Resultados y discusión
Durante nuestro estudio de señalización de daño del ADN (32, 33), observamos dos bandas prominentes en inmunoblots Chk1: la banda Chk1 a 56 kDa y una banda de migración más rápida de 43 kDa. La banda de migración más rápida fue detectada por anticuerpos Chk1 que eran reactivos al dominio quinasa interno o a la secuencia C-terminal, pero no por anticuerpos Chk1 que reconocían el terminal N (Fig. 1A). Esta banda no fue reconocida por el anticuerpo monoclonal G4 de Santa Cruz Biotechnology que se usa comúnmente para el análisis inmunoblot de Chk1 (24, 29). El derribo de Chk1 a través de siRNA llevó a la desaparición tanto de Chk1 como de la banda de 43 kDa, confirmando aún más su relevancia (Fig. 1B). La proteína de 43 kDa no se vio afectada por los inhibidores de proteasomas y proteasas (Apéndice SI, Fig. 1), planteando la posibilidad de que pudiera ser una variante de empalme alternativa de Chk1. La base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica actualmente enumera tres ARNm Chk1 humanos que tienen regiones no traducidas variables, pero codifican la misma proteína Chk1 de longitud completa de 476 aminoácidos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). Sin embargo, nuestro análisis utilizando una base de datos predictiva de empalme alternativa basada en EST (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) sugirió la posibilidad de una variante de empalme única de Chk1 en la que el exón 3 se empalma o elimina alternativamente. Para probar directamente esta posibilidad, realizamos RT-PCR utilizando cebadores dentro de la secuencia de codificación Chk1 (Fig. 1C). RT-PCR usando el conjunto de imprimación P1, en el que el primer delantero fue diseñado dentro del exón 3, generó un solo amplicón del tamaño esperado, mientras que RT-PCR con el conjunto de imprimación P2 o P3 (ambos basados en secuencias que flanquean el exón 3) generó dos amplicones, uno con el tamaño esperado de Chk1 y el otro 2 200 pb más corto (Fig. 1C). La secuenciación confirmó que el amplicón más largo era de hecho Chk1 y, notablemente, el amplicón más corto era una variante de empalme alternativa de Chk1 que carecía del exón 3 (Fig. Apéndice 1D y SI, Fig. 2A). Se predijo que esta variante de empalme se tradujera en una forma truncada N-terminal de Chk1 que consta de 382 aminoácidos que denominamos Chk1-short o Chk1-S (Fig. Apéndice 1D y SI, Fig. 2). En la electroforesis en gel, la Chk1-S traducida in vitro migró de forma similar a la proteína de 43 kDa de las células HEK293 (Fig. 1E). Además, inmunoprecipitamos la proteína de 43 kDa del lisado de células HEK293 para espectrometría de masas y confirmamos su identidad como Chk1-S. El truncamiento N-terminal en Chk1-S es consistente con los resultados inmunoblot que muestran que no fue reconocido por los anticuerpos reactivos a la secuencia N-terminal de Chk1 (Fig. 1A). El análisis en tiempo real y RT-PCR detectó la expresión de ARNm de Chk1-S en múltiples tejidos humanos, y la expresión es generalmente más alta en los tejidos fetales (Apéndice SI, Fig. 3 A y D). El análisis de inmunoblots detectó además la expresión de la proteína Chk1-S en líneas celulares humanas, de ratón y de rata, y también en tejidos fetales humanos (Apéndice SI, Fig. 3B) y células tubulares renales primarias de ratón (Apéndice SI, Fig. 3C). El ADNc de longitud completa de Chk1-S también se clonó a partir de tres tejidos humanos normales (timo, colon, hígado fetal) y se secuenció para confirmar que codifica una variante de empalme truncado N-terminal de Chk1. Juntos, estos experimentos han identificado una variante única de empalme de Chk1 que está truncada N-terminal y ampliamente expresada en células y tejidos de mamíferos.
Identificación de Chk1-S como una variante de empalme truncado N-terminal única de Chk1. A) El lisado de células HEK293 se analizó mediante inmunoblot con anticuerpos que reconocían específicamente el extremo N (α-Chk1-NT), el dominio de la quinasa (α-Chk1-KD) o el extremo C de Chk1 (α-Chk1-CT). Además de Chk1, una proteína de 43 kDa fue revelada por α-Chk1-KD y α-Chk1-CT, pero no α-Chk1-NT. B) Se transfectaron células HEK293 con siRNA Chk1 (siChk1) o una secuencia codificada (siCon) durante 48 horas para recoger lisado de células enteras para el análisis de inmunoblots utilizando α-Chk1-KD. siChk1 disminuyó la expresión de Chk1 y de la proteína de 43 kDa. (C) El ARN se aisló de células HEK293 para RT-PCR utilizando tres conjuntos diferentes de cebadores para Chk1: P1, P2 y P3 (las ubicaciones de la secuencia relativa se muestran en el diagrama). Se detectaron dos amplicones por RT-PCR utilizando los conjuntos de cebadores que flanqueaban el exón 3 (P2 y P3), mientras que solo un amplicón se amplificó utilizando el conjunto de cebadores P1, de los cuales el cebador delantero estaba dentro del exón 3 de Chk1. (D) Representación esquemática del empalme alternativo de Chk1 que resulta en una proteína truncada N-terminal, Chk1-S. (E) Chk1-S se clonó para traducción in vitro, y la proteína traducida junto con el lisado de células HEK293 se analizaron mediante análisis de inmunoblots. El Chk1 traducido in vitro migró de manera similar a la banda de 43 kDa en las células HEK293.
¿Cuál es la función de Chk1-S? ¿Regula los puntos de control del ciclo celular como Chk1? Con estas preguntas, primero determinamos los patrones de expresión temporal y espacial de Chk1-S en el ciclo celular. Las células HEK293 se sincronizaron en las fases G1, G1 / S o G2 / M por inanición sérica, bloqueo de doble timidina o nocodazol, respectivamente. El Chk1-S fue bajo en células de fase G1 y mayor en células G1/S y G2/M (Apéndice SI, Fig. 4 A y B). Además, cuando las células se sincronizaron en la fase G1/S mediante un bloqueo doble de timidina y luego se liberaron, la expresión de Chk1 y Chk1-S aumentó después de entrar en la fase S (Fig. 2A). Una diferencia distintiva entre la expresión de Chk1 y Chk1-S fue que mientras que la expresión de Chk1 alcanzó su punto máximo en la fase S media, la expresión de Chk1-S siguió aumentando de la fase S a la M (Fig. 2A). Curiosamente, se observaron niveles altos de expresión de Chk1-S a las 7 h después de la liberación del ciclo celular del bloqueo de doble timidina, un punto de tiempo en el que las células aún no estaban mitóticas (Apéndice SI, Fig. 4C). Además, cuantificamos la relación Chk1-S:Chk1 en celdas asíncronas y sincronizadas S o G2 / M. A pesar de las variaciones de la expresión de Chk1-S en HEK293, U2OS y células tubulares renales primarias, la relación Chk1-S:Chk1 fue superior a 1 en todas las células en la fase G2/M (Apéndice SI, Fig. 5). En células asíncronas, Chk1-S y Chk1 se localizaron principalmente en el núcleo (Apéndice SI, Fig. 6A). Sin embargo, en las células de fase G2/M, algunos Chk1-S y Chk1 se acumularon en los centrosomas (Apéndice SI, Fig. 6 B y C). La localización de Chk1 en los centrosomas es crítica para su función de punto de control G2/M, donde previene la activación prematura de Cdk1 y la entrada mitótica (34, 35). Nuestros resultados indican que el Chk1-S también puede localizarse a los centrosomas, proporcionando una regulación espacial y temporal del Chk1 para iniciar la entrada mitótica. A continuación, determinamos los efectos de la sobreexpresión de Chk1 o Chk1-S en células HEK293 y U2OS. En comparación con GFP-Chk1, GFP-Chk1-S indujo un fenotipo nuclear distinguido que se caracterizó por condensación nuclear y formación de micronúcleos y núcleos múltiples o multilobulados (Fig. 2B). En momentos anteriores, las células transfectadas mostraron condensación nuclear / cromatina marcada por fosforilación de histona-H3 débil y puntiaguda (Fig. 2B), indicativo de entrada mitótica prematura. Posteriormente, estas células desarrollaron micronúcleos o núcleos multilobulados, características de catástrofe mitótica (Fig. 2B). El recuento celular mostró que el GFP-Chk1-S indujo el fenotipo nuclear en el 20% de las células U2OS (Fig. 2C). Se observaron efectos similares con YFP-Chk1-S y Chk1-S-Myc (Fig. 2C), indicando que el fenotipo nuclear observado fue inducido por Chk1-S y no por las etiquetas de proteína de fusión. Por el contrario, la entrada mitótica prematura no fue inducida por Chk1 o su mutante muerto por quinasa Chk1-KD (Fig. 2C). Chk1-S también indujo el sorprendente fenotipo nuclear en otros tipos celulares (Apéndice SI, Fig. 7). En particular, se notificó un fenotipo nuclear similar en células y modelos murinos que carecían de uno o ambos alelos Chk1 (7, 36, 37), lo que sugiere que el Chk1-S puede actuar como un inhibidor endógeno del Chk1. Para probar aún más esta posibilidad, generamos líneas celulares Tet-on U2OS que pueden inducirse para expresar Chk1, Chk1-KD o Chk1-S. Las células se sincronizaron en la fase G1/S mediante un bloqueo doble de timidina, inducidas por doxiciclina, y luego se liberaron en un medio que contenía nocodazol. Aproximadamente el 80% de las células que expresan Chk1-S entraron en mitosis , mientras que did el 60% de las células que expresan Chk1 o Chk1-KD lo hicieron (Fig. 2D). Es importante destacar que, mientras que la mayoría de las células mitóticas de los grupos que expresan Chk1 y Chk1 – KD tenían ADN 4n, 2 el 25% de las células mitóticas del grupo que expresa Chk1-S tenían menos contenido de ADN 4n (Fig. 2D), indicativo de entrada mitótica aberrante en estas células sin completar la replicación del ADN. Además, la sobreexpresión de Chk1-S dio lugar a una entrada más temprana en la mitosis, como lo indica la aparición de células con pH3 positivo (Apéndice SI, Fig. 8). Chk1 es un regulador clave de la entrada mitótica o de la transición de S a G2/M en el ciclo celular. Al fosforilar CDC25A (induciendo su degradación) y Wee1, Chk1 previene la activación de CDK1 y la entrada mitótica (5, 15-20). Mostramos que la inducción de Chk1-S por doxiciclina en las células U2OS de Tet-on dio lugar a niveles más altos de CDC25A y niveles más bajos de FOSFOCDK1, lo que sugiere que Chk1-S antagonizó a Chk1 para inducir la entrada mitótica (Fig. 2E). El derribo específico de Chk1-S a través del ARNi no tuvo éxito porque la secuencia Chk1-S está contenida en el ARNm Chk1. Sin embargo, un oligonucleótido antisentido complementario a la unión exón2–exón4 única en Chk1-S podría reducir específicamente la expresión de Chk1-S (Apéndice SI, Fig. 9A). La regulación descendente de Chk1-S redujo notablemente la proliferación celular (Apéndice SI, Fig. 9B). Curiosamente, la regulación descendente de Chk1-S no cambió significativamente el perfil del ciclo celular (Apéndice SI, Fig. 9C). Debido a que Chk1 funciona en varios puntos de control del ciclo celular (por ejemplo, G2 / M, huso, intra-S), Chk1-S puede antagonizar a Chk1 para facilitar la progresión del ciclo celular en múltiples sitios. Como resultado, la inhibición de Chk1-S puede ralentizar el ciclo celular en varias fases y dar lugar a la supresión de la proliferación sin cambios importantes en la distribución del ciclo celular.
Regulación del ciclo celular por Chk1-S. A) Las células HEK293 se sincronizaron mediante un doble bloqueo de timidina y luego se liberaron en un medio que contenía nocodazol. (Izquierda) Perfil del ciclo celular analizado por tinción de yoduro de propidio (IP) y análisis de FACS. (Derecha) Análisis inmunoblot de Chk1 y Chk1-S en el lisado celular recogido en los momentos indicados después de la liberación del bloqueo de timidina. Las células asíncronas (B) U2OS se transfectaron con GFP-Chk1 o GFP-Chk1-S (verde), y luego se fijaron para inmunofluorescencia de fosfohistona H3 (rojo) y tinción nuclear con Hoechst33342 (azul). (Superior) Chk1-S, pero no Chk1, indujo condensación prematura de cromatina y tinción débil de pH3 (flechas). (Inferior) En una etapa tardía, las células transfectadas con Chk1-S mostraron las características de la catástrofe mitótica, incluidos los micronúcleos y los núcleos multilobulados (flechas). C) Se transfectaron células U2OS con los genes indicados y se contabilizaron células con el fenotipo nuclear de condensación prematura de cromatina y catástrofe mitótica. Los datos indican media ± DE; * P < 0,05 versus grupo vectorial. Los resultados muestran que la sobreexpresión de Chk1-S condujo específicamente al fenotipo nuclear. D) Las células U2OS se transfectaron con los genes indicados, se sincronizaron mediante doble bloqueo de timidina y se liberaron durante 7 h. Las células se fijaron para inmunofluorescencia de pH3 y tinción de PI y se analizaron mediante FACS. Los datos indican media ± DE; * P < 0,05 versus grupo vectorial. Los resultados muestran que el Chk1-S indujo específicamente la entrada mitótica prematura sin completar la replicación del ADN (células con <4n de ADN). E) Se indujeron células U2OS Tet-on con o sin doxiciclina. Las células se sincronizaron en la fase S mediante doble bloqueo de timidina y se liberaron durante 7 h. Se recolectó lisado de células enteras para el análisis inmunoblot de las proteínas indicadas. Los resultados muestran que la expresión inducida de Chk1-S condujo a un aumento de CDC25A y una disminución de FOSFOCDK1, contribuyendo a la entrada mitótica prematura.
¿Cómo antagoniza el Chk1-S con el Chk1? Planteamos la hipótesis de que Chk1-S podría interactuar con Chk1 para bloquear su actividad quinasa. Consistentemente, FLAG-Chk1-S expresado en células HEK293 coinmunoprecipitado con Chk1 endógeno (Fig. 3A). Además, se tradujo in vitro Myc-Chk1 y Chk1-S coinmunoprecipitado (Fig. 3B), sugiriendo una interacción directa Chk1-Chk1-S. Además, demostramos la coinmunoprecipitación de Chk1 con el dominio N-terminal, pero no el dominio C-terminal, de Chk1-S (Fig. 3C), sugiriendo el requisito de la secuencia N-terminal en Chk1-S para su interacción con Chk1. Funcionalmente, determinamos los efectos de Chk1 – S sobre la actividad de la quinasa Chk1. El Chk1-Myc se expresó e inmunoprecipitó para el ensayo de cinasa in vitro en ausencia o presencia de Chk1-S purificado, como se muestra en la Fig. 3D, la actividad de la quinasa Chk1 se suprimió parcialmente pero significativamente por Chk1-S, pero no por Chk1-S desnaturalizado por calor.En contraste, Chk1-S no disminuyó la actividad de Chk2, que tiene preferencias de sustrato similares a Chk1. En comparación con Chk1, Chk1-S carece de parte del dominio quinasa, incluido el sitio de unión a ATP (Fig. 1D) y, como era de esperar, no mostró actividad significativa de la proteína quinasa (Fig. 3D). Chk1 – S también puede suprimir la actividad cinasa de Chk1 marcado N-terminal (FLAG-Chk1) en un ensayo de cinasa in vitro (Apéndice SI, Fig. 10). Estos resultados sugieren que el Chk1 – S puede inhibir el Chk1 a través de la interacción molecular. Un estudio reciente mostró que el lavado de inmunoprecipitados Chk1 con un tampón de Ensayo de Inmunodepresión de Radio (RIPA) más estricto puede aumentar notablemente la actividad de la quinasa Chk1, lo que sugiere que el Chk1 normalmente se inhibe por factores de represión (29); sin embargo, se desconoce la identidad de los factores de represión. Confirmamos el efecto del lavado tampón RIPA y, en particular, mostramos además que la adición de Chk1-S exógenos podría revertir el efecto del lavado tampón RIPA sobre la actividad de la quinasa Chk1 (Apéndice SI, Fig. 11), sugiriendo que el Chk1-S puede ser uno de los principales factores de represión endógena para el Chk1.
Chk1-S interactúa con Chk1 para suprimir su actividad quinasa. A) Se transfectaron células HEK293 con FLAG-Chk1-S o vector vacío para recoger lisado para inmunoprecipitación (IP) utilizando anticuerpos anti-FLAG. Los inmunoprecipitados se analizaron para detectar Chk1 y FLAG-Chk1-S mediante inmunoblot con anticuerpos anti-FLAG y anti-N terminus Chk1, respectivamente. Los resultados muestran la co-IP de FLAG-Chk1 – S con Chk1 endógeno. B) Chk1-Myc y Chk1-S se produjeron utilizando el kit de transcripción/traducción in vitro de TnT (Promega). (Izquierda) Chk1-Myc y Chk1-S producidos in vitro mostrados por inmunoblotting. (Derecha) Chk1-Myc fue inmunoprecipitado usando anticuerpos anti-Myc después de la incubación con o sin Chk1-S. Los inmunoprecipitados se analizaron para detectar Chk1-S y Chk1-Myc mediante inmunoblot. Los resultados indican una interacción directa entre Chk1 y Chk1-S. (C) Las células HEK293 se transfectaron con Chk1-S marcado con Myc o sus mutantes de deleción C o N-terminal para recolectar lisado para inmunoprecipitación utilizando anticuerpos anti – Myc. Se examinaron los inmunoprecipitados para detectar la presencia de Chk1. Los resultados demuestran la coinmunoprecipitación de Chk1 con Chk1-S y su mutante de deleción C-terminal, pero no con su mutante de deleción N-terminal. D) Se transfectaron células HEK293 con Chk1-S, Chk1 o Chk2 marcados con Myc para recoger lisado para inmunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-Myc. Los inmunoprecipitados, que contenían Chk1-S-Myc, Chk1-Myc o Chk2-Myc, se incubaron con o sin Chk1-S durante 1 h y luego se añadieron al ensayo de actividad de la quinasa utilizando Chktide como sustrato. El Chk1-S desnaturalizado se preparaba hirviendo. Los datos indican media ± DE; * P < 0,05 versus grupo Chk1-Myc. Los resultados muestran que el Chk1-S nativo puede inhibir específicamente el Chk1. E) Se transfectaron células HEK293 con mutantes Chk1-Myc o Chk1-Myc(S317A/S345A). Luego, las células no se trataron o se trataron con camptotecina de 100 nM durante 2 horas para recolectar lisado para inmunoprecipitación con anticuerpos anti-Myc. Los inmunoprecipitados se analizaron para Myc-Chk1, Chk1 fosforilado (serina 345) y Chk1-S mediante inmunoblotaje. También se verificó la entrada de Chk1 en las muestras. Los resultados muestran que Chk1-S coinmunoprecipitado o asociado con Chk1 en células normales y que la asociación se redujo durante el daño al ADN inducido por camptotecina. Sin embargo, la asociación entre Chk1-S y el mutante Chk1(S345A/S317A) no se interrumpió durante el daño al ADN, lo que sugiere que la fosforilación de Chk1 en S345 y S317 puede ser necesaria para la disociación de Chk1-S de Chk1. F) Las células HEK293 se cotransfectaron con Chk1-Myc + vector vacío o Chk1-Myc + dn-ATR, seguido de tratamiento con camptotecina de 100 nM durante 2 h. El lisado celular se recolectó para inmunoprecipitación con anticuerpos anti-Myc, seguido de un análisis inmunoblot de las proteínas indicadas. Los resultados muestran que la interrupción inducida por camptotecina de la disociación de Chk1–Chk1-S depende de la fosforilación ATR y Chk1.
En la respuesta al daño del ADN (DDR), el Chk1 se activa marcadamente a través de la fosforilación en residuos S345 y S317(7, 13, 38, 39). A pesar del reconocimiento de la importancia de la fosforilación S345/S317, no está claro cómo esta fosforilación activa Chk1 (28-30). Demostramos que la expresión Chk1-S no cambiaba apreciablemente en DDR (Apéndice SI, Fig. 12). Sin embargo, la interacción Chk1–Chk1-S se atenuó en la DDR inducida por la camptotecina, un inhibidor de la topoisomerasa I de ADN y un agente dañino del ADN (Fig. 3E). Notablemente, la disociación de Chk1 de Chk1-S en DDR pareció depender de la fosforilación de Chk1 en S345/S317, porque el mutante Chk1(S345A/S317A) no se disoció de Chk1-S durante el tratamiento con camptotecina (Fig. 3E). En DDR, la activación de Chk1 depende de la fosforilación mediada por ATR (7, 13, 14). Mostramos que la inhibición de la ATR a través de un mutante dominante negativo (dn-ATR) no solo suprimió la fosforilación de Chk1-S inducida por camptotecina, sino que también impidió la disociación de Chk1-Chk1-S (Fig. 3F). De manera similar, Chk1 se disoció de Chk1-S durante la DDR inducida por cisplatino, y la disociación se evitó mediante dn-ATR (Apéndice SI, Fig. 13). En conjunto, los resultados sugieren que la fosforilación de Chk1 puede interrumpir su interacción con el inhibidor endógeno Chk1-S, lo que lleva a la activación de Chk1 en DDR.
La identificación de Chk1-S como un regulador único de la progresión del ciclo celular y la proliferación celular nos llevó a examinar su expresión en los tejidos cancerosos. A nivel de ARNm, la mayoría de los tejidos cancerosos expresaron niveles más altos de Chk1 y Chk1-S que los tejidos normales (Apéndice SI, Fig. 14). Curiosamente, los carcinomas testiculares mostraron una marcada regulación ascendente de Chk1-S, pero no de Chk1 (Fig. 4A). La regulación positiva específica del Chk1-S se confirmó mediante análisis inmunoblot en tejidos de carcinoma testicular, especialmente en muestras de cáncer en estadio avanzado (Fig. 4B). Como se informó anteriormente (5), tanto los tejidos testiculares normales como los malignos presentaron niveles altos de expresión de Chk1. También se detectó un aumento de la expresión de Chk1-S durante la progresión del cáncer de ovario (Fig. 4B). El nivel relativamente alto de expresión de Chk1 y Chk1-S en ambos fetales (Apéndice SI, Fig. 3) y cáncer (Fig. 4) los tejidos sugieren que el Chk1 – S puede acelerar la progresión del ciclo celular, promoviendo la proliferación celular en estas condiciones.
Regulación de Chk1-S en cáncer. A) Análisis de PCR en tiempo real de la expresión de ARNm de Chk1 y Chk1-S en tejidos testiculares normales y muestras de carcinoma testicular, mostrando una regulación ascendente de Chk1-S en carcinomas testiculares. B) Análisis inmunoblot de Chk1 y Chk1-S en tejidos humanos normales de cáncer testicular y testicular, que muestran un aumento de la expresión de Chk1-S en tejidos de cáncer en estadio avanzado. C) Se inyectaron a ratones desnudos células de 10 × 106 Tet-on MDA-MB-231 inducibles por doxiciclina para expresar Chk1, Chk1-KD o Chk1-S, respectivamente. Después del establecimiento del tumor a ∼100 mm3, los ratones se mantuvieron en agua potable con doxiciclina o sin esta. El volumen tumoral se midió semanalmente (se mostró para los valores de la cuarta semana, n = 8). Los datos indican media ± DE. Los resultados muestran que la expresión inducida de Chk1-S, pero no de Chk1 o Chk-KD, inhibió el crecimiento tumoral. D) Densitometría de los resultados inmunoblots de la expresión de Chk1-Myc inducida por doxiciclina, Chk1-KD-Myc y Chk1-S-Myc en tumores extirpados (n = 3 para cada grupo). Las señales se normalizaron con Chk1-Myc (establecido arbitrariamente como 100). Los datos indican media ± DE. Los resultados muestran que la doxiciclina indujo niveles similares de expresión de Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc y Chk1-S-Myc en los tumores. E) Se inyectó a ratones desnudos células inducibles por Chk1-S para establecer tumores y luego se les mantuvo en agua potable con o sin doxiciclina durante 4 semanas. Se recolectaron tejidos tumorales para análisis de inmunoblots. Los resultados muestran una expresión más alta de CDC25A en los xenoinjertos tumorales con expresión de Chk1-S inducida por doxiciclina.
Examinamos además el efecto de la expresión ectópica de Chk1-S en el crecimiento del tumor de xenoinjerto en ratones. Se establecieron xenoinjertos tumorales en ratones desnudos utilizando líneas celulares de cáncer de mama Tet-on MDA-MB-231 que pueden ser inducidas por doxiciclina para expresar Chk1, Chk1-S o Chk1-KD. La inducción de Chk1 o Chk1-KD por doxiciclina no afectó el crecimiento tumoral; sin embargo, la inducción de Chk1-S produjo una reducción de 40% en el volumen tumoral (Fig. 4C). Los tejidos tumorales inducidos por Chk1-S también mostraron acumulación de cdc25A, lo que indica la inhibición de Chk1 (Fig. 4E). Aunque los resultados pueden implicar una estrategia única contra el cáncer, la relevancia fisiológica de la sobreexpresión forzada de Chk1-S ectópico sigue sin estar clara. Estos resultados, sin embargo, proporcionan una prueba de principio de que la inclinación del equilibrio Chk1–Chk1-S puede conducir a una catástrofe mitótica y a la reducción de la proliferación celular.
La observación de que la sobreexpresión de Chk1-S redujo el crecimiento del tumor de xenoinjerto (Fig. 4 C-E) parecía contradictorio con la observación de que las muestras tumorales de pacientes humanos expresaban niveles relativamente altos de Chk1-S para proliferación celular (Fig. 4 Apéndice A, B y SI, Fig. 14). Para conciliar estos datos, es importante reconocer las diferencias entre las condiciones experimentales. La expresión relativamente alta de Chk1-S en tumores humanos se puede atribuir a la presencia de células proliferativas en estos tejidos. Consistentemente, el Chk1-S también es alto en tejidos fetales que son altamente proliferativos (Apéndice SI, Fig. 3A). Es importante destacar que la expresión de Chk1-S en estos tejidos proliferativos se restringe temporalmente a la fase tardía de S a M (Fig. 2 y Apéndice SI, Fig. 4). Esta regulación temporal puede garantizar que la actividad de Chk1 se inhiba después (y solo después) de la finalización de la replicación del ADN en la fase S para la progresión del ciclo celular a la fase G2/M. Sin embargo, cuando el Chk1-S ectópico se ve forzado a sobreexpresarse en células cultivadas o tumores de xenoinjerto, se interrumpe la restricción temporal de la expresión de Chk1-S; en otras palabras, el Chk1-S es alto durante todo el ciclo celular, incluida la fase S, lo que resulta en un bloqueo constante del Chk-1 y una entrada mitótica prematura, lo que conduce a una catástrofe mitótica y a una proliferación celular reducida.
En conclusión, este estudio ha identificado una variante de empalme de Chk1, Chk1-S, que es un regulador clave de Chk1 en el ciclo celular normal y durante DDR (Apéndice SI, Fig. 15). En el ciclo celular imperturbable, la expresión de Chk1 aumenta en la fase S y algunas moléculas de Chk1 pueden ser fosforiladas por ATR evitando la unión de Chk1-S, lo que resulta en una alta actividad de Chk1 y mantenimiento de la fase S hasta la finalización de la replicación del ADN. En la fase G2, la expresión de Chk1-S aumenta y, como se informó (29), la fosforilación de Chk1 disminuye, promoviendo una interacción de Chk1–Chk1-S para suprimir la actividad de Chk1. La disminución de la actividad de Chk1 en la fase G2/M es crítica para la entrada mitótica. En condiciones de inducción o sobreexpresión de Chk1-S, cantidades excesivas de Chk1-S secuestran a Chk1 y disminuyen su actividad quinasa durante la fase S, lo que resulta en una entrada mitótica prematura sin completar la replicación del ADN, lo que conduce a una catástrofe mitótica. Durante el daño al ADN, Chk1 se fosforila, lo que resulta en una disminución de la unión a Chk1-S, un aumento de la actividad de Chk1 y detención de G2/M (Apéndice SI, Fig. 11). Nuestros hallazgos apoyan el mecanismo de» des-represión » de la activación de Chk1 (29). Es importante destacar que el Chk1-S parece ser uno de los factores clave de represión de la actividad del Chk1. Al antagonizar el Chk1, el Chk1 – S puede acelerar el ciclo celular, lo que lleva a una mayor proliferación en los tejidos fetales y cancerosos. Los niveles altos de Chk1 en células proliferantes coordinan la fase S y la mitosis, mientras que los niveles altos de Chk1-S pueden proporcionar un interruptor potente para la transición de fase S a G2/M. Por el contrario, la sobreexpresión forzada de Chk1-S a niveles excesivos, desequilibrada por Chk1, induce la entrada mitótica prematura y la muerte celular (Fig. 2) y suprime el crecimiento tumoral en modelos de xenoinjertos tumorales (Fig. 4). Se ha sugerido que el Chk1 es una diana terapéutica eficaz en la terapia del cáncer, y los inhibidores de Chk1 se están evaluando en ensayos clínicos (40-43). La identificación de Chk1-S como inhibidor endógeno de Chk1 puede abrir nuevas áreas de investigación en la regulación del ciclo celular, la respuesta al daño del ADN y la terapia del cáncer.