experimentella procedurer
primära celler, cellinjer och tillväxtbetingelser-perifera blodmononukleära celler (PBMC) isolerades från buffy coats (Western Province Blood Transfusion Service, Kapstaden, Sydafrika) med Ficoll—Paque Bisexuell Plus (Amersham Biosciences), som tidigare beskrivits (14). Monocyt-härledda makrofager och dendritiska celler genererades från Pbmc som beskrivs (14). Nih3t3 och HEK293T fibroblaster, RAW264.7 makrofager, Hek293t-baserade Phoenix ecotropic retroviral förpackningscellinjer (en gåva från Dr.Gary Nolan, Stanford University), Syk-deficient (C35) och Syk-rekonstituerade (WT8) B-cellinjer (15) bibehölls i Dulbeccos modifierade Eagle ’ s medium eller Rpmi1640 medium (Cambrex) kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum (Invitrogen), 20 mm HEPES, 2 mm l-glutamin, 100 enheter/ml penicillin och 0,1 mg/ml streptomycin (Cambrex). Alla celler odlades vid 37 kg C i 5% CO2.
generering av konstruktioner och Transducerade cellinjer—den fullständiga CLEC9A open reading frame (ORF) isolerades från humant PBMC cDNA genom PCR och klonades in i pfbneo (Stratagene) retroviral vektor innehållande en HA-tagg (16) med användning av följande primers; AAAGAATTCCCCACCATGCACGAGGAAGAAATAC och aaactcgaggacagaggatctcaacgc. C-terminalt HA-taggade murine CLEC9A (mCLEC9A) klonades på liknande sätt från mus mjält cDNA med användning av följande primers; AAAGTCGACCACCATGCGCGGAAGAATA och gtactcgacgatgcaggatccaaatgc.
CLEC9A/Dectin-1-chimera i pFBneo genererades med användning av överlappningsförlängnings-PCR med primers CTGCTAAACTTTACAGAAACCAAGCCCACA och TCTGGGGCTTGTGGTTTTCTGTAAAGTTTAGCAG så att sekvensen översätts som CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84/Dectin-91NHKPTDectin-95. Fc-CLEC9A-uttryckskonstruktionen genererades genom PCR med användning av följande primers; TTTGGTACCAGCAGCAAGAAAAACTC och GCGGAATTCGACAGAGGATCTCAACGC och klonades in i pSecTag2-vektorn (Invitrogen) uppströms från den humana IgG1 Fc-regionen, genererad som beskrivet (17). Troheten hos alla konstruktioner verifierades genom sekvensering. Mänskliga och murina CLEC9A-och isoformer har deponerats i GenBank Macau under följande anslutningsnummer: hCLEC9A, EU339276, mCLEC9A, EU339277, mclec9a, eu339278, mCLEC9Ay, EU339279, mclec9a, eu339280, mCLEC9Ae, EU339281.
för att generera stabila cellinjer förpackades konstruktioner i vironer med användning av HEK293T-baserade Phoenix-ekotropa celler, och de olika cellinjerna omvandlades som tidigare beskrivits (16). Alla cellinjer användes som icke-klonala populationer för att minska grundareffekterna och genererades och testades minst två gånger för att bekräfta fenotyp. Vid behov valdes cellinjer ut och bibehölls i 0,6 mg/ml Geneticin (G418) (Merck) eller 4 kg/ml puromycin (Invitrogen).
humant CLEC9A-uttryck analyserades med PCR av humana vävnads-cDNA-paneler (Clontech) med användning av följande primrar som kodar för hela ORF, ATGCACGAGGAAGAAATACACC och GACAGAGGATCTCAACGCATA. mCLEC9A-uttryck analyserades med PCR av musvävnads-cDNA-paneler (Clontech) med användning av samma murina primers som beskrivits ovan. Uttryck av G3PDH användes som en positiv kontroll.
generering av en monoklonal antikropp mot CLEC9A—Den monoklonala antikroppen (mAb), 9A11, specifik för CLEC9A, genererades genom immunisering av 129sv-möss med ett lösligt Fc-CLEC9A-fusionsprotein. Ns1-hybridom genererades och supernatanter från klonalt utspädda celler screenades av ELISA. MAb 9A11 (IgG1) valdes därefter baserat på dess förmåga att fungera i ELISA, flödescytometri och Western blotting, under icke-reducerade förhållanden.
Western Blotting och Deglycosylation—för att förbereda cellulära extrakt tvättades celler med PBS och lyserades sedan i nonidet P-40-buffert (1% Nonidet P-40, 0.15 m NaCl, 10 mm EDTA, 10 mm NaN3, 10 mm Tris-HCl, pH 8), kompletterat med proteashämmare (Roche Applied Science), för 30 min vid 4-kakor C. cellulära skräp/kärnor avlägsnades genom centrifugering och supernatanter samlades in och lagrades vid -20 C. C. proteinkoncentrationer av cellextrakt bestämdes genom BCA-analys (Pierce), och lika stora mängder protein kördes på SDS-Page-geler, enligt standardprotokoll. Efter överföring till HybondC+ nitrocellulosamembran (Amersham Biosciences) detekterades CLEC9A genom immunfärgning med 9A11 eller anti-HA (klon 16b12, Covance) följt av get-anti-mus pepparrotperoxidas (Jackson). Blottar utvecklades med ECL-plus kit (Amersham Biosciences). Celllysater deglykosylerades med med PNGase F och / eller O-glykosidas (Roche Applied Science), som beskrivits av tillverkaren.
antikroppar, flödescytometri och cellsortering—celler undersöktes med multicolor flödescytometri på en FASCCaliber (BD Biosciences), utförd enligt konventionella protokoll vid 4 C i närvaro av 2 mm NaN3. Celler blockerades i PBS innehållande 5 mm EDTA, 0,5% BSA och 5% värmeinaktiverat kaninserum (murina celler) eller murina serum (perifert blod) och 50 kg/ml humant IgG (Sigma; in vitro odlade humana celler och Pbmc) före tillsats av primära antikroppar. Celler fixerades med 1% formaldehyd, 0,25% BSA i PBS före analys.
för att isolera 9a11+-celler för analys blockerades 30 miljoner Pbmc, isolerade som beskrivits ovan, med 5% musserum eller 50 kg/ml humant IgG i 15 minuter vid 4 kg C. celler färgades sedan med biotinylerad 9A11 mAb i 30 minuter vid 4 kg C, följt av streptavidin-APC (BD Pharmingen) och APC+ – celler sorterades med FACSVantage S. E. (Beckton Dickinson). De sorterade cellerna hölls vid 4 C i hela sorteringsförfarandet och färgades sedan för olika ytmarkörer, såsom beskrivits ovan. De sorterade cellerna representerade 0,21% 0,07% av Utgångspopulationen för Pbmc och var 72,89 6.21% ren. Endast 9a11 + celler inom den sorterade populationen analyserades ytterligare (Se Fig. 3B).
uttryck av hCLEC9A på BDCA3 + DC och en delmängd av CD14+CD16 – monocyter. A, RT-PCR-analys som visar uttryck av CLEC9A i de flesta vävnader, men främst i hjärnan, mjälten och tymus. B, med användning av en ny monoklonal antikropp (9A11), CLEC9A befanns uttryckas på en mindre population av PBMC (se kompletterande Fig. S4C), och celler som uttrycker denna receptor sorterades därför före analys med multicolor flödescytometri. Med användning av olika markörer befanns alla CLEC9A+-celler (gated) vara CD4+HLA – DR+CD11c+, och ytterligare analys indikerade att receptorn huvudsakligen uttrycktes på BDCA3+ dendritiska celler (59 10% av det), men också på en delmängd av CD64+CD11b+CD14+CD16 – monocyter (14 6% av det) och en tredje population av CD64+CD11b+ CD14 – CD16-celler (23 3%), som inte identifierades ytterligare. Uppgifterna som visas är representativa för data som erhållits från minst sex olika givare.
Endocytosanalyser-för endocytosanalyserna, transducerad NIH3T3 eller RAW264.7-celler pläterades vid 4-105-celler/brunn och 5-105-celler/brunn i 6-brunnsplattor dagen före experimentet. I början av analysen tvättades celler och blockerades sedan med PBS innehållande 5 mm EDTA, 10 mm NaN3, 0,5% BSA och 5% värmeinaktiverat kaninserum i 30 minuter vid 4 kg C. celler färgades med biotinylerad 9A11 eller anti-mdektin-1 (2A11; 10 kg/ml) och inkuberades i 50 minuter vid 4 kg C och tvättades därefter med FACS wash (PBS, 05% BSA, 10 mm NaN3 och 5 mm EDTA), för att avlägsna obunden antikropp. En tvärbindande får anti-mus antikropp (Jackson; 5 oc/ml) tillsattes och cellerna inkuberades i ytterligare 30 min vid 4 oc C. Efter tvättning i odlingsmedium för att avlägsna obunden sekundär antikropp och azid inkuberades cellerna i odlingsmedium för de tider som anges vid antingen 37 eller 4 oc C. cellerna färgades sedan med streptavidin-PE (BD Pharmingen) och undersöktes för återstående receptorytuttryck genom flödescytometri, såsom beskrivits ovan.
för mikroskopi, celler pläterades vid 2 105 105/brunn på glas täckglas i 6-brunnsplattor dagen före experimentet. Celler behandlades på samma sätt som för FACS-baserad analys, endast färgas med 9A11 för 1 h vid 4 C och därefter tvättas med FACS wash för att avlägsna obundet antikropp. Cellerna inkuberades i 30 minuter vid antingen 37 C eller 4 C i odlingsmedium. Efter inkubation fixerades cellerna i 1 ml fixativ (4% paraformaldehyd; 250 mm HEPES i dH2O) under 20 min. Aldehydgrupperna släcktes med PBS-glycin (25 mm glycinpulver i PBS) under 10 min och permeabiliserades sedan med 0,5% Triton X-100 under 20 min. Celler tvättades med 0,1% PBS-Tween och blockerades därefter med 0,5% Saponin i 20 minuter. Celler färgades med lampa – 1 (klon ID4B; utvecklingsstudier Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City) för 1 h vid rumstemperatur och tvättades med 0,1% PBS-Tween. Celler färgades sedan med donkey anti-mouse Cy3 och donkey Anti-rat Alexa488 (1:100 utspädning; båda från Jackson) i 50 minuter vid rumstemperatur och tvättades därefter med 0,1% PBS-Tween. Täckglas monterades med Vectashield (Vector Laboratories) och undersöktes med konventionell fluorescensmikroskopi på en Zeiss Axiovert 40. Bilder bearbetades med Adobe Photoshop version 6.0.
Zymosanbindnings—och Cytokinanalyser-RAW264.7 och nih3t3 transfektanter pläterades vid 5 104 celler/brunn i 24-brunnsplattor dagen före experimentet. Celler tvättades, lösliga sackarios-glukaner (glukanfosfat; en snäll gåva från David Williams, ETSU; 5 kg/ml) tillsattes där så var lämpligt, och cellerna inkuberades i 20 minuter vid 4 kg C för att tillåta hämning av Dectin-1 CRD (18). Efter tillsatsen av FITC-märkt zymosan (Invitrogen; 25 partiklar/cell) inkuberades celler vid 4 kcal C i 60 minuter för att tillåta bindning och tvättades sedan i stor utsträckning för att avlägsna obundna partiklar. För bestämning av TNF inkuberades raw264.7-celler i ytterligare 3 h, och mängden TNF som släpptes ut i supernatanterna bestämdes av ELISA (BD Biosciences). För att mäta zymosanbindning lyserades celler i 3% Triton X-100 (Sigma) och mängden bunden zymosan kvantifierades med fluorometri med användning av en Titertek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.).
för analys av de Syk-tillräckliga och Syk-bristfälliga B-cellerna stimulerades 2 206 106 transducerade cellerna med omärkta zymosan (Sigma; 1 partikel per cell) i 24-brunnsupphängningsplattor för 24 h vid 37 C. IL – 2 som utsöndras i supernatanterna kvantifierades av ELISA (BD Biosciences). Där indikerat, piceatennol (Sigma) inkluderades vid 50 kg.
Fagocytosanalyser—för att kvantifiera fagocytos genom flödescytometri, transducerade nih3t3 fibroblaster eller RAW264.7 makrofager såddes vid 2 msk 105 celler/brunn i 6-brunnsplattor dagen före experimentet. Vid behov förbehandlades celler med 5 kg cytokalasin D (Calbiochem) i 40 minuter vid 37 kg C, för att hämma fagocytos och bibehölls under hela analysen. Celler tvättades sedan och FITC-märkt zymosan tillsattes (1 partikel/cell) och tilläts binda i 1 h vid 4 kg C. Efter denna inkubation avlägsnades obundet zymosan genom tvättning och cellerna inkuberades vid 37 kg C under 2 timmar (NIH3T3-celler) eller 30 min (RAW264.7-celler) för att tillåta partikelupptag. Mängden internaliserad zymosan bestämdes sedan genom flödescytometri, som tidigare beskrivits (19). Kortfattat färgades extern zymosan med polyklonal kanin anti-zymosan (Invitrogen), som därefter detekterades med APC-märkta get-anti-kaninantikroppar (Invitrogen). Flödescytometrisk analys utfördes genom gating på FITC-positiva cellpopulationer, som hade bundit zymosan, och andelen internalisering bestämdes genom att jämföra APC-negativa (internaliserade partiklar) kontra APC-positiva (icke-internaliserade partiklar) cellpopulationer.
undersökningen av fagocytos genom immunofluoresensmikroskopi utfördes på liknande sätt, förutom att de transducerade cellerna såddes vid 3 104-celler/brunn på glasöverdrag, 10-partiklar per cell av FITC-märkt zymosan tillsattes och cellerna fick internalisera partiklarna i 45 min vid 37-C. Efter denna inkubation tvättades cellerna, fixerades med 4% paraformaldehyd och permeabiliserades med 0,25% Saponin i FACS-block för 30 min vid rumstemperatur. Aktin färgades med 1 kg tetrametylrhodamin isotiocyanat (TRITC)-märkt falloidin (Sigma). Täckglas monterades med Vectashield (Vector Laboratories) och undersöktes med konventionell fluorescensmikroskopi på en Zeiss Axiovert 40. Bilder bearbetades med Adobe Photoshop version 6.0.
Immunoprecipitations—1 Baccarat 107 RAW264.7 celler stimulerades med pervanadat i 1 min vid 37 Baccarat C, och cellerna lyserades i iskall lysbuffert (25 mm Tris, pH 8,0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1,1% Nonidet P-40, 10 mm NaF, 1 mm Na3VO4) med proteashämmare (Roche Applied Science). Kärnor och cellskräp avlägsnades genom centrifugering, och de återvunna supernatanterna tillsattes till streptavidinpärlor (Sigma), förkopplade med biotinylerade fosforylerade eller ofosforylerade peptider (25 kg). CLEC9A-peptiderna genererades kommersiellt (Sigma) och motsvarade följande region av receptorns cytoplasmatiska svans, 1mheeeiyrslqwd13. Dectin-1-peptiderna har beskrivits tidigare (11). Pärlorna roterades för 2 h vid 4 C och tvättades sedan, före analys av Western blotting. Proteiner i immunoprecipitaterna detekterades med anti-fosfotyrosin (klon 4G10) och anti-Syk eller anti-Lyn (Santa Cruz Biotechnology), följt av lämpliga pepparrotperoxidasbundna sekundära antikroppar (Jackson).