procedury eksperymentalne
komórki pierwotne, linie komórkowe i warunki wzrostu-komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) wyizolowano z buffy coats (Western Province Blood Transfusion Service, Kapsztad, RPA) przy użyciu Ficoll-Paque™ Plus (Amersham Biosciences), jak poprzednio opisano (14). Makrofagi pochodzące z monocytów i komórki dendrytyczne wytworzono z PBMC zgodnie z opisem (14). Fibroblasty NIH3T3 i HEK293T, RAW264.7 makrofagów, opartych na Hek293t linii komórek Phoenix ecotropic retroviral packaging (prezent od Dr Gary 'ego Nolana z Uniwersytetu Stanforda), linii komórek B z niedoborem Syk (C35) i odtworzonych syk (WT8) (15) utrzymano w zmodyfikowanej pożywce Eagle’ s Dulbecco lub pożywce Rpmi1640 (Cambrex) uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą (Invitrogen), 20 mm HEPES, 2 mm l-glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny (cambrex). Wszystkie komórki hodowano w temperaturze 37 °C w 5% CO2.
generacja konstrukcji i Transdukowanych linii komórkowych-kompletna otwarta ramka odczytu CLEC9A (ORF) została wyizolowana z ludzkiego cDNA PBMC metodą PCR i sklonowana do retrowirusowego wektora pFBneo (Stratagene) zawierającego znacznik HA (16) przy użyciu następujących starterów: AAAGAATTCCCACCACCACGAGGAAGAAATATAC i AAACTCGAGGACAGAGGATCTCAACGC. C-terminalnie oznaczony HA mysi CLEC9A (mCLEC9A) został podobnie sklonowany z mysiej śledziony cDNA przy użyciu następujących starterów; AAAGTCGACCACCATGCATGGGAAGAAATA i GTACTCGACGATGCAGGATCCAAATGC.
Chimera CLEC9A / Dectin-1 w pFBneo została wygenerowana przy użyciu nakładającego się rozszerzenia PCR z starterami CTGCTAAACTTTACAGAAACCCCACA i tctgggcttgtgttttttgtaaagtttagcag, tak że sekwencja została przetłumaczona jako CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84/Dectin-91NHKPTDectin-95. Konstrukt ekspresji Fc-CLEC9A został wygenerowany przez PCR przy użyciu następujących starterów; TTTGGTACCAGCAGCAAGAAAACCC i GCGGAATTCGACAGAGGATCTCAACGC i sklonowany do wektora pSecTag2 (Invitrogen) w górę od ludzkiego regionu FC IgG1, wygenerowanego zgodnie z opisem (17). Wierność wszystkich konstrukcji została zweryfikowana przez sekwencjonowanie. Ludzkie i mysie CLEC9A oraz izoformy zostały złożone w GenBank™ pod następującymi numerami akcesyjnymi: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mCLEC9Aß, EU339278; mCLEC9Ay, EU339279; mCLEC9Aδ, EU339280; mCLEC9Ae, EU339281.
aby wygenerować stabilne linie komórkowe, konstrukty Pakowano w wiruny, używając komórek Ekotropowych Phoenix opartych na HEK293T, a różne linie komórkowe były transdukowane zgodnie z wcześniej opisanym opisem (16). Wszystkie linie komórkowe zostały użyte jako populacje nieklonalne w celu zmniejszenia efektu założycielskiego i zostały wygenerowane i przetestowane co najmniej dwa razy w celu potwierdzenia fenotypu. W razie potrzeby linie komórkowe dobierano i utrzymywano w 0,6 mg/ml Genetycyny (G418) (Merck) lub 4 µg/ml puromycyny (Invitrogen).
ekspresję ludzkiego CLEC9A analizowano metodą PCR płyt cDNA tkanek ludzkich (Clontech) przy użyciu następujących starterów kodujących całe ORF, ATGCACGAGGAAGAAATATACACC i GACAGAGGATCTCAACGCATA. ekspresję mCLEC9A analizowano metodą PCR płyt cDNA tkanek myszy (Clontech) przy użyciu tych samych podkładów mysich opisanych powyżej. Jako kontrolę pozytywną zastosowano ekspresję G3PDH.
wytwarzanie przeciwciała monoklonalnego przeciwko CLEC9A-przeciwciału monoklonalnego (MAB), 9a11, specyficznego dla CLEC9A, zostało wytworzone przez immunizację myszy 129sv rozpuszczalnym białkiem fuzyjnym Fc-CLEC9A. Wytworzono hybrydomy NS1, a supernatanty z klonalnie rozcieńczonych komórek przesiewano metodą ELISA. MAb 9a11 (IgG1) został następnie wybrany na podstawie jego zdolności do działania w ELISA, cytometrii przepływowej i Western blotting, W niewykształconych warunkach.
Western Blotting i Deglikozylacja—w celu wytworzenia ekstraktów komórkowych, komórki przemyto PBS, a następnie lizowano w buforze Nonidet P-40 (1% Nonidet P-40, 0,15 m NaCl, 10 mm EDTA, 10 mm NaN3, 10 mm Tris-HCl, pH 8), uzupełniono inhibitorami proteazy (Roche Applied Science), przez 30 minut w temperaturze 4 °C. odłamki/jądra komórkowe usunięto przez odwirowanie, a supernatanty usunięto przez odwirowanie.zebrano i przechowywano w temperaturze -20 °C. stężenia białek ekstraktów komórkowych oznaczono metodą BCA (Pierce), a równe ilości białka prowadzono na żelach SDS-PAGE, zgodnie ze standardowymi protokołami. Po przeniesieniu do membran HybondC+ nitroceluloza (Amersham Biosciences), CLEC9A wykryto przez immunostaining 9a11 lub anty-HA (klon 16b12, Covance), a następnie przez kozą peroksydazę chrzanową (Jackson). Bloty zostały opracowane przy użyciu zestawu ECL-plus (Amersham Biosciences). Lizaty komórkowe deglikozylowano z Pngazą F i / lub o-glikozydazą (Roche Applied Science), zgodnie z opisem producenta.
przeciwciała, cytometria przepływowa i sortowanie komórek-komórki zbadano za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej na FASCCaliber (BD Biosciences), wykonanej zgodnie z konwencjonalnymi protokołami w temperaturze 4 °C w obecności 2 mm NaN3. Komórki były blokowane w PBS zawierającym 5 mm EDTA, 0,5% BSA i 5% inaktywowanej Cieplnie surowicy króliczej (komórki mysie) lub surowicy mysie (krew obwodowa) oraz 50 µg/ml ludzkich IgG (Sigma; hodowane in vitro komórki ludzkie i PBMC) przed dodaniem pierwotnych przeciwciał. Komórki utrwalano 1% formaldehydem, 0,25% BSA w PBS przed analizą.
aby wyizolować komórki 9a11+ do analizy, 30 milionów PBMC, wyizolowanych jak opisano powyżej, Zablokowano 5% surowicą mysią lub 50 µg/ml ludzkim IgG przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Następnie komórki barwiono biotynylowanym 9a11 mAb przez 30 minut w temperaturze 4 °C, a następnie streptawidyną-APC (BD Pharmingen), a komórki APC+ sortowano za pomocą FACSVantage S. E. (Beckton Dickinson). Posortowane komórki przechowywano w temperaturze 4 °C przez cały okres sortowania, a następnie barwiono na różne markery powierzchniowe, jak opisano powyżej. Sortowane komórki stanowiły 0,21% ± 0,07% populacji wyjściowej PBMCs i wynosiły 72,89 ± 6.21% czystości. Analizowano jedynie komórki 9A11+ w obrębie posortowanej populacji (patrz Fig. 3b).
ekspresja hCLEC9A na BDCA3 + DC i podgrupie CD14 + CD16 – monocytów. A, analiza RT-PCR pokazująca ekspresję CLEC9A w większości tkanek, ale głównie w mózgu, śledzionie i grasicy. B, stosując nowe przeciwciało monoklonalne (9a11), stwierdzono, że CLEC9A ulega ekspresji w mniejszej populacji PBMC (patrz uzupełniający Fig. S4C), a komórki wyrażające ten receptor sortowano przed analizą za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej. Stosując różne markery, jak wskazano, wszystkie komórki CLEC9A+ (gated) okazały się CD4+HLA-DR+CD11c+, a dalsza analiza wykazała, że receptor był głównie eksprymowany na komórkach dendrytycznych BDCA3+ (59 ± 10%), ale także na podgrupie CD64+CD11b+CD14+CD16 – monocytach (14 ± 6%) i trzeciej populacji komórek CD64+CD11b+ CD14 – CD16 (23 ± 3%).%), które nie zostały zidentyfikowane dalej. Przedstawione dane są reprezentatywne dla danych uzyskanych od co najmniej sześciu różnych dawców.
Endocytosis Assays – dla testów endocytozy, transduced NIH3T3 lub RAW264.7 komórek pokryto odpowiednio 4 × 105 komórek/studzienkę i 5 × 105 komórek/studzienkę w płytkach 6-studzienkowych dzień przed eksperymentem. Na początku testu komórki przemyto, a następnie Zablokowano PBS zawierającym 5 mm EDTA, 10 mm NaN3, 0,5% BSA i 5% inaktywowaną Cieplnie surowicę króliczą przez 30 minut w temperaturze 4 °C. komórki zabarwiono biotynylowaną 9A11 lub anty-mdektyną-1 (2A11; 10 µg/ml) i inkubowano przez 50 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przemyto wash FACS (PBS, 05% BSA, 10 mm NaN3 i 5 mm EDTA), do usunąć niezwiązane przeciwciało. Usieciowane przeciwciało Owcze przeciw myszom (Jackson; 5 µg/ml) dodano i komórki inkubowano przez kolejne 30 minut w temperaturze 4 °C. po przemyciu w pożywce hodowlanej w celu usunięcia niezwiązanego drugorzędowego przeciwciała i azydu, komórki inkubowano w pożywce hodowlanej w czasie wskazanym w temperaturze 37 lub 4 °C. Następnie komórki zabarwiono streptawidyną-PE (BD Pharmingen) i zbadano pod kątem ekspresji powierzchni receptora za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano powyżej.
dla mikroskopii, komórki platerowano z 2 × 105/studzienka na szklanych pokrywkach w 6-studzienkowych płytkach dzień przed eksperymentem. Komórki potraktowano tak samo jak w teście opartym na FACS, barwiono jedynie 9A11 przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, a następnie przemyto wash FACS w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Komórki inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37 °C lub 4 °C w pożywce hodowlanej. Po inkubacji komórki utrwalano w 1 ml utrwalacza (4% paraformaldehydu; 250 mm HEPES w dH2O) przez 20 minut. Grupy aldehydowe hartowano PBS-glicyną (25 mm proszek glicyny w PBS) przez 10 minut, a następnie przenikano 0,5% Tritonem X-100 przez 20 minut. Komórki przemyto 0,1% PBS-Tween, a następnie Zablokowano 0,5% saponiną przez 20 minut. Komórki barwiono LAMP – 1 (Klon ID4B; badania rozwojowe Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przemyto 0,1% PBS-Tween. Następnie komórki barwiono osłem anty-mysi Cy3 i osłem anty-szczurom Alexa488 (rozcieńczenie 1: 100; oba z Jacksona) przez 50 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyto 0,1% PBS-Tween. Coverslips zostały zamontowane za pomocą Vectashield (Vector Laboratories) i zbadane za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej na Axiovert 40 Zeissa. Obrazy były przetwarzane przy użyciu programu Adobe Photoshop w wersji 6.0.
testy wiązania Zymozanu i cytokin—TRANSFEKTANTY RAW264.7 i NIH3T3 powlekano przy 5 × 104 komórkach/studzience w płytkach 24-studzienkowych dzień przed eksperymentem. Komórki przemyto, w stosownych przypadkach dodano rozpuszczalne β-glukany (fosforan glukanu; rodzaj daru od Davida Williamsa, ETSU; 5 µg/ml) i komórki inkubowano przez 20 minut w temperaturze 4 °c, aby umożliwić hamowanie Dektyny-1 CRD (18). Po dodaniu zymozanu znakowanego FITC (Invitrogen; 25 cząstek/komórkę), komórki inkubowano w temperaturze 4 °C przez 60 minut, aby umożliwić Wiązanie, a następnie intensywnie przemyto w celu usunięcia niezwiązanych cząstek. W celu oznaczenia TNF komórki RAW264. 7 inkubowano przez kolejne 3 godziny, a ilość TNF uwalnianego do supernatantów oznaczano metodą ELISA (BD Biosciences). Do pomiaru wiązania zymosanu komórki lizowano w 3% Triton X-100 (Sigma), a ilość związanego Zymosanu oznaczano ilościowo za pomocą fluorometrii za pomocą Titertek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.).
do analizy limfocytów B z niedoborem Syk i Syk stymulowano 2 × 106 transdukowanych komórek nieoznakowanym zymosanem (Sigma; 1 cząsteczka na komórkę) w 24-studzienkowych płytkach zawieszających przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. IL-2 wydzielaną do supernatantów oznaczano ilościowo za pomocą testu ELISA (BD Biosciences). Tam, gdzie wskazano, piceatennol (Sigma) był zawarty w 50 µm.
testy fagocytozy—w celu ilościowego określenia fagocytozy za pomocą cytometrii przepływowej, transdukowane fibroblasty NIH3T3 lub makrofagi RAW264.7 wysiewano w 2 × 105 komórek/studzienkę w płytkach 6-studzienkowych dzień przed eksperymentem. W razie potrzeby komórki poddawano wstępnej obróbce cytochalazyną D (Kalbiochem) o wielkości 5 µm przez 40 minut w temperaturze 37 °C w celu zahamowania fagocytozy i utrzymywano ją przez cały czas trwania testu. Komórki następnie przemyto i dodano zymosan znakowany FITC (1 cząsteczka / komórka) i pozostawiono do wiązania przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Po tej inkubacji niezwiązany zymosan usunięto przez przemywanie, a komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny (komórki NIH3T3) lub 30 minut (komórki RAW 264,7), aby umożliwić pobór cząstek. Ilość zinternalizowanego zymosanu oznaczono następnie za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej (19). Krótko mówiąc, zewnętrzny zymosan został zabarwiony poliklonalnym króliczym antyzymozanem (Invitrogen), który następnie został wykryty za pomocą znakowanych APC kozich przeciwciał przeciw królikom (Invitrogen). Analiza cytometryczna przepływowa została przeprowadzona przez bramkowanie na populacjach komórek FITC-dodatnich, które wiązały zymosan, a procent internalizacji określono przez porównanie APC-ujemnych (zinternalizowane cząstki) z APC-dodatni (niezinternalizowane cząstki) populacje komórek.
badanie fagocytozy za pomocą mikroskopii immunofluoresencyjnej przeprowadzono podobnie, z wyjątkiem tego, że komórki transdukowane wysiewano w temperaturze 3 × 104 komórek/studzienkę na szklanych pokrywach, Dodano 10 cząstek na komórkę zymozanu znakowanego FITC i komórki umożliwiono internalizację cząstek przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Po tej inkubacji komórki przemywano, utrwalano 4% paraformaldehydem i przenikano 0,25% saponiną w blok FACS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aktynę zabarwiono 1 µm izotiocyjanianem tetrametylorodaminy (TRITC) oznaczoną falloidiną (Sigma). Coverslips zostały zamontowane za pomocą Vectashield (Vector Laboratories) i zbadane za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej na Axiovert 40 Zeissa. Obrazy były przetwarzane przy użyciu programu Adobe Photoshop w wersji 6.0.
Immunoprecypitacje-1 × 107 RAW264.7 komórki stymulowano perwanadatem przez 1 min w temperaturze 37 °C, a komórki lizowano w lodowatym buforze do lizy (25 mm Tris, pH 8,0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1,1% Nonidet P-40, 10 mm Naf, 1 mm Na3vo4) inhibitorami proteazy (Roche Applied Science). Jądra i resztki komórek usunięto przez odwirowanie, a odzyskane supernatanty dodano do paciorków streptawidyny (Sigma), wstępnie zmontowanych biotynylowanymi fosforylowanymi lub niefosforylowanymi peptydami (25 µm). Peptydy CLEC9A były generowane komercyjnie (Sigma) i odpowiadały Następującemu regionowi cytoplazmatycznego ogona receptora, 1MHEEEIYRSLQWD13. Peptydy Dektyny-1 zostały opisane wcześniej (11). Kulki obracano przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie przemyto, przed analizą metodą Western blotting. Białka w immunoprecypitatach wykryto przeciw fosfotyrozynie (klon 4g10) i przeciw Syk lub przeciw Lyn (Biotechnologia Santa Cruz), a następnie odpowiednie przeciwciała wtórne związane z peroksydazą chrzanową (Jackson).