eredmények és megbeszélés
vizsgálatunk során a DNS-károsodás jelátviteli (32, 33), megfigyeltük két kiemelkedő sávok Chk1 immunoblots: a Chk1 sáv 56 kDa és egy gyorsabban vándorló sáv 43 kDa. A gyorsabban vándorló sávot olyan Chk1 antitestek detektálták, amelyek reaktívak voltak a belső kináz doménre vagy a C-terminális szekvenciára, de nem az N terminált felismerő Chk1 antitestekkel (ábra. 1A). Ezt a sávot nem ismerte fel a Santa Cruz Biotechnológiából származó g4 monoklonális antitest, amelyet általában a Chk1 immunoblot elemzésére használnak (24, 29). A Chk1 leütése az siRNA-n keresztül mind a Chk1, mind a 43 kDa sáv eltűnéséhez vezetett, tovább megerősítve relevanciájukat (ábra. 1B). A 43-kDa fehérjét a proteaszóma és a proteáz inhibitorok nem befolyásolták (SI függelék, ábra. 1), felvetve annak lehetőségét, hogy ez a Chk1 alternatív illesztési változata lehet. A Nemzeti Biotechnológiai Információs Központ adatbázis jelenleg három alternatív módon összekapcsolt humán Chk1 mRNS-t sorol fel, amelyek változó lefordítatlan régiókkal rendelkeznek, de ugyanazt a teljes hosszúságú Chk1 fehérjét kódolják 476 aminosavból (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). Elemzésünk azonban egy EST-alapú alternatív splicing prediktív adatbázis (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) javasolta a chk1 egyedi splice változatának lehetőségét, amelyben a 3.exont alternatív módon illesztik vagy törlik. Ennek a lehetőségnek a közvetlen teszteléséhez RT-PCR-t végeztünk primerek felhasználásával a Chk1 kódolási szekvencián belül (ábra. 1C). A P1 alapozókészletet használó RT-PCR, amelyben az előremenő alapozót a 3. exonon belül tervezték, egyetlen várt méretű amplikont generált, míg az RT-PCR a P2 vagy P3 alapozókészlettel (mindkettő a 3.exont kísérő szekvenciákon alapul) két amplikont generált, az egyik a chk1 várható méretével, a másik pedig 200 bp-vel rövidebb (ábra. 1C). A szekvenálás megerősítette, hogy a hosszabb amplikon valóban Chk1 volt, nevezetesen, a rövidebb amplikon a Chk1 alternatív illesztési változata volt, hiányzik a 3.exon (ábra. 1D és SI függelék, ábra. 2A). Az előrejelzések szerint ez az illesztési változat a Chk1 N-terminálisan csonka formájává alakul, amely 382 aminosavból áll, amelyeket Chk1-rövidnek vagy Chk1-S-nek neveztünk el (ábra. 1D és SI függelék, ábra. 2). A gélelektroforézis során az in vitro transzlált Chk1 – S hasonlóan vándorolt, mint a 43-kDa fehérje a hek293 sejtekből (ábra. 1E). Továbbá immunprecipitáltuk a 43-kDa fehérjét a hek293 sejtlizátumból tömegspektrometriához, és megerősítettük azonosságát Chk1-s-ként. Az N-terminális csonkolás a Chk1-S-ben összhangban van az immunoblot eredményekkel, amelyek azt mutatják, hogy a Chk1 N-terminális szekvenciájára reaktív antitestek nem ismerik fel (ábra. 1A). A valós idejű és RT-PCR analízis chk1-s mRNS expressziót mutatott ki több emberi szövetben, és az expresszió általában magasabb a magzati szövetekben (SI függelék, ábra. 3 A és D). Az Immunoblot analízis tovább detektálta a Chk1-s fehérje expresszióját humán, egér és patkány sejtvonalakban, valamint emberi magzati szövetekben (SI függelék, ábra. 3B) és az egér primer renális tubuláris sejtjei(SI függelék, ábra. 3C). A Chk1-s teljes hosszúságú cDNS-ét három normál emberi szövetből (thymus, vastagbél, magzati máj) is klónozták, és szekvenálták annak megerősítésére, hogy a Chk1 N-terminálisan csonka splice változatát kódolja. Ezek a kísérletek együttesen azonosították a Chk1 egyedülálló splice változatát, amely N-terminálisan csonka és széles körben expresszálódik emlős sejtekben és szövetekben.
a Chk1-S azonosítása a Chk1 egyedi, n-terminálisan csonka illesztési változataként. (A) A hek293 sejtlizátumot immunoblottálással elemeztük, olyan antitestekkel, amelyek specifikusan felismerik a Chk1 n terminálisát (CA), kináz doménjét (C) vagy C terminálisát (C) chk1 (C). A Chk1-en kívül egy 43-kDa-s fehérjét is kimutattak a 6-chk1-KD és az a-chk1-CT-vel, de nem a-chk1-NT-vel. (B) A HEK293 sejteket transzfektáltuk Chk1 siRNS-sel (siChk1) vagy egy kódolt szekvenciával (siCon) 48 órán keresztül, hogy egész sejtes lizátumot gyűjtsünk immunoblot analízishez, felhasználva a .. -chk1-KD. a siChk1 csökkentette mind a Chk1, mind a 43 kDa fehérje expresszióját. (C) az RNS-t HEK293 sejtekből izoláltuk RT-PCR-re három különböző primerkészlet felhasználásával a Chk1 számára: P1, P2 és P3 (a relatív szekvenciahelyeket az ábra mutatja). Két amplikont detektáltunk RT-PCR-rel a 3. exont (P2 és P3) szegélyező primer készletek felhasználásával, míg csak egy amplikont amplifikáltunk a P1 primer készlet segítségével, amelyek közül az elülső primer a Chk1 3.exonjában volt. D) a Chk1 alternatív splicingjének sematikus ábrázolása, amely N-terminálisan csonka fehérjét eredményez, Chk1-S. (E) a Chk1-S-t in vitro transzláció céljából klónoztuk, és a transzlált fehérjét a hek293 sejtlizátummal együtt immunoblot analízissel elemeztük. Az In vitro transzlált Chk1 a 43-kDa sávhoz hasonlóan vándorolt a HEK293 sejtekben.
mi a Chk1-S funkciója? Szabályozza a sejtciklus ellenőrző pontjait, mint például a Chk1? Ezekkel a kérdésekkel először meghatároztuk a Chk1-s időbeli és térbeli expressziós mintáit a sejtciklusban. A HEK293 sejteket G1, G1/S vagy G2/M fázisokban szinkronizáltuk szérum éhezéssel, kettős timidin blokkkal vagy nocodazollal. A Chk1-s alacsony volt a G1 fázisú sejtekben és magasabb a G1/S és G2/M sejtekben (SI függelék, ábra. 4 A és B). Sőt, amikor a sejteket G1/S fázisban szinkronizálták kettős timidin blokkkal, majd felszabadultak, mind a Chk1, mind a Chk1-s expresszió növekedett az S fázisba való belépés után (ábra. 2A). A chk1 és a Chk1-s expresszió közötti különbség az volt, hogy míg a Chk1 expresszió az S fázis közepén tetőzött, a Chk1-s expresszió folyamatosan növekedett az S fázisról M fázisra (ábra. 2A). Érdekes módon a Chk1-s expresszió magas szintjét figyelték meg 7 órával a sejtciklus felszabadulása után kettős timidin blokk, egy olyan időpont, amikor a sejtek még nem voltak mitotikusak (SI függelék, ábra. 4C). Továbbá számszerűsítettük a Chk1-S:Chk1 arányt aszinkron és S vagy G2/M szinkronizált cellákban. A Chk1-s expresszió variációi ellenére a hek293, U2OS és primer renális tubuláris sejtekben a Chk1-S:Chk1 arány minden sejtben 1 felett volt a G2/M fázisban (SI függelék, ábra. 5). Aszinkron sejtekben a Chk1-S és a Chk1 elsősorban a magban lokalizálódott (SI függelék, ábra. 6A). A G2 / M fázisú sejtekben azonban néhány chk1-S és Chk1 felhalmozódott a centroszómákban (SI függelék, ábra. 6 B és C). A chk1 lokalizációja a centroszómákban kritikus a G2 / M ellenőrzőpont funkció szempontjából, ahol megakadályozza a Cdk1 idő előtti aktiválódását és a mitotikus belépést (34, 35). Eredményeink azt mutatják, hogy a Chk1 – S lokalizálódhat a centroszómákra is, biztosítva a chk1 térbeli és időbeli szabályozását a mitotikus bejutás elindításához. Ezután meghatároztuk a Chk1 vagy Chk1-s túlexpresszió hatásait a HEK293 és U2OS sejtekben. A GFP-Chk1-hez képest a GFP-Chk1-S megkülönböztetett nukleáris fenotípust indukált, amelyet a mag kondenzációja és a mikronukleuszok, valamint a többszörös vagy többrétegű magok képződése jellemzett (ábra. 2B). A korábbi időpontokban a transzfektált sejtek nukleáris / kromatin kondenzációt mutattak, amelyet halvány és punctate hiszton-H3 foszforiláció jellemez (ábra. 2B), ami korai mitotikus belépésre utal. Később ezek a sejtek mikronukleuszokat vagy multilobed magokat fejlesztettek ki, a mitotikus katasztrófa jellemzői (ábra. 2B). A sejtszámlálás azt mutatta, hogy a GFP-Chk1-S indukálta a nukleáris fenotípust az u2os sejtek 20% – ában (ábra. 2C). Hasonló hatást mutatott az YFP-Chk1-S és a Chk1-S-Myc (ábra. 2C), jelezve, hogy a megfigyelt nukleáris fenotípust a Chk1-S indukálta, nem pedig a fúziós fehérje címkék. Ezzel szemben a korai mitotikus belépést nem indukálta a Chk1 vagy annak kináz-halott mutáns Chk1-KD (ábra. 2C). A Chk1-S más sejttípusokban is indukálta a feltűnő nukleáris fenotípust (SI függelék, ábra. 7). Nevezetesen hasonló nukleáris fenotípust jelentettek olyan sejt-és egérmodellekben, amelyekben nem volt egy vagy mindkét Chk1 allél (7, 36, 37), ami arra utal, hogy a Chk1-S a Chk1 endogén inhibitoraként működhet. Ennek a lehetőségnek a további teszteléséhez tet-on U2OS sejtvonalakat hoztunk létre, amelyek indukálhatók Chk1, Chk1-KD vagy Chk1-s expresszálására.a sejteket G1/S fázisban szinkronizáltuk kettős timidin blokkkal, doxiciklin indukálta, majd felszabadult nocodazolt tartalmazó közegbe. A Chk1-S-expresszáló sejtek körülbelül 80% – A lépett be mitózis , míg a chk1-vagy Chk1-KD-expresszáló sejtek 60% – a (ábra. 2D). Fontos, hogy míg a Chk1 – és Chk1-KD-expresszáló csoportok legtöbb mitotikus sejtje 4N DNS-sel rendelkezett, a chk1-S-expresszáló csoport mitotikus sejtjeinek 25% – a kevesebb, mint 4n DNS-tartalommal rendelkezett (ábra. 2D), amely aberráns mitotikus belépésre utal ezekbe a sejtekbe a DNS-replikáció befejezése nélkül. Ezenkívül a Chk1-S túlzott expressziója a mitózisba való korábbi belépést eredményezte, amint azt a pH3-pozitív sejtek megjelenése jelzi (SI függelék, ábra. 8). A Chk1 a mitotikus belépés vagy az S-G2/M átmenet kulcsfontosságú szabályozója a sejtciklusban. A CDC25A és a Wee1 foszforilálásával a Chk1 megakadályozza a CDK1 aktiválódását és a mitotikus belépést (5, 15-20). Kimutattuk, hogy a Chk1-S doxiciklin általi indukciója a Tet-on U2OS sejtekben a CDC25A magasabb szintjét és a foszfo-CDK1 alacsonyabb szintjét eredményezte, ami arra utal, hogy a Chk1-S antagonizálta a Chk1-et, hogy mitotikus belépést indukáljon (ábra. 2E). A Chk1-S specifikus leütése az RNAi-n keresztül nem volt sikeres, mert a Chk1-S szekvencia a Chk1 mRNS-ben található. Azonban egy antiszensz oligonukleotid komplementer az egyedülálló exon2-exon4 csomópont a Chk1-S-ben specifikusan csökkentheti a Chk1-s expresszióját (SI függelék, ábra. 9A). A Chk1-S lefelé történő szabályozása jelentősen csökkentette a sejtproliferációt (SI függelék, ábra. 9B). Érdekes módon a Chk1-s lefelé történő szabályozása nem változtatta meg jelentősen a sejtciklus profilját (SI függelék, ábra. 9C). Mivel a Chk1 több sejtciklus-ellenőrző ponton működik (például G2/M, orsó, intra-S), a Chk1-S antagonizálhatja a Chk1-et, hogy megkönnyítse a sejtciklus progresszióját több helyen. Ennek eredményeként a Chk1-s gátlása különböző fázisokban lelassíthatja a sejtciklust, és a proliferáció szuppresszióját eredményezheti a sejtciklus eloszlásának jelentős változása nélkül.
a sejtciklus szabályozása a Chk1-S segítségével. (A) A HEK293 sejteket kettős timidin blokkkal szinkronizáljuk, majd nocodazolt tartalmazó közegbe engedjük. (Balra) Propidium-jodid (PI) festéssel és FACS analízissel elemzett sejtciklus-profil. (Jobbra) a chk1 és Chk1-s Immunoblot analízise a timidin blokkból történő felszabadulást követően a megadott időpontokban összegyűjtött sejtlizátumban. AS, aszinkron sejtek (B) U2OS sejtek transzfektáltuk GFP-Chk1 vagy GFP-Chk1-S (Zöld), majd fix immunfluoreszcencia foszfo-hiszton H3 (piros) és a nukleáris festéssel Hoechst33342 (kék). (Felső) Chk1-S, de nem Chk1, indukált korai kromatin kondenzáció és gyenge pH3 festés (nyilak). (Alsó) a késői szakaszban a Chk1-S-transzfektált sejtek a mitotikus katasztrófa jellemzőit mutatták, beleértve a mikronukleuszokat és a többsejtű magokat (arrows). C) az u2os sejteket transzfektáltuk a jelzett génekkel, és a korai kromatin kondenzáció és mitotikus katasztrófa nukleáris fenotípusú sejteket számoltuk. Az adatok azt mutatják, hogy az átlagot 6 SD-vel kell számolni; * P <0,05 versus vektorcsoport. Az eredmények azt mutatják, hogy a Chk1-S túlzott expressziója kifejezetten a nukleáris fenotípushoz vezetett. (D) az U2OS sejteket a jelzett génekkel transzfektáltuk, kettős timidin blokkkal szinkronizáltuk, és 7 órán keresztül felszabadítottuk. a sejteket ezután PH3 immunfluoreszcenciára és PI festésre rögzítettük, és FACS-vel elemeztük. Az adatok azt mutatják, hogy az átlagot 6 SD-vel kell számolni; * P <0,05 versus vektorcsoport. Az eredmények azt mutatják, hogy a Chk1-s specifikusan indukálta a korai mitotikus belépést a DNS-replikáció befejezése nélkül (<4N DNS-sel rendelkező sejtek). (E) a Tet-on U2OS sejteket doxiciklinnel vagy anélkül indukáltuk. A sejteket ezután s fázisban szinkronizálták kettős timidin blokkkal, majd 7 órán keresztül felszabadították. A jelzett fehérjék immunoblot elemzéséhez teljes sejtes lizátumot gyűjtöttünk. Az eredmények azt mutatják, hogy az indukált Chk1-s expresszió a CDC25A növekedéséhez és a foszfo-CDK1 csökkenéséhez vezetett, hozzájárulva a korai mitotikus bejutáshoz.
hogyan gátolja a Chk1-S a Chk1-et? Feltételeztük, hogy a Chk1-S kölcsönhatásba léphet a Chk1-gyel, hogy blokkolja kináz aktivitását. Következetesen, FLAG-Chk1-s expresszált hek293 sejtek coimmunoprecipitált endogén Chk1 (ábra. 3A). Továbbá, in vitro lefordított MYC-Chk1 és Chk1-s coimmunoprecipitált (ábra. 3B), ami közvetlen Chk1–Chk1-s interakcióra utal. Továbbá bemutattuk a Chk1 koimmunprecipitációját a Chk1-S N-terminális doménjével, de nem a C-terminális doménjével (ábra. 3C), ami arra utal, hogy a Chk1-S-ben az N-terminális szekvencia követelménye a Chk1-vel való kölcsönhatása. Funkcionálisan meghatároztuk a Chk1-S hatását a Chk1 kináz aktivitásra. A chk1-Myc-t in vitro kináz vizsgálat céljából expresszáltuk és immunprecipitáltuk tisztított Chk1-S. hiányában vagy jelenlétében, az ábrán látható módon. A 3D, Chk1 kináz aktivitást részben még szignifikánsan elnyomta a Chk1-S, de nem hő-denaturált Chk1-S. ezzel szemben a Chk1-S nem csökkentette a Chk2 aktivitást, amelynek hasonló szubsztrát preferenciái vannak, mint a Chk1-nek. A Chk1-hez képest a Chk1-S-nek nincs része a kináz doménnek, beleértve az ATP-kötő helyet (ábra. 1D), és a várakozásoknak megfelelően nem mutatott szignifikáns protein-kináz aktivitást (ábra. 3D). A Chk1-S elnyomhatja az N-terminálisan címkézett Chk1 (FLAG-Chk1) kináz aktivitását is in vitro kináz assay (SI függelék, ábra. 10). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Chk1-S molekuláris kölcsönhatás révén gátolhatja a Chk1-et. Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a Chk1 immunprecipitátumok mosása szigorúbb Rádióimmunprecipitációs vizsgálattal (RIPA) a puffer jelentősen növelheti a Chk1 kináz aktivitását, ami arra utal, hogy a Chk1-et általában elnyomó tényezők gátolják (29); az elnyomó tényezők azonosítása azonban nem ismert. Megerősítettük a RIPA puffermosás hatását, nevezetesen azt is megmutattuk, hogy az exogén Chk1-S hozzáadása megfordíthatja a RIPA puffermosás Chk1 kináz aktivitásra gyakorolt hatását (SI függelék, ábra. 11), ami arra utal, hogy a Chk1-S lehet A chk1 egyik legfontosabb endogén elnyomó tényezője.
a Chk1-S kölcsönhatásba lép a Chk1-gyel, hogy elnyomja kináz aktivitását. (A) A HEK293 sejteket FLAG-Chk1-S-vel vagy üres vektorral transzfektáltuk, hogy lizátumot gyűjtsünk immunprecipitációhoz (IP) Anti-FLAG antitestek felhasználásával. Az immunprecipitátumokat a Chk1 és a FLAG-Chk1-S szempontjából Anti-FLAG, illetve Anti-N terminus Chk1 antitestekkel végzett immunoblottolással elemeztük. Az eredmények a FLAG-Chk1-S együttes IP-jét mutatják endogén Chk1. B) A Chk1-Myc-t és a Chk1-S-t a TNT in vitro transzkripciós/transzlációs készlet (Promega) felhasználásával állították elő. (Balra) in vitro termelt Chk1-Myc és Chk1-S mutatott immunoblotting. (Jobbra) a Chk1-Myc-t anti-Myc antitestekkel immunprecipitáltuk chk1-S-vel vagy anélkül történő inkubálás után. Az eredmények közvetlen kölcsönhatásra utalnak a Chk1 és a Chk1-S között. (C) A HEK293 sejteket MYC-vel jelölt Chk1-S – vel vagy annak C-vagy N-terminális deléciós mutánsaival transzfektáltuk, hogy anti-Myc antitestekkel gyűjtsük össze az immunprecipitációhoz szükséges lizátumot. Az immunprecipitátumokat chk1 jelenlétére vizsgáltuk. Az eredmények bizonyítják a Chk1 koimmunprecipitációját a Chk1-S-vel és annak C-terminális deléciós mutánsával, de nem az N-terminális deléciós mutánsával. (D) A HEK293 sejteket MYC-vel jelölt Chk1-S, Chk1 vagy Chk2-vel transzfektáltuk, hogy lizátumot gyűjtsünk immunprecipitációhoz Anti-Myc antitestek felhasználásával. A chk1-S-Myc-t, Chk1-Myc-t vagy Chk2-Myc-t tartalmazó immunprecipitátumokat chk1-S-vel vagy anélkül inkubáltuk 1 órán át, majd hozzáadtuk a kinázaktivitási vizsgálathoz chktide szubsztrátként történő felhasználásával. A denaturált Chk1-S-t forralással állítottuk elő. Az adatok azt mutatják, hogy az átlagos érték 6 fő; * P < 0,05, szemben a Chk1-Myc csoporttal. Az eredmények azt mutatják, hogy a natív Chk1-S specifikusan gátolhatja a Chk1-et. (E) a HEK293 sejteket chk1-Myc vagy Chk1-Myc(S317A/S345A) mutánssal transzfektáltuk. A sejteket ezután kezeletlenül vagy 100 nM-es kamptotecinnel kezeltük 2 órán keresztül, hogy anti-Myc antitestekkel lizátumot gyűjtsünk immunprecipitációhoz. Az immunprecipitátumokat a Myc-Chk1, a foszforilált (szerin 345) Chk1 és a Chk1-S immunoblotokkal elemeztük. A Chk1 bemenetet a mintákban is ellenőrizték. Az eredmények azt mutatják, hogy a Chk1-S koimmunprecipitált vagy a chk1-gyel társult a normál sejtekben, és hogy az asszociáció csökkent a camptotecin által kiváltott DNS-károsodás során. A CHK1-s és a Chk1(S345A/S317A) mutáns közötti kapcsolat azonban nem szakadt meg a DNS-károsodás során, ami arra utal, hogy a Chk1 foszforilációja S345 és S317-nél szükséges lehet A Chk1-s chk1-től való disszociációjához. (F) A HEK293 sejteket chk1-Myc + üres vektorral vagy Chk1-Myc + dn-ATR-rel kotranszfektáltuk, majd 100 nM-es kamptotecin-kezeléssel 2 órán át. A sejtes lizátumot anti-Myc antitestekkel történő immunprecipitáció céljából gyűjtöttük, majd a jelzett fehérjék immunoblot analízisét követtük. Az eredmények azt mutatják, hogy a chk1-Chk1–s disszociáció kamptotecin által indukált megszakadása az ATR-től és a Chk1 foszforilációtól függ.
a DNS-károsodásra adott válaszban (DDR) a Chk1 jelentősen aktiválódik az S345 és S317 maradékok foszforilezésével (7, 13, 38, 39). Annak ellenére, hogy felismerték az S345/S317 foszforiláció fontosságát, továbbra sem világos, hogy ez a foszforiláció hogyan aktiválja a Chk1-et (28-30). Megmutattuk, hogy a Chk1-s expresszió nem változott észrevehetően a DDR – ben (SI függelék, ábra. 12). A chk1-Chk1-s kölcsönhatás azonban a DDR-ben gyengült, amelyet a DNS topoizomeráz I inhibitor és DNS-károsító ágens, a camptotecin indukált (ábra. 3E). Nevezetesen a chk1 disszociációja a Chk1-S-től a DDR-ben a Chk1 foszforilációjától függött az S345/S317-nél, mert a chk1(S345A/S317A) mutáns nem disszociált a chk1-S-től a kamptotecin-kezelés során (ábra. 3E). A DDR-ben a Chk1 aktiválása az ATR által közvetített foszforilációtól függ (7, 13, 14). Megmutattuk, hogy az ATR gátlása egy domináns negatív mutáns (dn-ATR) révén nemcsak elnyomta a kamptotecin által kiváltott Chk1-S foszforilációt, hanem megakadályozta a Chk1-Chk1–s disszociációt is (ábra. 3F). Hasonlóképpen, a Chk1 disszociált a Chk1-S-től a ciszplatin által indukált DDR során, és a disszociációt a dn-ATR megakadályozta (SI függelék, ábra. 13). Az eredmények együttesen arra utalnak, hogy a Chk1 foszforilezése megzavarhatja kölcsönhatását a chk1-s endogén inhibitorral, ami Chk1 aktiválódáshoz vezet a DDR-ben.
a Chk1-S mint a sejtciklus progressziójának és a sejtproliferáció egyedülálló szabályozójának azonosítása arra késztetett minket, hogy megvizsgáljuk annak kifejeződését a rákos szövetekben. Az mRNS szintjén a legtöbb rákos szövet magasabb Chk1 és Chk1-s szintet expresszált, mint a normál szövetek (SI függelék, ábra. 14). Érdekes módon a herék karcinómái a Chk1-S markáns szabályozását mutatták, de nem a Chk1-et (ábra. 4A). A Chk1-S specifikus up-szabályozását tovább erősítették immunoblot analízissel a hererák szöveteiben, különösen a késői stádiumú rákmintákban (ábra. 4B). Amint arról korábban beszámoltunk (5), mind a normál, mind a rosszindulatú hereszövetekben magas volt a Chk1 expresszió szintje. A petefészekrák progressziója során a Chk1-S fokozott expresszióját is kimutatták (ábra. 4B). A chk1 és a Chk1-s expresszió viszonylag magas szintje mindkét magzatban (SI függelék, ábra. 3) és a rák (Fig. 4) a szövetek azt sugallják, hogy a Chk1-S felgyorsíthatja a sejtciklus progresszióját, elősegítve a sejtproliferációt ilyen körülmények között.
Chk1-s szabályozás a rákban. A) A chk1 és a Chk1-s mRNS expressziójának valós idejű PCR analízise normál hereszövetekben és herekarcinóma mintákban, a chk1-S regulációja a herekarcinómákban. B) A chk1 és a Chk1-s Immunoblot analízise a humán normál hererák és hererák szöveteiben, fokozott Chk1-s expressziót mutatva a késői stádiumú rákszövetekben. (C) meztelen egerekbe 10 db 106 tet-et injektáltunk az MDA-MB-231 sejteken, amelyek doxiciklin-indukálhatók chk1, Chk1-KD vagy Chk1-S expresszálására. A tumor kialakulása után 100 mm3-ig az egereket doxiciklinnel vagy anélkül ivóvízen tartottuk fenn. A Tumor térfogatát hetente mértük (a negyedik heti értékek esetében n = 8). Az adatok azt jelzik, hogy az átlagos SD. Az eredmények azt mutatják, hogy a Chk1-S indukált expressziója, de a Chk1 vagy a Chk-KD nem gátolta a tumor növekedését. D) a doxiciklin által indukált Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc és Chk1-S-Myc expresszió immunoblot eredményeinek denzitometriája kivágott tumorokban (n = 3 minden csoportra). A jeleket a Chk1-Myc-vel normalizáltuk (önkényesen 100-ra állítva). Az adatok azt jelzik, hogy az átlagos SD. Az eredmények azt mutatják, hogy a doxiciklin a chk1-Myc, a Chk1-KD-Myc és a chk1-S-Myc hasonló expressziós szintjét indukálta a tumorokban. (E) a meztelen egereket Chk1-S-indukálható sejtekkel injektáltuk tumorok létrehozására, majd ivóvízen fenntartottuk doxiciklinnel vagy anélkül 4 hétig. A tumorszöveteket összegyűjtöttük immunoblot elemzés céljából. Az eredmények magasabb CDC25A expressziót mutatnak a tumor xenograftokban doxiciklin által indukált Chk1-s expresszióval.
tovább vizsgáltuk az ektopiás Chk1-s expresszió hatását a xenograft tumor növekedésére egerekben. A Tumor xenograftokat meztelen egerekben hozták létre Tet-on MDA-MB-231 emlőrákos sejtvonalak alkalmazásával, amelyeket doxiciklin indukálhat chk1, Chk1-S vagy Chk1-KD expresszálására. A Chk1 vagy Chk1-KD doxiciklin általi indukciója nem befolyásolta a tumor növekedését; a Chk1-S indukciója azonban a tumor térfogatának 40% – os csökkenését eredményezte (ábra. 4C). A Chk1-S által indukált tumorszövetek cdc25A felhalmozódást is mutattak, jelezve a Chk1 gátlását (ábra. 4E). Bár az eredmények egyedülálló rákellenes stratégiát jelenthetnek, az ektopiás Chk1-S kényszerített túlzott expressziójának fiziológiai relevanciája továbbra sem világos. Ezek az eredmények azonban bizonyítják azt az elvet, hogy a Chk1–Chk1-s egyensúly megdöntése mitotikus katasztrófához és a sejtproliferáció csökkenéséhez vezethet.
az a megfigyelés, hogy a Chk1-S túlzott expressziója csökkentette a xenograft tumor növekedését (ábra. 4 C-E) ellentmondásosnak tűnt azzal a megfigyeléssel, hogy az emberi betegekből származó tumorminták viszonylag magas szintű Chk1-S-t fejeztek ki a sejtproliferáció szempontjából (ábra. 4 A és B és SI függelék, ábra. 14). Ezen adatok összeegyeztetése érdekében fontos felismerni a kísérleti körülmények közötti különbségeket. Az emberi daganatokban viszonylag magas Chk1-s expresszió a proliferatív sejtek jelenlétének tulajdonítható ezekben a szövetekben. Következetesen a Chk1-S magas a magzati szövetekben is, amelyek erősen proliferatívak (SI függelék, ábra. 3A). Fontos, hogy ezekben a proliferatív szövetekben a Chk1-s expresszió időben a késői S-M fázisra korlátozódik (ábra. 2 és SI függelék, ábra. 4). Ez az időbeli szabályozás biztosíthatja a Chk1 aktivitás gátlását a DNS replikáció befejezése után (és csak azután) az S fázisban a sejtciklus G2/M fázisba történő progressziója érdekében. Azonban, amikor a méhen kívüli Chk1-s kénytelen túlexpresszálni a tenyésztett sejtekben vagy a xenograft tumorokban, a chk1-s expressziójának időbeli korlátozása megszakad; más szavakkal, a Chk1-S magas az egész sejtciklusban, beleértve az S fázist is, ami a Chk-1 állandó blokádját és a korai mitotikus belépést eredményezi, ami mitotikus katasztrófához és csökkent sejtproliferációhoz vezet.
összefoglalva, ez a tanulmány azonosította a chk1 splice változatát, a Chk1-S-t, amely a chk1 kulcsfontosságú szabályozója a normál sejtciklusban és a DDR alatt (SI függelék, ábra. 15). A zavartalan sejtciklusban a Chk1 expresszió az S fázisban növekszik, és egyes Chk1 molekulák FOSZFORILÁLÓDHATNAK az ATR által, megakadályozva a Chk1-S kötődést, ami magas Chk1 aktivitást és S-fázis fenntartást eredményez a DNS replikáció befejezéséig. A G2 fázisban a Chk1-s expresszió növekszik, és a jelentések szerint (29) a Chk1 foszforiláció csökken, elősegítve a Chk1–Chk1-s kölcsönhatást a Chk1 aktivitás elnyomására. A chk1 aktivitás csökkenése a G2 / M fázisban kritikus a mitotikus Belépés szempontjából. A Chk1-s indukció vagy túlzott expresszió körülményei között a chk1-S túlzott mennyiségű chk1 szekvenálja a Chk1-et, és csökkenti annak kináz aktivitását az S fázisban, ami idő előtti mitotikus belépést eredményez a DNS-replikáció befejezése nélkül, ami mitotikus katasztrófához vezet. A DNS-károsodás során a Chk1 foszforilálódik, ami csökkent Chk1-s kötődést, fokozott Chk1 aktivitást és G2/M leállást eredményez (SI függelék, ábra. 11). Eredményeink alátámasztják a Chk1 aktiválásának” de-repression ” mechanizmusát (29). Fontos, hogy a Chk1-S a Chk1 aktivitás egyik legfontosabb elnyomó tényezője. A Chk1 antagonizálásával a Chk1-S felgyorsíthatja a sejtciklust, ami fokozott proliferációhoz vezethet a magzati és rákos szövetekben. A proliferáló sejtekben a Chk1 magas szintje koordinálja az S fázist és a mitózist, míg a chk1-S magas szintje erőteljes kapcsolót biztosíthat az S-G2 / M fázisátalakuláshoz. Ezzel szemben a Chk1-S túlzott mértékű, a Chk1 által kiegyensúlyozatlan erőltetett túlzott expressziója idő előtti mitotikus belépést és sejthalált idéz elő (ábra. 2) gátolja a tumor növekedését tumor xenograft modellekben (ábra. 4). A Chk1 hatékony terápiás célpontnak bizonyult a rákterápiában, és a Chk1 inhibitorokat klinikai vizsgálatokban értékelik (40-43). A Chk1-S mint a Chk1 endogén inhibitorának azonosítása új kutatási területeket nyithat meg a sejtciklus szabályozásában, a DNS-károsodásra adott válaszban és a rákterápiában.