva. 5). Asynkronisissa soluissa Chk1-s ja Chk1 sijaitsivat pääasiassa tumassa (SI-liite, Kuva. 6 A). Kuitenkin G2 / M-vaiheen soluissa osa chk1-S: stä ja Chk1: stä kertyi sentrosomeihin (SI-liite, Kuva. 6 B ja C). Chk1: n lokalisointi centrosomeissa on kriittistä sen G2/M-tarkastuspistetoiminnon kannalta, jossa se estää Cdk1: n ennenaikaisen aktivoitumisen ja mitoottisen sisäänpääsyn (34, 35). Tuloksemme osoittavat, että Chk1 – S voi myös paikallistaa centrosomeihin, mikä tarjoaa chk1: n spatiaalisen ja ajallisen säätelyn mitoottisen sisääntulon aloittamiseksi. Seuraavaksi määritimme Chk1-tai Chk1-s-yliekspression vaikutukset HEK293-ja U2OS-soluissa. Verrattuna GFP-Chk1: een GFP-Chk1-s indusoi erottuvan ydinfenotyypin, jolle oli ominaista ydinkondensaatio ja mikrotumien sekä moniytimien tai monilohkoisten ytimien muodostuminen (Kuva. 2b). Aiemmissa ajankohdissa transfektoituneissa soluissa esiintyi ydinkromatiinin tiivistymistä, jota leimasi heikko ja pisteellinen Histoni – H3-fosforylaatio (Kuva. 2B), mikä viittaa ennenaikaiseen mitoottiseen sisääntuloon. Myöhemmin näistä soluista kehittyi mikrotumat eli monilokeroiset ytimet, mitoottisen katastrofin ominaisuudet (Kuva. 2b). Solulaskenta osoitti, että GFP-Chk1-s indusoi ydinfenotyypin ∼20%: ssa U2OS-soluista (Kuva. 2C). Samanlaisia vaikutuksia osoittivat YFP-Chk1-s ja Chk1-s-Myc (Kuva. 2C), mikä osoittaa, että havaittu ydinfenotyyppi indusoitui Chk1-S: stä eikä fuusioproteiinitageista. Sen sijaan ennenaikaista mitoottista tuloa ei indusoinut Chk1 tai sen kinaasikuollut mutantti Chk1-KD (Kuva. 2C). Chk1-s indusoi huomiota herättävää ydinfenotyyppiä myös muissa solutyypeissä (SI-liite, Kuva. 7). Samankaltainen ydinfenotyyppi raportoitiin soluissa ja hiirimalleissa, joista puuttui yksi tai molemmat Chk1-alleelit (7, 36, 37), mikä viittaa siihen, että Chk1-s saattaa toimia chk1: n endogeenisena estäjänä. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi tuotimme TET-on U2OS-solulinjoja, jotka voidaan indusoida ilmaisemaan Chk1, Chk1-KD tai Chk1-S. solut synkronoitiin G1/s-vaiheessa kaksinkertaisella tymidiinilohkolla, jonka indusoi doksisykliini, ja vapautettiin sitten nokodatsolia sisältävään väliaineeseen. Noin 80% Chk1-s-ilmentävistä soluista tuli mitoosiin , kun taas ∼60% Chk1 – tai Chk1-KD-ilmentävistä soluista tuli (kuva. 2D). Tärkeää on, että kun useimmissa Chk1 – ja Chk1-KD-ilmentyvien ryhmien mitoottisoluissa oli 4n DNA: ta, ∼25%: lla Chk1-S-ilmentävien ryhmien mitoottisoluista oli alle 4n DNA-pitoisuus (Kuva. 2D), joka osoittaa poikkeavaa mitoottista pääsyä näihin soluihin ilman DNA: n replikaatiota. Lisäksi chk1-s-yliekspressio johti aikaisempaan mitoosiin, kuten pH3-positiivisten solujen ilmaantuminen osoittaa (SI-lisäys, Kuva. 8). Chk1 on solusyklin mitoottisen sisäänpääsyn tai S-to-G2/M-siirtymän keskeinen säätelijä. Fosforyloimalla CDC25A: ta (joka indusoi sen hajoamista) ja Wee1: tä, Chk1 estää CDK1: n aktivoitumisen ja mitoottisen sisäänpääsyn (5, 15-20). Osoitimme, että doksisykliinin aiheuttama chk1-S: n induktio TET-on-u2os-soluissa johti korkeampiin cdc25a-tasoihin ja alhaisempiin fosfo-CDK1-tasoihin, mikä viittaa siihen, että Chk1-s antagonisoi Chk1: tä indusoimaan mitoottista tuloa (Kuva. 2 E). Erityinen knockdown chk1-S via RNAi ei onnistunut, koska chk1-s sekvenssi sisältyy Chk1 mRNA. Kuitenkin antisense-oligonukleotidi, joka täydentää ainutlaatuista ekson2-ekson4-liitosta chk1-S: ssä, voisi erityisesti vähentää Chk1-s-lauseketta (SI lisäys, Kuva. 9 A). Chk1-s down-säätely vähentää solujen proliferaatiota merkittävästi (SI Appendix, Fig. 2 artikla Mielenkiintoista on, että Chk1-s down-säätely ei merkittävästi muuttanut solusyklin profiilia (SI lisäys, Kuva. 9C). Koska Chk1 toimii useissa solusyklin tarkastuspisteissä (esim.G2/M, Kara, intra-S), Chk1-S voi antagonisoida Chk1: tä helpottamaan solusyklin etenemistä useissa kohdissa. Tämän seurauksena Chk1-s: n inhibitio voi hidastaa solusykliä eri vaiheissa ja johtaa proliferaation estymiseen ilman suuria muutoksia solusyklin jakautumisessa.
solusyklin säätely chk1-S: llä. A) hek293-solut synkronoitiin kaksinkertaisella tymidiinilohkolla ja vapautettiin sitten nokodatsolia sisältävään väliaineeseen. (Vasemmalla) solusyklin profiili analysoidaan propidiumjodidin (PI) värjäyksellä ja FACS-analyysillä. (Oikealla) Chk1: n ja Chk1-s: n Immunoblotianalyysi solulysaatista, joka on kerätty ilmoitettuina ajankohtina tymidiinilohkosta vapautumisen jälkeen. AS, asynkroniset solut (B) U2OS solut transfektoitiin GFP-Chk1 tai GFP-Chk1-s (vihreä), ja sitten kiinnitetty immunofluoresenssi fosfohistoni H3 (punainen) ja ydinvärjäys hoechst33342 (sininen). (Ylempi) Chk1-s, mutta ei Chk1, aiheutti ennenaikaista kromatiinin tiivistymistä ja heikkoa pH3-värjäytymistä (nuolia). (Alempi) myöhäisessä vaiheessa Chk1-S-transfektoidut solut osoittivat mitoottisen katastrofin piirteitä, mukaan lukien mikrotumat ja monilobaattiset ytimet (nuolet). C) u2os-solut transfektoitiin ilmoitetuilla geeneillä, ja solut, joiden ydinfenotyyppi on kromatiinin ennenaikainen tiivistyminen ja mitoottinen katastrofi, laskettiin. Tiedot osoittavat keskiarvon ± SD; *P < 0, 05 vektoriryhmään verrattuna. Tulokset osoittavat, että Chk1-s-yliekspressio johti nimenomaan ydinfenotyyppiin. (D) U2OS-solut transfektoitiin ilmoitetuilla geeneillä, synkronoitiin kaksinkertaisella tymidiinilohkolla ja vapautettiin 7 tunnin ajan. solut vahvistettiin sitten pH3-immunofluoresenssille ja PI-värjäykselle ja analysoitiin FACS: n avulla. Tiedot osoittavat keskiarvon ± SD; *P < 0, 05 vektoriryhmään verrattuna. Tulokset osoittavat, että Chk1-s aiheutti nimenomaan ennenaikaista mitoottista tuloa ilman DNA: n replikaatiota (solut, joiden DNA on <4n). (E) Tet-on U2OS-solut indusoitiin doksisykliinillä tai ilman sitä. Solut synkronoitiin s-vaiheessa kaksinkertaisella tymidiinilohkolla, ja ne vapautuivat 7 tunnin ajaksi. Osoitettujen proteiinien immunoblotianalyysiin kerättiin kokosolulysaattia. Tulokset osoittavat, että indusoitu Chk1-s-ilmentymä johti cdc25a: n lisääntymiseen ja fosfo-CDK1: n vähenemiseen, mikä edesauttoi ennenaikaista mitoottista tuloa.
miten Chk1-s vastustaa Chk1: tä? Oletimme, että Chk1-s voisi olla vuorovaikutuksessa Chk1: n kanssa estääkseen sen kinaasiaktiivisuuden. Johdonmukaisesti FLAG-Chk1-S ilmaistuna HEK293-soluissa koimmunoprepitated endogeenisen Chk1: n kanssa (kuva. 3 A). Lisäksi in vitro käännetty Myc-Chk1 ja Chk1-s koimmunoprecipited (Kuva. 3B), mikä viittaa suoraan Chk1–Chk1-s-yhteisvaikutukseen. Olemme edelleen osoittaneet coimmunoprecipitation Chk1 kanssa N-terminaali domain, mutta ei C-terminaali domain, chk1-S (kuva. 3C), mikä viittaa n-terminaalisen sekvenssin vaatimukseen chk1-S: ssä sen ja Chk1: n välisessä vuorovaikutuksessa. Toiminnallisesti määritimme chk1-S: n vaikutukset Chk1-kinaasiaktiivisuuteen. Chk1-Myc ilmaistiin ja immunopresipitoitiin in vitro-kinaasimääritystä varten puhdistetun Chk1-s: n puuttuessa tai läsnä ollessa, kuten kuvassa esitetään. 3D, Chk1-kinaasiaktiivisuus vaimeni osittain vielä merkittävästi chk1-s: llä, mutta ei lämpödenaturoidulla Chk1-s: llä.sen sijaan Chk1-s ei vähentänyt Chk2-aktiivisuutta, jolla on samanlaiset substraattipreferenssit kuin Chk1: llä. Verrattuna Chk1: een Chk1-S: stä puuttuu osa kinaasidomaanista, mukaan lukien ATP: tä sitova Kohta (Kuva. 1D) ja odotetusti ei osoittanut merkittävää proteiinikinaasiaktiivisuutta (Kuva. 3D). Chk1-S voi myös tukahduttaa n-terminaalisesti merkityn Chk1: n (FLAG-Chk1) kinaasiaktiivisuuden in vitro-kinaasimäärityksessä (SI lisäys, Kuva. 10). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Chk1-s saattaa estää Chk1: tä molekyylien yhteisvaikutuksen kautta. Tuore tutkimus osoitti, että chk1-immunopresipitaattien peseminen tiukemmalla Radio Immuno-Saostumismäärityksellä (RIPA) voi lisätä chk1-kinaasiaktiivisuutta huomattavasti, mikä viittaa siihen, että tukahduttavat tekijät estävät chk1: tä normaalisti (29); tukahduttavien tekijöiden henkilöllisyyttä ei kuitenkaan tunneta. Vahvistimme RIPA-puskuripesun vaikutuksen ja erityisesti osoitimme edelleen, että eksogeenisen Chk1-s: n lisääminen voisi kääntää RIPA-puskuripesun vaikutuksen Chk1-kinaasiaktiivisuuteen (SI liite, Kuva. 11), mikä viittaa siihen, että Chk1-S voi olla yksi chk1: n keskeisistä endogeenisistä tukahduttavista tekijöistä.
Chk1-s vuorovaikuttaa chk1: n kanssa tukahduttaakseen kinaasiaktiivisuutensa. (A) HEK293-solut transfektoitiin FLAG-Chk1-S: llä tai tyhjällä vektorilla lysaatin keräämiseksi immunoprecipitaatiota (IP) varten anti-FLAG-vasta-aineiden avulla. Immunopresipitaatit analysoitiin Chk1: n ja FLAG-Chk1-S: n varalta immunoblottaamalla käyttäen anti-FLAG-ja anti-N terminus Chk1-vasta-aineita. Tulokset osoittavat FLAG-Chk1-S: n ko-IP: n endogeenisen Chk1: n kanssa. (B) Chk1-Myc ja Chk1-s tuotettiin käyttämällä TNT in vitro transkriptio/translation kit (Promega) – pakettia. (Vasemmalla) in vitro tuotettu Chk1-Myc ja chk1-s immunoblottauksella. (Oikealla) Chk1-Myc immunopresipitoitiin anti-Myc-vasta-aineilla sen jälkeen, kun se oli inkuboitu chk1-s: n kanssa tai ilman sitä.immunopresipitaatit analysoitiin chk1-s: n ja Chk1-Myc: n varalta immunoblottaamalla. Tulokset viittaavat Chk1: n ja Chk1-s: n väliseen suoraan vuorovaikutukseen. (C) HEK293-solut transfektoitiin Myc-merkityillä Chk1 – S: llä tai sen C-tai N-terminaalisilla deleetiomutanteilla lysaatin keräämiseksi immunopresipitaatiota varten anti-Myc-vasta-aineiden avulla. Immunopresipitaatteja tutkittiin chk1: n esiintymisen varalta. Tulokset osoittavat chk1: n koimmunoprecipitaation Chk1-S: n ja sen C-terminaalisen deleetiomutantin kanssa, mutta ei sen N-terminaalisen deleetiomutantin kanssa. (D) HEK293-solut transfektoitiin Myc-merkityillä Chk1-S: llä, Chk1: llä tai Chk2: lla lysaatin keräämiseksi immunopresipitaatiota varten anti-Myc-vasta-aineiden avulla. Chk1-s-Myc: tä, Chk1-Myc: tä tai Chk2-Myc: tä sisältäviä immunopresipitaatteja inkuboitiin chk1-S: n kanssa tai ilman sitä 1 tunnin ajan, minkä jälkeen ne lisättiin kinaasiaktiivisuuden määritykseen käyttäen chktide: tä substraattina. Denaturoitu Chk1-s valmistettiin keittämällä. Tiedot osoittavat keskiarvon ± SD; * P < 0, 05 verrattuna Chk1-Myc-ryhmään. Tulokset osoittavat, että native Chk1-S voi erityisesti estää Chk1. (E) HEK293-solut transfektoitiin chk1-Myc-tai Chk1-Myc(S317A/s345a) – mutanteilla. Tämän jälkeen soluja ei käsitelty tai käsiteltiin 100 nM: n kamptotesiinilla 2 tunnin ajan, jotta saatiin kerättyä lysaattia immunopresipitaatiota varten anti-Myc-vasta-aineilla. Immunopresipitaatit analysoitiin MYC-Chk1: lle, fosforyloidulle (seriini 345) chk1: lle ja chk1-s: lle immunoblottaamalla. Myös Chk1: n tulo tarkastettiin näytteissä. Tulokset osoittavat, että chk1-S koimmunopreparoitui tai liittyi Chk1: een normaaleissa soluissa ja että yhteys väheni kamptothesiinin aiheuttaman DNA-vaurion aikana. Chk1-s: n ja Chk1-mutantin(S345A/S317A) välinen assosiaatio ei kuitenkaan häiriintynyt DNA-vaurion aikana, mikä viittaa siihen, että chk1: n fosforylaatio kohdissa S345 ja S317 saattaa olla tarpeen chk1-s: n erottamiseksi Chk1: stä. F) HEK293-solut kokransfektoitiin joko chk1-Myc + tyhjällä vektorilla tai Chk1-Myc + dn-ATR: llä, minkä jälkeen niitä käsiteltiin 100 nM: n kamptotesiinilla 2 tunnin ajan. Solulysaatti kerättiin immunopresipitaatiota varten anti-Myc-vasta-aineilla ja sen jälkeen osoitettujen proteiinien immunoblotianalyysi. Tulokset osoittavat, että kamptotesiinin aiheuttama chk1-Chk1–S-dissosiaation häiriintyminen riippuu ATR-ja Chk1-fosforylaatiosta.
DNA damage responsessa (DDR) Chk1 aktivoituu merkittävästi fosforylaation kautta s345-ja S317-jäämissä (7, 13, 38, 39). Huolimatta s345/s317 fosforylaation merkityksen tunnustamisesta, on edelleen epäselvää, miten tämä fosforylaatio aktivoi Chk1: n (28-30). Osoitimme, että Chk1-s ilmaisu ei muuttunut merkittävästi DDR (SI liite, Kuva. 12). Chk1-Chk1-s-yhteisvaikutus kuitenkin heikkeni DNA: n topoisomeraasi I-inhibiittorin ja DNA: ta vahingoittavan aineen kamptotesiinin indusoimassa DDR: ssä (Fig. 3 E). Erityisesti CHK1: n dissosiaatio CHK1-S: stä DDR: ssä näytti riippuvan chk1-fosforylaatiosta kohdassa S345/s317, koska chk1(S345A/s317a) – mutantti ei dissosioitunut Chk1-S: stä camptothesiinihoidon aikana (Kuva. 3 E). DDR: ssä Chk1-aktivaatio riippuu ATR-välitteisestä fosforylaatiosta (7, 13, 14). Osoitimme, että ATR: n esto dominanttinegatiivisen mutantin (dn-ATR) kautta ei ainoastaan tukahduttanut camptothecinin aiheuttamaa Chk1-s-fosforylaatiota, vaan myös esti Chk1-Chk1–s-dissosiaatiota (Kuva. 3 F). Vastaavasti Chk1 dissosioitui Chk1-S: stä sisplatiinin indusoiman DDR: n aikana, ja DN-ATR esti dissosiaation (SI-liite, Kuva. 13). Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että chk1: n fosforylaatio voi häiritä sen vuorovaikutusta endogeenisen estäjän Chk1-S: n kanssa, mikä johtaa CHK1: n aktivoitumiseen DDR: ssä.
Chk1-S: n tunnistaminen solusyklin etenemisen ja solujen proliferaation ainutlaatuiseksi säätelijäksi sai meidät tutkimaan sen ilmentymistä syöpäkudoksissa. MRNA-tasolla useimmissa syöpäkudoksissa chk1-ja Chk1-s-pitoisuudet olivat normaaleja kudoksia korkeammat (SI-liite, Kuva. 14). Mielenkiintoista, kivesten karsinoomat osoittivat chk1-S: n huomattavaa säätelyä, mutta ei Chk1: tä (Kuva. 4 A). Chk1-S: n spesifistä säätelyä vahvistettiin myös immunoblotianalyysillä kivessyöpäkudoksissa, erityisesti myöhäisvaiheen syöpänäytteissä (Kuva. 4b). Kuten aiemmin on raportoitu (5), sekä normaaleissa että pahanlaatuisissa kiveskudoksissa oli korkea chk1-ilmentymä. Chk1-S: n lisääntynyt ilmentyminen havaittiin myös munasarjasyövän etenemisen aikana (Kuva. 4b). Suhteellisen korkea taso Chk1 ja Chk1-s ilmaisun sekä sikiön (SI liite, Kuva. 3)ja syöpä (Kuva. 4) kudokset viittaavat siihen, että Chk1-S voi nopeuttaa solusyklin etenemistä ja edistää solujen proliferaatiota näissä olosuhteissa.
chk1-s-asetus syövässä. (A) Chk1: n ja Chk1-s: n mRNA-ilmentymän reaaliaikainen PCR-analyysi normaaleissa kiveskudoksissa ja kivessyöpänäytteissä, jotka näkyvät-chk1-s: n säätely kivessyöpäkarsinoomissa. B) Chk1: n ja Chk1-s: n Immunoblotianalyysi ihmisen normaaleissa kives-ja kivessyöpäkudoksissa, jossa näkyy chk1-s: n lisääntynyt ilmentyminen myöhäisvaiheen syöpäkudoksissa. (C) Nakuhiirille ruiskutettiin 10 × 106 Tet-solua MDA-MB-231-soluihin, jotka olivat doksisykliinin indusoitavissa ilmaisemaan Chk1: tä, Chk1-KD: tä tai Chk1-s: ää. Kun kasvain oli määritetty 100 mm3: een, hiiriä pidettiin juomavedessä doksisykliinin kanssa tai ilman sitä. Kasvaimen tilavuus mitattiin viikoittain (neljännen viikon arvot, n = 8). Tiedot osoittavat keskiarvon ± SD. Tulokset osoittavat, että indusoitu ilmentyminen Chk1-S, mutta ei Chk1 tai Chk-KD, estivät kasvaimen kasvua. D) doksisykliinin indusoimien chk1-Myc: n, Chk1-KD-Myc: n ja Chk1-s-Myc: n immunoblottitulosten densitometria poistetuissa kasvaimissa (N = 3 kullekin ryhmälle). Signaalit normalisoitiin chk1-Myc: llä (mielivaltaisesti asetettu 100: ksi). Tiedot osoittavat keskiarvon ± SD. Tulokset osoittavat, että doksisykliini indusoi samanlaisia ilmentymisen chk1-Myc, Chk1-KD-Myc, ja Chk1-s-Myc kasvaimissa. (E) Nakuhiirille ruiskutettiin chk1-s-indusoituvia soluja kasvainten muodostamiseksi, minkä jälkeen niitä pidettiin juomavedessä doksisykliinin kanssa tai ilman sitä 4 wk: n ajan. Kasvainkudoksia kerättiin immunoblotianalyysiä varten. Tulokset osoittavat korkeampi cdc25a ilmentymä kasvain ksenografteissa doksisykliinin indusoima Chk1-s expression.
tutkimme edelleen ektooppisen Chk1-s-ekspression vaikutusta ksenograftin kasvaimen kasvuun hiirillä. Kasvain ksenograftit perustettiin nude hiirillä käyttäen Tet-on MDA-MB-231 rintasyöpä solulinjoja, jotka voidaan indusoida doksisykliini ilmaista Chk1, Chk1-s, tai Chk1-KD. Chk1: n tai Chk1-KD: n induktio doksisykliinillä ei vaikuttanut kasvaimen kasvuun; chk1-s: n induktio johti kuitenkin 40%: n vähenemiseen kasvaimen tilavuudessa (Kuva. 4c). Chk1–S: n indusoimissa kasvainkudoksissa ilmeni myös cdc25a: n kertymistä, mikä viittaa chk1: n inhibitioon (Kuva. 4 E). Vaikka tulokset saattavat viitata ainutlaatuiseen syöpästrategiaan, kohdunulkoisen Chk1-S: n pakotetun yliekspression fysiologinen merkitys on edelleen epäselvä. Nämä tulokset kuitenkin todistavat periaatteesta, että chk1–Chk1-s-tasapainon kallistuminen voi johtaa mitoottiseen katastrofiin ja solujen proliferaation vähenemiseen.
havainto, että Chk1-S: n yli-ilmentymä vähensi ksenograftin kasvaimen kasvua (Kuva. 4 C-E) vaikutti ristiriitaiselta sen havainnon kanssa, että ihmispotilaiden kasvainnäytteet ilmaisivat suhteellisen korkeita chk1-s-pitoisuuksia solujen proliferaatiossa (Kuva. 4 A ja B ja SI lisäys, Kuva. 14). Jotta nämä tiedot voidaan sovittaa yhteen, on tärkeää tunnistaa erot koeolosuhteiden välillä. Suhteellisen korkea Chk1-s ilmentymä ihmisen kasvaimissa voidaan katsoa johtuvan proliferatiivisten solujen läsnäolosta näissä kudoksissa. Johdonmukaisesti Chk1-s On myös korkea sikiön kudoksissa, jotka ovat erittäin proliferatiivisia (SI liite, Kuva. 3 A). Tärkeää on, että Chk1-s ilmentyminen näissä proliferatiivisissa kudoksissa rajoittuu ajallisesti myöhäiseen S-M-vaiheeseen (Kuva. 2 ja SI lisäys, Kuva. 4). Tällä ajallisella säätelyllä voidaan varmistaa, että Chk1-aktiivisuus estyy sen jälkeen (ja vasta sen jälkeen), kun DNA: n replikaatio S-vaiheessa on saatu päätökseen solusyklin edetessä G2/M-vaiheeseen. Kuitenkin, kun kohdunulkoinen Chk1-s pakotetaan yli-ilmentymään viljellyissä soluissa tai ksenograftin kasvaimissa, chk1-s: n ekspression ajallinen rajoittuminen häiriintyy; toisin sanoen Chk1-s On Korkea koko solusyklin ajan mukaan lukien S-vaihe, mikä johtaa CHK-1: n jatkuvaan estoon ja ennenaikaiseen mitoottiseen sisääntuloon, mikä johtaa mitoottiseen katastrofiin ja solujen proliferaation vähenemiseen.
yhteenvetona voidaan todeta, että tässä tutkimuksessa on havaittu chk1: n liitosvariantti, Chk1-s, joka on chk1: n keskeinen säätelijä normaalissa solusyklissä ja DDR: n aikana (SI-lisäys, Kuva. 15). Häiriintymättömässä solusyklissä Chk1: n ilmentyminen lisääntyy S-vaiheessa ja jotkut Chk1-molekyylit saattavat fosforyloitua ATR: n estäessä Chk1-S: n sitoutumisen, mikä johtaa suureen Chk1-aktiivisuuteen ja S-vaiheen ylläpitoon DNA: n replikaation loppuun saakka. G2-vaiheessa Chk1–s-ilmentymä lisääntyy ja raportoidun (29) mukaan Chk1-fosforylaatio vähenee, mikä edistää Chk1-Chk1-s-yhteisvaikutusta chk1-aktiivisuuden tukahduttamiseksi. Chk1: n aktiivisuuden väheneminen G2/M-vaiheessa on kriittistä mitoottisen tulon kannalta. Olosuhteissa, joissa chk1-s induktio tai yli-ekspressio, liiallinen määrä Chk1-s sekvesteri Chk1 ja vähentää sen kinaasiaktiivisuutta S-vaiheen aikana, mikä johtaa ennenaikaiseen mitoottiseen sisäänmenoon ilman DNA: n replikaatiota, mikä johtaa mitoottiseen katastrofiin. DNA-vaurion aikana Chk1 fosforyloituu, minkä seurauksena chk1-S: n sitoutuminen vähenee, chk1: n aktiivisuus lisääntyy ja G2/M: n pidätys (SI liite, Kuva. 11). Havaintomme tukevat chk1-aktivoinnin” de-repression ” mekanismia (29). Tärkeää on, että Chk1-s näyttää olevan yksi chk1: n toiminnan keskeisistä tukahduttavista tekijöistä. Antagonisoimalla Chk1: tä Chk1-S voi nopeuttaa solusykliä, mikä johtaa lisääntyneeseen lisääntymiseen sikiön ja syöpäkudoksissa. Suuret chk1-tasot jakautuvissa soluissa koordinoivat S-vaihetta ja mitoosia, kun taas korkeat chk1-s-tasot voivat tarjota voimakkaan Kytkimen S-to-G2/M-vaihesiirtymälle. Sen sijaan chk1-S: n pakotettu yliekspressio liiallisilla tasoilla, chk1: n epätasapainossa, aiheuttaa ennenaikaista mitoottista sisäänpääsyä ja solukuolemaa (Kuva. 2)ja tukahduttaa kasvaimen kasvua kasvaimen xenograftimalleissa (Kuva. 4). Chk1: n on ehdotettu olevan tehokas terapeuttinen kohde syöpähoidossa, ja Chk1: n estäjiä arvioidaan kliinisissä tutkimuksissa (40-43). Chk1-S: n tunnistaminen endogeeniseksi chk1: n estäjäksi voi avata uusia tutkimusalueita solusyklin säätelyssä, DNA-vauriovasteessa ja syöpähoidossa.