eläinlääketieteellinen mikrobiologia
Clostridium chauvoei-bakteerin tunnistaminen mustalakkiviljelmien kliinisistä näytteistä, PCR: llä –
Clostridium chauvoei-bakteerin tunnistaminen materiaalien ja kliinisten tapausten alueilla turkoosiin, PCR: n käyttö
pyhä miyashiroi,* A. F. C. NASSARI; M. C. A., M. SOUZAI, J. B. CARVALHOI; J. E. B. AdegasII
IInstituto Biológico, São Paulo, SP, Brasil
IIMato Grosso do Sul, Brasil
ABSTRACT
C. chauvoei-esiintyminen havaittiin polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla, joka saatiin viljelmän supernatantista kypsennetystä lihanäytteestä, joka koostui seitsemästä mustalegaoireista kärsivästä vasikasta. Yhden lihasnäytteen eristäminen anaerobisissa olosuhteissa paljasti Clostridium perfringens-bakteerin puhtaassa viljelmässä.
avainsanat: Clostridium chauvoei; blackleg; bovine; PCR.
Abstrakti
Clostridium chauvoei-bakteerin esiintyminen havaittiin PCR-reaktiolla kypsennetystä lihaviljelmästä, jossa oli maksa -, lihas-ja jalkapöydän luuydinnäytteitä seitsemältä oireisen karbunkle-bakteerin sairastamalta vasikalta. Lihasnäytteen eristäminen anaerobisissa olosuhteissa paljasti Clostridium perfringens-bakteerin puhtaassa viljelmässä.
asiasanat: Clostridium chauvoei, symptomaattinen carbuncle, bovine, PCR.
Clostridium spp kuuluu anaerobisten bakteerien ryhmään, jolla on huomattava lääketieteellinen ja taloudellinen merkitys. Klostridioosi on yleisnimitys monille tämän suvun bakteerien aiheuttamille sairauksille, joita voi esiintyä missä tahansa ruumiinosassa, joka tarjoaa edellytykset niiden kehittymiselle ja siitä johtuvalle toksiinin tuotannolle lisääntymisen aikana (1).
Clostridium chauvoei on naudoilla, lampailla ja muilla märehtijöillä esiintyvän mustalakan ja pahanlaatuisen turvotuksen aiheuttaja (4). Karjan mustalevä on endogeeninen infektio, joka ei ole sisäsyntyinen, ja huomattava osa nautaeläimistä saattaa kantaa C. chauvoei-bakteeria maksassaan. Sairastuneet eläimet ovat anorektinen, masentunut, kuumeinen, ja lame (toinen puoli osa), esittää kuuma, kivulias turvotus, joka tulee kylmä, edematous crepitation. Kuolema nähdään 12-48 tunnin kuluessa. Tämä aine näyttää suosivan suuria lihaksia (reisi, pallea ja sydän), jotka ruumiinavauksessa ovat tummia, punaisia, kuivia ja sienimäisiä (11). Mustaleppää muistuttavia oireita voivat aiheuttaa myös Clostridium septicum,C. novyi,C. perfringens tai C. sordellii. C. chauvoein ja C. septicumin fylogeneettistä asemaa niiden 16S rRNA-geenisekvensseissä koskevassa tuoreessa tutkimuksessa määritettiin 99,3%: n samankaltaisuus C. chauvoein ja C. septicumin rrs-geenien välillä, mikä näkyy myös fenotyyppisellä tasolla (7,8).
vaikka mustalepeen ja pahanlaatuisen turvotuksen ennakko-diagnoosi riippuu kliinisistä ja patologisista löydöksistä, taudin varmistaminen tapahtuu tyypillisesti eristämällä ja tunnistamalla organismi, kuten toksiinin tuotanto ja immunologiset menetelmät (9,13). Nämä diagnostiset menetelmät ovat kuitenkin aikaa vieviä ja työläitä. Lisäksi immunologiset menetelmät voivat tuottaa epäselviä tuloksia, koska C. chauvoei-ja C. septicum-bakteereilla on useita yhteisiä antigeenejä (4).
bakteerin genomin tietyn kohdealueen Nukleiinihappovahvistusta polymeraasiketjureaktiolla (PCR) on käytetty laajalti havaitsemis-ja diagnosointitarkoituksiin (15). PCR: n kyky monistaa DNA: ta erityisesti alhaisista bakteerimääristä sekä sen yksinkertaisuus, nopeus ja toistettavuus tarjoavat etuja tavanomaisiin tunnistusmenetelmiin verrattuna, ja sitä on itse asiassa käytetty monien Clostridium-lajien, kuten C. chauvoei-lajin, tunnistamiseen puhtaissa viljelmissä ja kliinisissä näytteissä (5,7,12,14). Tarkka diagnoosi mustalangasta on siksi usein vaikea. Standardidiagnoosi perustuu immunofluoresenssimääritykseen ja morfologisiin kriteereihin.
tässä asiakirjassa kuvataan PCR-menetelmään perustuvaa menetelmää, joka on tehty ennen rikastamista kypsennetyssä lihanäytteessä mustalakkivasikoista C. chauvoei-vasikoiden tunnistamiseksi. Brasilian syksyn aikana mustalakkioireita esittäneiden vasikoiden maksa -, lihas-ja jalkapohjien luuydinnäytteet analysoitiin. Kerätyt näytteet olivat kuudesta lauman vasikasta São Paulon osavaltiosta ja yhdestä vasikasta Mato Grosso do Sulin osavaltiosta (Taulukko 1). Kaikki nämä naudat kuolivat äkillisesti, ja esiintyi lihas crepitation posterior raaja.
maksa-ja lihasnäytteistä ja luuydinnäytteistä Maseroitu aine inokuloitiin putkiin kypsennetyllä lihaliuoksella (Difco®), joka juuri ennen altistettiin lämpöshokille (100ºc 10 minuutin ajan välittömästi jäähdytettynä virtaavaan veteen), minkä jälkeen sitä inkuboitiin 37ºC: ssa 48 tuntia. Kymmenen mikrolitraa kypsennettyä lihaliuosta viljeltiin 5-prosenttisessa lampaanveriagarissa, ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 48 tuntia anaerobisissa olosuhteissa. Kolonioille, joilla oli tunnusomainen muoto, aspekti, väri ja hemolyysi, tehtiin gramvärjäys morfologista ja soluseinän määritystä varten. Epäilyttäville isolaateille tehtiin katalaasi -, lesitinaasi -, gelatinaasi -, glukoosi -, laktoosi-ja myrskyisä maidon koagulaatiokokeet bakteerien sukupuolen ja lajin tunnistamiseksi.
Guanidiinityosianaattipohjainen tekniikka (2) saatiin aikaan DNA: n uuttamiseksi putkien supernatantista kypsennetyllä lihaliuoksella. Yksi millilitra kutakin putkea sentrifugoitiin 13000 x g: n tarkkuudella 20 minuutin ajan, ja sakka suspendoitiin uudelleen 200 µL: aan Tris-EDTA-puskuria ennen uuttoprotokollaa. Multiplex PCR suoritettiin alukkeilla suunniteltu flagelin geeni (fliC), kuvattu SASAKI et al. (10), Clostridium chauvoei ja Clostridium septicum, jotka vahvistavat vastaavasti 535 emäsparia (bp) ja 294 bp. Forward primer flaf on yleinen molemmilla lajeilla ja flachr ja FlaseR ovat vastaavasti C. chauvoein ja C. septicumin käänteisalkuperä. DNA: n amplifikaation kokonaistilavuus oli 50 µL, jossa oli 200 µM kutakin dNTP: tä, 5 µL 10x reaktiopuskuria, 2,5 mM MgCl2, 30 pmol kutakin primeria (FlaF – 5′ AGAATAACAGAA GCTGGAGATG 3′ , FlachR – 5′ TACTAGCAGCAAT GTACC 3′ ja Flase R – 5′ TTTATTGAATTGTGAAG 3′), 1,25 U Taq-polymeraasia ja 10 µl DNA: ta. Vahvistuksessa käytimme kolmeakymmentä sykliä, jotka jaettiin kolmeen vaiheeseen seuraavasti: denaturointi 94ºc: ssa 60 sekuntia, hybridisaatio 56ºc: ssa 60 sekuntia ja laajennus 72ºC: ssa 60 sekuntia. PCR-positiivisina kontrolleina käytettiin C. chauvoei IB 1559: ää ja C. septicum 10518: aa (Instituto Biológico-kantoja), ja normaalin lehmän lihasnäytettä PCR-negatiivisena kontrollina.
PCR: ää levitettiin myös suoraan kliinisistä näytteistä (maksa -, lihas-ja luuydinnäytteistä) käyttäen samoja DNA: n poisto-ja vahvistusprotokollia kuin edellä mainittiin. Amplifioinnit suoritettiin Peltier Thermal Cycler-100-tutkimuksessa (MJ-tutkimus) ja monistettujen tuotteiden analyysi suoritettiin elektroforeesillä agaroosigeelissä, joka oli 1,3% värjätty etidiumbromidilla.
Gram-värjäys kypsennetystä lihaväliaineesta, johon oli istutettu epäillyt näytteet, osoitti useimmissa näytteissä (maksa 1, Lihakset 1,2 ja 7 sekä luuvarret 3,4 ja 5) pieniä grampositiivisia sauvoja, joissa oli subterminaalisia itiöitä, muita enemmän. Kuitenkin vain lihas 7 näyte eristettiin Clostridium perfringens puhtaassa viljelmässä, ja, kasvua ei havaittu muissa näytteissä levyt inkuboidaan anaerobisissa olosuhteissa. Kliinisistä näytteistä saatu Multiplex PCR ei tuottanut positiivisia tuloksia C. chauvoei-eikä C. septicum-bakteereille. Samoilla näytteillä inokuloidun kypsennetyn liha-aineen supernatantin aiheuttamassa reaktiossa seitsemän oli kuitenkin positiivinen C. chauvoei-bakteerille ja negatiivinen C. septicum-bakteerille (maksa 1, Lihakset 1,2 ja 7, luuvarret 3,4 ja 5), kuten taulukosta 1 ilmenee.
C. chauvoein ja C. septicumin läheinen fylogeneettinen suhde on molekylaarinen heijastus näiden eliöiden fenotyyppisestä samankaltaisuudesta. C. chauvoei on suhteellisen vaikea erottaa C. septicumista, ja lisäksi C. septicum voi aiheuttaa hyvin samanlaisia oireita kuin mustalakkioireet (6,9).
GREGORY ym. (3) ilmoitettu naudan esiintymisestä ja hoidosta mustallegilla ja suurilla peniciliiniannoksilla. Diagnoosi tehtiin eristämällä C. chauvoei myonekroosialueen näytteestä ja rokottamalla marsut sen tunnistamiseksi.
KUHNERT ym. (7) raportoitu järjestelmä erottaa C. chauvoei ja C. septicum, kuitenkin, se vaatii rajoittamista entsyymin pilkkomista PCR tuotteiden lopullista tunnistamista organismin, koska pieni ero 16S rRNA geenin molempien bakteerien.
tuloksemme osoittavat, että Flic-geeniin (10) perustuva Multiplex PCR-reaktio oli tehokas tunnistamaan C. chauvoei-bakteerin luonnollisesti infektoituneista näytteistä, jotka on viljelty kypsennetyssä lihaväliaineessa ja joissa on saatu aikaan GUANIDIINITIOSYANAATTI DNA: n erottamista varten, ja erottamaan tämä laji C. septicumista. Suoraan kudosnäytteistä saadut PCR-tulokset olivat kuitenkin negatiivisia, mikä johtui todennäköisesti clostridial-mikrorganismien vähäisestä määrästä tai tehottomasta DNA: n uuttamisprotokollasta.
C. chauvoei-bakteerin eristäminen on hyvin vaikeaa, koska se vaatii kovia anaerobisia olosuhteita, ja kliiniset näytteet ovat usein muiden anaerobisten bakteerien saastuttamia, mukaan lukien clostridia maaperässä, jotka kasvavat nopeammin kuin C. chauvoei viljelyaineessa (9). Lihas 7: n mikrobiologisessa viljelmässä Clostridium perfringens eristettiin puhtaassa viljelmässä anaerobisissa olosuhteissa. Laji voi olla mukana myös mustalakkitapauksissa, ja tässä tutkimuksessa se voisi liittyä C. chauvoei-sukuun. Joka tapauksessa, jos tässä tapauksessa olisi käytetty vain mikrobiologisia menetelmiä, mustalakkidiagnoosi olisi väärä tai puutteellinen. Clostridial-rokotteet antavat hyvän immuniteetin clostridial-tauteja vastaan, ja kun diagnoosi on oikea, tauti on helppo saada hallintaan. Tätä varten kliiniset näytteet on kerättävä asianmukaisesti ja niille on tehtävä laboratoriotutkimus. Kun kaikki klostridiasta johtuvat sairaudet voidaan ehkäistä rokottamalla, jos ongelma jatkuu rokotuksesta huolimatta, diagnoosin on oltava väärä. Lisäksi tapauskuvaus on erittäin tärkeää laboratorisen analyysin (1) suorittamiseksi.
Clostridia microrganisms-bakteerin aiheuttamat infektiot aiheuttavat huomattavia tuotannon menetyksiä, kun hoito ei yleensä ole käytännössä mahdollista. Torjuntaan ja ennaltaehkäisyyn on kuuluttava riittävät toimenpiteet parven käsittelemiseksi ja sistemaattiseksi rokottamiseksi, koska eläimet ovat jatkuvassa kosketuksessa taudinaiheuttajiin ja tekijöihin, jotka voivat vapauttaa taudit.
C. chauvoei-bakteerin nukleiinihapon osoittaminen luonnollisesti infektoituneiden näytteiden aiemmasta väkevöinnistä kypsennetyssä lihanesteessä selvensi näiden kahden brasilialaisen mustalakkipurkauksen diagnoosia, joka ei yleensä ole varma mikrobiologisen viljelmärajoituksen vuoksi. Lisäksi PCR-tekniikan suuren spesifisyyden vuoksi marsujen käyttöä taudinaiheuttajan tunnistamiseksi vältettiin.
1. Baldassi, L. (2005). Clostridial toksiinit voimakkaita myrkkyjä, voimakkaita lääkkeitä. J. Venom. Animia. Myrkkyseula. Trop. Tämä., 11(4), 391-411.
2. Boom, R.; Sol, C. J. A.; Salimans, M. M. M.; Jansen, C. L.; Werthein-Van-Dilen, P. M. E.; Noordaa Van Der J. (1990). Nopea ja yksinkertainen menetelmä nukleiinihappojen puhdistukseen. J. Clin. Mikrobi., 28, 495-503.
3. Gregory, L.; Della Libera, A. M.; Birgel Junior, E. H.; Pogliani, F. C.; Birgel, D. B.; Benesi, F. J.; Miyashiro, S.; Baldassi, L. (2006). Oireenmukainen karbunkle: manqueirasta kärsivien nautojen esiintyminen, kliininen kehitys ja toipumisen seuranta. Arq. Inst. Biol., 73(2), 243-246.
4. Hamaoka, T.; Terakado, N. (1994). Yhteisten antigeenien osoittaminen Clostridium chauvoei-ja Clostridium septicum-solujen pinnalla epäsuoralla immunofluoresenssimäärityksellä. J. Vet. Med. Sci., 56, 371-373.
5. Kojima, A.; UIDA, I.; Sekiaki, T.; Sasaki, Y.; Ogikubo, Y.; Tamura, Y. (2001). Clostridium chauvoei-bakteerin nopea havaitseminen ja tunnistaminen PCR: llä flagelliinigeenisekvenssin perusteella. Eläinlääkäri. Mikrobi., 78, 363-371.
6. Kuhnert, P.; Capaul, S. E.; Nicolet, J.; Frey, J. (1996). Clostridium chauvoein ja Clostridium septicumin fylogeneettiset kannat, jotka perustuvat 16S rRNA-geenisekvensseihin. Int. J. Syst. Batt., 46(4), 1174-1176.
7. Kuhnert, P.; Krampe, M.; Capaul, S. E.; Frey, J.; Nicolet, J. (1997). Clostridium chauvoei-bakteerin tunnistaminen blackleg-viljelmistä ja kliinisestä materiaalista PCR: n avulla. Eläinlääkäri. Mikrobi., 51, 291-298.
8. Moussa, J. (1959). Antigeeniset valmisteet Clostridium septicum-ja Clostridium chauvoei-bakteereille.J. Path. Bac., 7, 341-350.
9. Sasaki, Y.; Kojima, A.; Aoki, Hiroshi; Ogikubo, Y.; Takikawa, N.; Tamura, Y. (2002). Clostridium chauvoei -, Clostridium haemolyticum -, Clostridium novyi-tyyppien A ja B ja Clostridium septicum fylogeneettinen analyysi ja PCR-osoittaminen flagelliinigeenin perusteella. Eläinlääkäri. Mikrobi., 86, 257-267.
10. Sasaki, Y.; Yamamoto, K.; Kojima, A.; Norimatsu, M.; Tamura, Y. (2000). Patogeenisen klostridin nopea tunnistaminen ja erottelu kaasukuoliossa polymeraasiketjureaktiolla 16S-23s rDNA-spacer-alueen perusteella. Res. Vet. Sci., 69, 289-294.
11. Sippel, W. L. (1982). Clostridial-sairauksien diagnoosi. J. Am. Eläinlääkäri. Med. Assoc., 161, 1299-1305.
12. Uzal, F. A.; Plumb, J. J.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1997). Eri toksiineja tuottavan Clostridium perfringens-bakteerin osoittaminen vuohien faecessa PCR-menetelmällä. Lett. Sovellus. Mikrobi., 25, 339-344.
13. Vanelli, Sa; Uzal, F. A. (1996). Clostridium septicum-detektio peroksidaasi-antiperoksidaasi-menetelmällä (PAP) formaliinikiinnitetyissä, parafiiniin upotetuissa lampaan kudoksissa. Kaari. Med. Eläinlääkäri., 28, 125-127.
14. Warren, A. L.; Uzal, F. L.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1998). PCR-detektio Clostridium perfringens tyyppi D: n osoittamiseksi formaliinikiinnitetyistä, parafiiniin upotetuista vuohien ja lampaiden kudoksista. Lett. Sovellus. Mikrobi., 29, 15-19.
15. Whelen, a. c.; persing, d.h. (1996). Nukleiinihapon monistamisen ja toteamisen rooli kliinisen mikrobiologian laboratoriossa. Ann. Pastori Microb., 50, 349-373.