veterinär mikrobiologi
identifiering av Clostridium chauvoei i kliniska prover av kulturer från blackleg fall, med hjälp av PCR –
identifiering av Clostridium chauvoei inom områdena material och kliniska fall till turkos, det är symptomatiskt att använda PCR
St miyashiroi,* A. F. C. nassari; M. C. A., M. SOUZAI, J. B. CARVALHOI; J. E. B. AdegasII
Iinstitututo Biol Oskorigico, s Oskorio Paulo, SP, Brasil
Iimato Grosso do Sul, Brasil
abstrakt
C. chauvoei närvaro detekterades med hjälp av polymeraskedjereaktion (PCR) från supernatant av odling i kokt köttmedium av lever -, muskel-och metatarsiska benmärgsprover av sju kalvar med svarta bensymtom. Isoleringen under anaeroba förhållanden av ett muskelprov avslöjade Clostridium perfringens i ren kultur.
nyckelord: Clostridium chauvoei; svartben; nötkreatur; PCR.
abstrakt
närvaron av Clostridium chauvoei detekterades genom PCR-reaktion från kokt köttmediumkultur av lever -, muskel-och metatarsal benmärgsprover från sju kalvar som påverkades av symtomatisk karbunkel. Isolering av ett muskelprov under anaeroba förhållanden avslöjade Clostridium perfringens i ren kultur.
nyckelord: Clostridium chauvoei, symptomatisk karbunkel, nötkreatur, PCR.
Clostridium spp är en av släktena som utgör gruppen anaeroba bakterier av stor medicinsk och ekonomisk betydelse. Clostridiosis är det allmänna namnet som ges till en mängd olika sjukdomar orsakade av bakterierna i detta släkt, vilket kan förekomma i någon del av kroppen som ger tillstånd för deras utveckling med följd av toxinproduktion under multiplikation (1).
Clostridium chauvoei är orsaksmedlet för svartben och malignt ödem hos nötkreatur, får och andra idisslare (4). Blackleg hos nötkreatur är en icke-traumatisk endogen infektion, och en betydande andel nötkreatur kan hysa C. chauvoei i levern. Berörda djur är anorektiska, deprimerade, febrila och Lama (ena sidan lem), som presenterar en het, smärtsam svullnad som blir kall, edematös med crepitation. Döden ses inom 12 till 48 timmar. Detta medel verkar ha en preferens för stora muskler (lår, membran och hjärta), som vid obduktion är mörka, röda, torra och svampiga (11). Symtom som liknar blackleg kan också orsakas av Clostridium septicum,C. novyi,C. perfringens eller C. sordellii. I en nyligen genomförd studie om fylogenetisk position av C. chauvoei och C. septicum på deras 16S rRNA-gen (rrs) sekvenser bestämdes en likhet av 99,3% mellan rrs-generna av C. chauvoei och C. septicum som också återspeglas på fenotypisk nivå (7,8).
medan presuntiv diagnos av blackleg och malignt ödem beror på kliniska och patologiska fynd, bekräftas sjukdomen vanligtvis genom att isolera och identifiera organismen, såsom toxinproduktion och immunologiska metoder (9,13). Dessa diagnostiska metoder är dock tidskrävande och mödosamma. Dessutom kan immunologiska metoder ge tvetydiga resultat eftersom C. chauvoei och C. septicum har olika antigener gemensamt (4).
Nukleinsyraförstärkning av en specifik målregion i bakteriegenomet genom polymeraskedjereaktionen (PCR) har använts i stor utsträckning för detektions-och diagnosändamål (15). PCR: s förmåga att förstärka DNA specifikt från lågt antal bakterier, liksom dess enkelhet, snabbhet och reproducerbarhet, erbjuder fördelar jämfört med konventionella metoder för identifiering och har faktiskt använts för att identifiera många Clostridium-arter, inklusive C. chauvoei i rena kulturer och i kliniska prover (5,7,12,14). En noggrann diagnos av blackleg är därför ofta svår. Standarddiagnos baseras på en immunofluorescerande analys och på morfologiska kriterier.
i detta dokument beskriver vi en PCR-baserad metod från tidigare anrikning i kokt köttmedium av prover från kalvar med svartben för att identifiera C. chauvoei. Lever -, muskel-och metatarsiska benmärgsprover från kalvar som presenterade blackleg-symtom under Brasiliansk höst analyserades. De insamlade proverna var från sex kalvar av en flock från delstaten Saborico Paulo och en kalv från staten Mato Grosso do Sul (Tabell 1). Alla dessa nötkreatur dog plötsligt och presenterade muskelkrepitation i den bakre lemmen.
Macerated av lever-och muskelprover och benmärgsvabbar inokulerades i rör med kokt köttmedium (difco gastronomi) som strax före utsattes för termisk chock (100 OCCURC i 10 minuter kyldes omedelbart i nuvarande vatten) och inkuberades sedan vid 37 OCCURC i 48 timmar. Tio mikroliter kokt köttmedium odlades i 5% fårblodsagar och inkuberades vid 37 OCCCC i 48 timmar under anaeroba förhållanden. Kolonier med karakteristisk form, aspekt, färg och hemolys utsattes för Gramfärgning för morfologisk och cellulär väggbestämning. Misstänkta isolat underkastades katalas -, lecitinas -, gelatinas -, glukos -, laktos-och tumultuösa mjölkkoagulationstester för identifiering av bakteriellt kön och Art.
Guanidintyocianatbaserad teknik (2) uppnåddes för DNA-extraktion från supernatant av rör med kokt köttmedium. En mL av varje rör centrifugerades vid 13000 x g i 20 minuter, och pelleten återsuspenderades i 200 oc Tris-EDTA-buffert före extraktionsprotokollet. Multiplex PCR utfördes med primers utformade för flagelingen (fliC), beskrivet av SASAKI et al. (10), specifikt för Clostridium chauvoei och Clostridium septicum, som förstärker 535 baspar (bp) respektive 294 bp. Den främre primern FlaF är vanlig för båda arterna och FlachR och FlaseR är de omvända primrarna för C. chauvoei respektive C. septicum. Amplifiering av DNA utfördes i en total volym av 50 occl, med 200 occlm av varje dNTP, 5 occl 10x reaktionsbuffert, 2,5 mM MgCl2, 30 pmol av varje primer (FlaF – 5′ AGAATAAACAGAA gctggagatg 3′ , FlachR – 5′ TACTAGCAGCATCAAAT GTACC 3′ , och Flase R – 5′ TTTATTGAATTGTGTTGTGTGAAG 3′ ), 1,25 u Taq-polymeras och 10 UCL DNA. För amplifiering använde vi trettio cykler uppdelade i tre faser enligt följande: denaturering vid 94 OCCURC i 60 sekunder, hybridisering vid 56 OCCURC i 60 sekunder och förlängning vid 72 OCCURC i 60 sekunder. C. chauvoei ib 1559 och C. septicum 10518 (Instituto Biol Exceptionico-stammar) användes som PCR-positiva kontroller och muskelprov från en normal ko användes som PCR-negativ kontroll.
PCR applicerades också direkt från kliniska prover (lever, muskel och benmärg) med samma DNA-extraktion och amplifieringsprotokoll som nämnts ovan. Förstärkningar utfördes i en Peltier termisk cykler – 100 (MJ-forskning) och analysen av de förstärkta produkterna utfördes genom elektrofores i agarosgel 1,3% färgad med etidiumbromid.
Gram fläck av kokt köttmedium inokulerat med de misstänkta proverna visade små gram-positiva stavar med subterminala sporer i de flesta prover (lever 1, muskler 1,2 och 7 och benmärg 3,4 och 5), bortom andra. Emellertid isolerades endast i muskel 7-provet Clostridium perfringens i ren odling, och ingen tillväxt observerades i de andra provplattorna inkuberades under anaeroba betingelser. Multiplex PCR från kliniska prover visade inget positivt resultat varken för C. chauvoei eller C. septicum. I reaktionen från supernatant av kokt köttmedium inokulerat med samma prover var dock sju av dem positiva för C. chauvoei och negativa för C. septicum (lever 1, muskler 1,2 och 7, benmärg 3,4 och 5), såsom ses i Tabell 1.
det nära fylogenetiska förhållandet mellan C. chauvoei och C. septicum är en molekylär reflektion av den fenotypiska likheten hos dessa organismer. C. chauvoei är relativt svårt att skilja från C. septicum, och dessutom kan C. septicum orsaka symptom som mycket liknar blackleg symptom (6,9).
GREGORY et al. (3) rapporterade förekomst och behandling av nötkreatur med svartben med höga doser penicilin. Diagnos uppnåddes genom att isolera C. chauvoei från en vattpinne i myonekrosområdet och marsvin ympning för identifiering.
KUHNERT et al. (7) rapporterade ett system för att särskilja C. chauvoei och C. septicum, men det kräver begränsning av enzymförtunning av PCR-produkterna för definitiv identifiering av organismen på grund av den lilla skillnaden i 16S rRNA-genen för båda bakterierna.
våra resultat visar att multiplex PCR-reaktion baserad på fliC-gen (10) var effektiv för att identifiera C. chauvoei från naturligt infekterade prover odlade i kokt köttmedium som åstadkom guanidintiocyanat för DNA-extraktion och differentiera denna art från C. septicum. PCR-resultat direkt från vävnadsprover var emellertid negativa, troligen på grund av det låga antalet klostridiala mikrorganismer eller ineffektivt DNA-extraktionsprotokoll.
isoleringen av C. chauvoei är mycket svår, eftersom det kräver hårda anaeroba förhållanden, och kliniska prover är ofta förorenade med andra anaeroba bakterier inklusive clostridia i jord, som växer snabbare än C. chauvoei i ett odlingsmedium (9). Mikrobiologisk kultur av muskel 7 avslöjade Clostridium perfringens isolerade i ren kultur under anaeroba förhållanden. Denna art kan också vara involverad i svartbenfall, och i den aktuella studien kan den associeras med C. chauvoei. Hur som helst, om bara mikrobiologiska metoder hade tillämpats i detta fall skulle blackleg-diagnosen vara fel eller ofullständig. Klostridiala vacciner ger en hög grad av immunitet mot klostridiala sjukdomar, och när diagnosen är korrekt kan sjukdomen lätt kontrolleras. För detta måste kliniska prover samlas in ordentligt och utsättas för laboratorieundersökning. När alla sjukdomar på grund av clostridia kan förebyggas genom vaccination, om problemet fortsätter trots vaccination, måste diagnosen vara fel. Dessutom är en Fallbeskrivning av grundläggande betydelse för att genomföra laboratorieanalys (1).
infektioner på grund av clostridia microrganisms orsakar betydande förluster i produktionen, när behandlingen i allmänhet är opraktisk. Kontroll och förebyggande åtgärder måste omfatta lämpliga åtgärder för hantering och sistematisk vaccination av flocken, eftersom djuren är i permanent kontakt med agenserna och de faktorer som kommer att kunna lossa sjukdomarna.
detektion av nukleinsyra av C. chauvoei från tidigare anrikning av naturligt infekterade prover i kokt köttmedium belyste diagnosen i dessa två brasilianska utbrott av svartben, som vanligtvis förblir ofullständiga på grund av mikrobiologisk kulturbegränsning. Dessutom, på grund av hög specificitet av PCR-teknik, undviks anställning av marsvin för identifiering av medlet.
1. Baldassi, L. (2005). Clostridial toxiner potenta gifter, potenta läkemedel. J. Venom. Anim. Tox. Trop. Dis., 11(4), 391-411.
2. Boom, R.; Sol, CJA; Salimans, Mmmm; Jansen, Cl; Werthein-Van-Dilen, PME; Noordaa Van Der J. (1990). Snabb och enkel metod för rening av nukleinsyror. J. Clin. Mikrob., 28, 495-503.
3. Gregory, L.; Della Libera, A. M. M.; Birgel Junior, E. H.; Pogliani, F. C.; Birgel, D. B.; Benesi, F. J.; Miyashiro, S.; Baldassi, L. (2006). Symtomatisk karbunkel: förekomst, klinisk utveckling och uppföljning av återhämtningen av nötkreatur som drabbats av ”manqueira”. Arq. Inst. Biol., 73(2), 243-246.
4. Hamaoka, T.; Terakado, N. (1994). Demonstration av vanliga antigener på cellytan av Clostridium chauvoei och Clostridium septicum genom indirekt immunofluorescensanalys. J. Vet. Med. Sci., 56, 371-373.
5. Kojima, a.; UIDA, i.; Sekiaki, t.; Sasaki, y.; Ogikubo, y.; Tamura, Y. (2001). Snabb upptäckt och identifiering av Clostridium chauvoei genom PCR baserat på flagellin gensekvens. Veterinär. Mikrob., 78, 363-371.
6. Kuhnert, p.; Capaul, S. E.; Nicolet, J.; Frey, J. (1996). Fylogenetiska positioner av Clostridium chauvoei och Clostridium septicum baserat på 16S rRNA-gensekvenser. Int. J. Syst. Bact., 46(4), 1174-1176.
7. Kuhnert, p.; Krampe, m.; Capaul, S. e.; Frey, J.; Nicolet, J. (1997). Identifiering av Clostridium chauvoei i kulturer och kliniskt material från svartben med PCR. Veterinär. Mikrob., 51, 291-298.
8. Moussa, J. (1959). Antigena formler för Clostridium septicum och Clostridium chauvoei.J. Väg. Bac., 7, 341-350.
9. Sasaki, Y.; Kojima, A.; Aoki, Hiroshi; Ogikubo, Y.; Takikawa, N.; Tamura, Y. (2002). Fylogenetisk analys och PCR-detektion av Clostridium chauvoei,Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi typ A och B och Clostridium septicum baserat på flagellingenen. Veterinär. Mikrob., 86, 257-267.
10. Sasaki, Y.; Yamamoto, K.; Kojima, A.; Norimatsu, M.; Tamura, Y. (2000). Snabb identifiering och differentiering av patogena clostridier i gasgangren genom polymeraskedjereaktion baserat på 16S-23s rDNA-distansregionen. Res. Veterinär. Sci., 69, 289-294.
11. Sippel, W. L. (1982). Diagnos av Clostridiala sjukdomar. J. Am. Veterinär. Med. Assoc., 161, 1299-1305.
12. Uzal, Fa; Plumb, JJ; Blackall, Ll; Kelly, Wr (1997). Detektion av Clostridium perfringens som producerar olika toxiner i faece av getter genom PCR. Lett. App. Mikrob., 25, 339-344.
13. Vanelli, S. A.; Uzal, F. A. (1996). Clostridium septicum-detektion med peroxidas-antiperoxidas (PAP)-tekniken, i formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader från får. Båge. Med. Veterinär., 28, 125-127.
14. Warren, A. L.; Uzal, F. L.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1998). PCR-detektion av Clostridium perfringens Typ D i formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader av getter och får. Lett. App. Mikrob., 29, 15-19.
15. Whelen, a. c.; persing, d. h. (1996). Rollen av nukleinsyraförstärkning och detektion i det kliniska mikrobiologiska laboratoriet. Ann. Mikrob., 50, 349-373.