VETERINÆR MIKROBIOLOGI
Identifikasjon Av Clostridium chauvoei i kliniske prøver av kulturer fra blackleg-tilfeller, VED HJELP AV PCR –
Identifikasjon Av Clostridium chauvoei innen materialer og kliniske tilfeller til turkis, er det symptomatisk å bruke PCR
st miyashiroi,* a. f. c. NASSARI; M. C. A., M. SOUZAI, J. B. CARVALHOI; j. e. b. AdegasII
IInstituto Bioló, Sã Paulo, SP, Brasil
Iimato Grosso do Sul, Brasil
ABSTRAKT
C. chauvoei-tilstedeværelse ble påvist ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) FRA supernatant av kultur i kokt kjøttmedium av lever -, muskel-og metatarsian benmargsprøver av syv kalver med blackleg-symptomer. Isoleringen under anaerobe forhold i en muskelprøve avslørte Clostridium perfringens i ren kultur.
Nøkkelord: Clostridium chauvoei; blackleg; storfe; PCR.
abstract
Tilstedeværelsen Av Clostridium chauvoei ble påvist VED PCR reaksjon fra kokt kjøtt medium kultur av lever, muskel og metatarsal benmarg prøver fra syv kalver påvirket av symptomatisk carbuncle. Isolering av en muskelprøve under anaerobe forhold avslørte Clostridium perfringens i ren kultur.
nøkkelord: Clostridium chauvoei, symptomatisk karbunkel, bovin, PCR.
Clostridium spp er en av slektene som utgjør gruppen av anaerobe bakterier av betydelig medisinsk og økonomisk betydning. Clostridiosis er det generelle navnet gitt til en rekke sykdommer forårsaket av bakteriene i denne slekten, som kan forekomme i hvilken som helst del av kroppen som gir tilstand for deres utvikling med påfølgende toksinproduksjon under multiplikasjon (1).
Clostridium chauvoei er den utløsende agent for blackleg og ondartet ødem hos storfe, sau og andre drøvtyggere (4). Blackleg hos storfe er en ikke-traumatisk endogen infeksjon, og en betydelig andel av storfe kan ha C. chauvoei i leveren. Berørte dyr er anorektiske, deprimerte, febrile og lame (en side lem), og presenterer en varm, smertefull hevelse som blir kald, edematøs med krepitasjon. Døden ses innen 12 til 48 timer. Denne agenten ser ut til å ha en preferanse for store muskler (lår, membran og hjerte), som ved nekropsy er mørke, røde, tørre og svampete (11). Symptomer som ligner blackleg kan også være forårsaket Av Clostridium septicum, c. novyi, C. perfringens eller C. sordellii. I en nylig studie på fylogenetisk posisjon Av C. chauvoei og c. septicum på deres 16s rrna gen (rrs) sekvenser, en likhet på 99,3% mellom rrs gener Av C. chauvoei Og c. septicum som også reflekteres på fenotypisk nivå, ble bestemt (7,8).
mens presuntiv diagnose av blackleg og malignt ødem avhenger av kliniske og patologiske funn, er bekreftelsen av sykdom vanligvis funnet ved å isolere og identifisere organismen, for eksempel toksinproduksjon og immunologiske metoder (9,13). Imidlertid er disse diagnostiske metodene tidkrevende og arbeidskrevende. I tillegg kan immunologiske metoder gi tvetydige resultater fordi C. chauvoei og C. septicum har forskjellige antigener til felles (4).
Nukleinsyreforsterkning av en bestemt målregion av bakteriegenomet ved polymerasekjedereaksjon (PCR) har vært mye brukt for deteksjon og diagnose formål (15). PCRS evne til å forsterke DNA spesifikt fra lavt antall bakterier, samt dens enkelhet, hurtighet og reproduserbarhet, gir fordeler i forhold til konvensjonelle metoder for identifikasjon, og har faktisk blitt brukt til å identifisere Mange Clostridium-arter, inkludert C. chauvoei i rene kulturer og i kliniske prøver (5,7,12,14). En nøyaktig diagnose av blackleg er derfor ofte vanskelig. Standarddiagnose er basert på en immunfluorescerende analyse og på morfologiske kriterier.
i dette papiret beskriver vi EN PCR-basert metode fra tidligere anrikning i kokt kjøttmedium av prøver fra kalver med blackleg for å identifisere C. chauvoei. Lever -, muskel-og metatarsiske benmargsprøver fra kalver som presenterte blackleg-symptomer under brasiliansk høst ble analysert. De innsamlede prøvene var fra seks kalver av en flokk Fra Sã Paulo State og en kalv Fra Mato Grosso do sul State (Tabell 1). Alle disse oksene døde plutselig, og presenterte muskelkrepitasjon i bakre lem.
Macerated av lever-og muskelprøver og benmargspinner ble inokulert i rør med kokt kjøttmedium (Difco ®) som rett før ble utsatt for termisk sjokk (100º I 10 minutter umiddelbart avkjølt i nåværende vann), og ble deretter inkubert VED 37º i 48 timer. Ti mikroliter kokt kjøttmedium ble dyrket i 5% saueblodagar og inkubert VED 37º i 48 timer under anaerobe forhold. Kolonier med karakteristisk form, aspekt, farge og hemolyse ble utsatt For Gramfarging for morfologisk og cellulær veggbestemmelse. Mistenkte isolater ble sendt til katalase -, lecitinase -, gelatinase -, glukose -, laktose-og tumultuøse melkekoagulasjonstester for identifisering av bakterielt kjønn og arter.
Guanidintyocianatbasert teknikk (2) ble oppnådd FOR DNA-ekstraksjon fra supernatant av rør med kokt kjøttmedium. En mL av hvert rør ble sentrifugert ved 13000 x g i 20 minutter, og pelleten ble resuspendert i 200 µ Av Tris-EDTA buffer før ekstraksjonsprotokollen. Multiplex PCR ble utført med primere designet for flagelin gen (fliC), beskrevet AV SASAKI et al. (10), spesifikt For Clostridium chauvoei og Clostridium septicum, som forsterker henholdsvis 535 basepar (bp) og 294 bp. Den fremre primeren FlaF er vanlig for begge arter Og FlachR Og FlaseR er omvendt primere for Henholdsvis C. chauvoei og c. septicum. Forsterkning AV DNA ble utført i et totalt volum på 50 µ, med 200 µ av hver dNTP, 5 µ 10X reaksjonsbuffer, 2,5 mM MgCl2, 30 pmol av hver primer (FlaF – 5′ AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG 3′ , FlachR – 5′ TTTAGCAGCATCAAAT GTACC 3′ og Flase R – 5′ TTTATTGAATTGTGTTGTGAAG 3′), 1,25 u taq polymerase og 10 µ av dna. For forsterkning brukte vi tretti sykluser delt i tre faser som følger: denaturering VED 94 HRYVNIAS i 60 sekunder, hybridisering VED 56 HRYVNIAS i 60 sekunder og forlengelse VED 72 HRYVNIAS i 60 sekunder. C. chauvoei ib 1559 og c. septicum 10518 (Instituto Bioló Stammer) ble brukt SOM PCR-positive kontroller, og muskelprøve fra en normal ku ble brukt SOM PCR-negativ kontroll.
PCR ble også brukt direkte fra kliniske prøver (lever, muskel og benmarg) ved bruk av SAMME DNA-ekstraksjon og amplifikasjonsprotokoller som nevnt ovenfor. Amplifikasjoner ble utført I En Peltier Thermal Cycler – 100 (Mj Research) og analysen av de forsterkede produktene ble utført ved elektroforese i agarosegel 1,3% farget med etidiumbromid.
Gram flekk av kokt kjøtt medium inokulert med de mistenkte prøvene viste små gram-positive stenger med subterminal sporer i de fleste prøvene (lever 1, muskler 1,2 og 7 og bein marger 3,4 og 5), utover andre. Imidlertid ble Bare I muskel 7-prøven isolert Clostridium perfringens i ren kultur, og ingen vekst ble observert i de andre prøveplatene inkubert under anaerobe forhold. Multiplex PCR fra kliniske prøver viste ikke noe positivt resultat verken For C. chauvoei eller c. septicum. Men i reaksjonen fra supernatant av kokt kjøtt medium inokulert med de samme prøvene, syv av dem var positive Til C. chauvoei og negative Til c. septicum (lever 1, muskler 1,2 og 7, bein marger 3,4 og 5), som vist i Tabell 1.
det nære fylogenetiske forholdet Mellom C. chauvoei Og c. septicum er en molekylær refleksjon av fenotypisk likhet av disse organismer. C. chauvoei er relativt vanskelig å skille Fra c. septicum, og Dessuten Kan C. septicum forårsake symptomer som ligner på blackleg symptomer (6,9).
GREGORY et al. (3) rapportert forekomst og behandling av et storfe med blackleg med høye doser penicilin. Diagnosen ble oppnådd ved å isolere C. chauvoei fra en vattpinne av myonekroseområdet og marsvin-inokulering for identifikasjon.
KUHNERT et al. (7) rapportert et system for å skille C. chauvoei Og c. septicum, men det krever begrensning av enzym fordøyelsen AV PCR produkter for definitiv identifisering av organismen på grunn AV den lille forskjellen I 16s rRNA genet av begge bakterier.
våre resultater viser at multiplex PCR-reaksjon basert på fliC-gen (10) var effektiv for å identifisere C. chauvoei fra naturlig infiserte prøver dyrket i kokt kjøttmedium som utfører guanidintiocyanat FOR DNA-ekstraksjon, og skiller denne arten fra C. septicum. PCR-resultater direkte fra vevsprøver var imidlertid negative, sannsynligvis på grunn av det lave antallet clostridiale mikrorganismer, eller ineffektiv DNA-ekstraksjonsprotokoll.
isoleringen Av C. chauvoei er svært vanskelig, siden det krever harde anaerobe forhold, og kliniske prøver blir ofte forurenset med andre anaerobe bakterier, inkludert clostridia i jord, som vokser raskere Enn C. chauvoei i et kulturmedium (9). Mikrobiologisk kultur av muskel 7 avslørte Clostridium perfringens isolert i ren kultur under anaerobe forhold. Denne arten kan også være involvert i blackleg-tilfeller, og i den nåværende studien kan Den være forbundet Med C. chauvoei. Uansett, hvis bare mikrobiologiske metoder hadde blitt brukt i dette tilfellet, ville blackleg-diagnosen være feil eller ufullstendig. Clostridial vaksiner gir en høy grad av immunitet mot clostridial sykdommer, og når diagnosen er riktig, kan sykdommen lett kontrolleres. For dette må kliniske prøver samles inn og underkastes laboratorieundersøkelse. Når alle sykdommer på grunn av clostridia kan forebygges ved vaksinasjon, hvis problemet fortsetter til tross for vaksinasjon, må diagnosen være feil. Videre er en saksbeskrivelse av fundamental betydning for å gjennomføre laboratorieanalyse (1).
Infeksjoner på grunn av clostridia mikrorganismer forårsaker betydelige tap i produksjonen, når behandlingen generelt er upraktisk. Kontroll og forebygging må omfatte tilstrekkelige tiltak for håndtering og sistematisk vaksinering av flokken, siden dyrene er i permanent kontakt med agensene og de faktorene som vil kunne fjerne sykdommene.
Påvisning av nukleinsyre Av C. chauvoei fra tidligere anrikning av naturlig infiserte prøver i kokt kjøttmedium belyste diagnosen i disse to brasilianske utbruddene av blackleg, som vanligvis forblir ufullstendig på grunn av mikrobiologisk kulturbegrensning. Dessuten, på grunn av høy spesifisitet AV PCR teknikk, ansettelse av marsvin for identifisering av midlet ble unngått.
1. Baldassi, L. (2005). Clostridial toksiner potente giftstoffer, potente medisiner. J. Venom. Anim. Tox. Trop. Dis., 11(4), 391-411.
2. Jansen, C. L.; Werthein-Van-Dilen, P. M. E.; Sol, C. J. A.; Salimans, M. M. M.; Jansen, C. L.; Werthein-Van-Dilen, P. M. E.; Noordaa Van Der J. (1990). Rask og enkel metode for rensing av nukleinsyrer. J. Clin. Mikrob., 28, 495-503.
3. A. V.; Della Libera, A. M.; Birgel Junior, E. H.; Pogliani, F. C.; Birgel, D. B.; Benesi, F. J.; Miyashiro, S.; Baldassi, L. (2006). Symptomatisk karbunkel: forekomst, klinisk utvikling og oppfølging av utvinning av storfe påvirket av «manqueira». Arq. Inst. Biol., 73(2), 243-246.
4. Hamaoka, T.; Terakado, N. (1994). Demonstrasjon av vanlige antigener på celleoverflaten Av Clostridium chauvoei og Clostridium septicum ved indirekte immunfluorescensanalyse. J. Vet. Med. Sci., 56, 371-373.
5. Kojima, A.; UIDA, I.; Sekiaki, T.; Sasaki, Y.; Ogikubo, Y.; Tamura, Y. (2001). Rask deteksjon og identifisering Av Clostridium chauvoei VED PCR basert på flagellin gensekvens. Veterinær. Mikrob., 78, 363-371.
6. Kuhnert, P.; Capaul, S. E.; Nicolet, J.; Frey, J. (1996). Fylogenetiske posisjoner Av Clostridium chauvoei og Clostridium septicum basert PÅ 16s rRNA gensekvenser. Int. J. Syst. Bact., 46(4), 1174-1176.
7. Kuhnert, P.; Krampe, M.; Capaul, S. E.; Frey, J.; Nicolet, J. (1997). Identifikasjon Av Clostridium chauvoei i kulturer og klinisk materiale fra blackleg ved HJELP AV PCR. Veterinær. Mikrob., 51, 291-298.
8. Moussa, J. (1959). Antigene formler for Clostridium septicum og Clostridium chauvoei.J. Sti. Bac., 7, 341-350.
9. Sasaki, Y.; Kojima, A.; Aoki, Hiroshi; Ogikubo, Y.; Takikawa, N.; Tamura, Y. (2002). Phylogenetic analyse OG PCR påvisning Av Clostridium chauvoei, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi type A Og B, Og Clostridium septicum basert på flagellin genet. Veterinær. Mikrob., 86, 257-267.
10. Sasaki, Y.; Yamamoto, K.; Kojima, A.; Norimatsu, M.; Tamura, Y. (2000). Hurtig identifisering og differensiering av patogen clostridia i gassgangren ved polymerasekjedereaksjon basert PÅ 16s-23s rDNA spacer-regionen. Res. Vet. Sci., 69, 289-294.
11. Sippel, W. L. (1982). Diagnose Av Clostridial Sykdommer. J. Am. Veterinær. Med. Assoc., 161, 1299-1305.
12. Uzal, Fa; Plumb, Jj; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1997). Påvisning Av Clostridium perfringens som produserer forskjellige toksiner i faece av geiter VED PCR. Lett. Program. Mikrob., 25, 339-344.
13. Vanelli, S. A.; Uzal, F. A. (1996). Clostridium septicum deteksjon av peroxidase-antiperoxidase (PAP) teknikk, i formalin-fast, parafin innebygd vev av sau. Arch. Med. Veterinær., 28, 125-127.
14. Warren, Al; Uzal, F. L.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1998). PCR påvisning Av Clostridium perfringens Type D i formalin-fast, parafin-embedded vev av geiter og sauer. Lett. Program. Mikrob., 29, 15-19.
15. Whelen, a.c.; persing, d.h. (1996). Rollen av nukleinsyreforsterkning og deteksjon i det kliniske mikrobiologilaboratoriet. Anne. Rev. Microb., 50, 349-373.