Ergebnisse und Diskussion
Während unserer Untersuchung der DNA-Schädigungssignalisierung (32, 33) beobachteten wir zwei prominente Banden in Chk1-Immunoblots: die Chk1-Bande bei 56 kDa und eine schneller wandernde Bande von 43 kDa. Die schneller wandernde Bande wurde von Chk1-Antikörpern nachgewiesen, die gegenüber der internen Kinasedomäne oder der C-terminalen Sequenz reaktiv waren, nicht jedoch von Chk1-Antikörpern, die den N-Terminus erkannten (Abb. 1A). Diese Bande wurde von dem monoklonalen G4-Antikörper von Santa Cruz Biotechnology, der üblicherweise für die Immunoblot-Analyse von Chk1 verwendet wird, nicht erkannt (24, 29). Der Knockdown von Chk1 über siRNA führte zum Verschwinden von Chk1 und der 43-kDa-Bande, was ihre Relevanz weiter bestätigte (Abb. 1B). Das 43-kDa-Protein wurde durch Proteasom- und Proteaseinhibitoren nicht beeinflusst (SI-Anhang, Abb. 1), was die Möglichkeit erhöht, dass es sich um eine alternative Spleißvariante von Chk1 handeln könnte. Die National Center for Biotechnology Information Database listet derzeit drei alternativ gespleißte humane Chk1-mRNAs auf, die unterschiedliche nicht translatierte Regionen aufweisen, aber das gleiche Chk1-Protein voller Länge mit 476 Aminosäuren (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111) codieren. Unsere Analyse unter Verwendung einer EST-basierten prädiktiven Datenbank für alternatives Spleißen (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) schlug jedoch die Möglichkeit einer eindeutigen Spleißvariante von Chk1 vor, bei der Exon 3 alternativ gespleißt oder gelöscht wird. Um diese Möglichkeit direkt zu testen, führten wir RT-PCR mit Primern innerhalb der Chk1-kodierenden Sequenz durch (Abb. 1C). RT-PCR mit dem Primer-Set P1, bei dem der Forward-Primer innerhalb von Exon 3 ausgelegt wurde, erzeugte ein einzelnes Amplikon der erwarteten Größe, wohingegen RT-PCR mit dem P2- oder P3-Primer-Set (beide basierend auf Sequenzen, die Exon 3 flankieren) zwei Amplikons erzeugte, eines mit der erwarteten Größe von Chk1 und das andere ∼200 bp kürzer (Abb. 1C). Die Sequenzierung bestätigte, dass das längere Amplikon tatsächlich Chk1 war und insbesondere das kürzere Amplikon eine alternative Spleißvariante von Chk1 ohne Exon 3 war (Abb. 1D und SI Anhang, Fig. 2A). Es wurde vorhergesagt, dass diese Spleißvariante in eine N-terminal verkürzte Form von Chk1 übergeht, die aus 382 Aminosäuren besteht, die wir Chk1-short oder Chk1-S nannten (Abb. 1D und SI Anhang, Fig. 2). In der Gelelektrophorese migrierte in vitro translatiertes Chk1-S ähnlich wie das 43-kDa-Protein aus HEK293-Zellen (Abb. 1E). Wir haben das 43-kDa-Protein aus HEK293-Zelllysat für die Massenspektrometrie immunpräzipitiert und seine Identität als Chk1-S bestätigt. Die N-terminale Trunkierung in Chk1-S stimmt mit den Immunoblot-Ergebnissen überein, die zeigen, dass sie von den Antikörpern, die gegenüber der N-terminalen Sequenz von Chk1 reaktiv sind, nicht erkannt wurde (Abb. 1A). Durch Echtzeit- und RT-PCR-Analyse wurde die Chk1-S-mRNA-Expression in mehreren menschlichen Geweben nachgewiesen, und die Expression ist im Allgemeinen in fetalen Geweben höher (SI-Anhang, Abb. 3A und D). Die Immunoblot-Analyse zeigte ferner die Chk1-S-Proteinexpression in menschlichen, Maus- und Rattenzelllinien sowie in menschlichen fötalen Geweben (SI-Anhang, Abb. 3B) und primären renalen tubulären Zellen der Maus (SI-Anhang, Abb. 3C). Die cDNA von Chk1-S in voller Länge wurde ebenfalls aus drei normalen menschlichen Geweben (Thymus, Dickdarm, fetale Leber) kloniert und sequenziert, um zu bestätigen, dass sie für eine N-terminal abgeschnittene Spleißvariante von Chk1 kodiert. Zusammen haben diese Experimente eine einzigartige Spleißvariante von Chk1 identifiziert, die N-terminal abgeschnitten ist und in Säugetierzellen und -geweben weit verbreitet ist.
Identifizierung von Chk1-S als eindeutige, N-terminal abgeschnittene Spleißvariante von Chk1. (A) HEK293-Zelllysat wurde durch Immunoblotting unter Verwendung von Antikörpern analysiert, die spezifisch den N-Terminus (α-Chk1-NT), die Kinasedomäne (α-Chk1-KD) oder den C-Terminus von Chk1 (α-Chk1-CT) erkannten. Zusätzlich zu Chk1 wurde ein 43-kDa-Protein durch α-Chk1-KD und α-Chk1-CT, aber nicht α-Chk1-NT nachgewiesen. (B) HEK293-Zellen wurden 48 h lang mit Chk1-siRNA (siChk1) oder einer verschlüsselten Sequenz (siCon) transfiziert, um Ganzzelllysat für die Immunoblot-Analyse unter Verwendung von α-Chk1-KD zu sammeln. siChk1 verminderte die Expression von Chk1 und des 43-kDa-Proteins. (C) RNA wurde aus HEK293-Zellen für RT-PCR unter Verwendung von drei verschiedenen Sätzen von Primern für Chk1 isoliert: P1, P2 und P3 (relative Sequenzpositionen sind im Diagramm gezeigt). Zwei Amplikons wurden mittels RT-PCR unter Verwendung der das Exon 3 flankierenden Primersätze (P2 und P3) nachgewiesen, wohingegen nur ein Amplikon unter Verwendung des Primersatzes P1 amplifiziert wurde, von dem sich der Vorwärtsprimer innerhalb des Exons 3 von Chk1 befand. (D) Schematische Darstellung eines alternativen Spleißens von Chk1, das zu einem N-terminal verkürzten Protein, Chk1-S, führt. (E) Chk1-S wurde zur In-vitro-Translation kloniert, und das translatierte Protein zusammen mit HEK293-Zelllysat wurden durch Immunoblot-Analyse analysiert. In vitro wanderte translatiertes Chk1 ähnlich wie die 43-kDa-Bande in HEK293-Zellen.
Was ist die Funktion von Chk1-S? Reguliert es Zellzyklus-Checkpoints wie Chk1? Mit diesen Fragen bestimmten wir zunächst die zeitlichen und räumlichen Expressionsmuster von Chk1-S im Zellzyklus. HEK293-Zellen wurden in G1-, G1 / S- oder G2 / M-Phasen durch Serumhungern, Doppelthymidinblock bzw. Chk1-S war in G1-Phasenzellen niedrig und in G1 / S- und G2 /M-Zellen höher (SI-Anhang, Abb. 4 A und B). Wenn außerdem Zellen in der G1 / S-Phase durch einen doppelten Thymidinblock synchronisiert und dann freigesetzt wurden, nahmen sowohl die Chk1- als auch die Chk1-S-Expression nach Eintritt in die S-Phase zu (Abb. 2A). Ein deutlicher Unterschied zwischen der Chk1- und der Chk1-S-Expression bestand darin, dass die Chk1-Expression in der Mitte der S-Phase ihren Höhepunkt erreichte, die Chk1-S-Expression von der S- zur M-Phase weiter zunahm (Abb. 2A). Interessanterweise wurden hohe Konzentrationen der Chk1-S-Expression 7 h nach der Zellzyklusfreisetzung aus dem Thymidinblock beobachtet, einem Zeitpunkt, zu dem die Zellen noch nicht mitotisch waren (SI-Anhang, Abb. 4C). Wir haben das Chk1-S: Chk1-Verhältnis in asynchronen und S- oder G2 / M-synchronisierten Zellen weiter quantifiziert. Trotz der Variationen der Chk1-S-Expression in HEK293-, U2OS- und primären renalen tubulären Zellen lag das Chk1-S: Chk1-Verhältnis in allen Zellen in der G2 / M-Phase über 1 (SI-Anhang, Abb. 5). In asynchronen Zellen waren Chk1-S und Chk1 hauptsächlich im Kern lokalisiert (SI-Anhang, Abb. 6A). In G2 / M-Phasenzellen akkumulierten sich jedoch einige Chk1-S und Chk1 in Zentrosomen (SI-Anhang, Abb. 6 B und C). Die Lokalisierung von Chk1 in Zentrosomen ist entscheidend für seine G2 / M-Checkpoint-Funktion, wo es eine vorzeitige Aktivierung von Cdk1 und den mitotischen Eintritt verhindert (34, 35). Unsere Ergebnisse zeigen, dass Chk1-S auch auf Zentrosomen lokalisieren kann, was eine räumliche und zeitliche Regulation von Chk1 zur Initiierung des mitotischen Eintritts ermöglicht. Als nächstes bestimmten wir die Auswirkungen der Chk1- oder Chk1-S-Überexpression in HEK293- und U2OS-Zellen. Im Vergleich zu GFP-Chk1 induzierte GFP-Chk1-S einen ausgeprägten nuklearen Phänotyp, der durch Kernkondensation und Bildung von Mikronuclei und multiplen oder multilobierten Kernen gekennzeichnet war (Abb. 2B). Zu früheren Zeitpunkten zeigten die transfizierten Zellen eine Kern-Chromatin-Kondensation, die durch schwache und punktförmige Histon-H3-Phosphorylierung gekennzeichnet war (Abb. 2B), was auf einen vorzeitigen mitotischen Eintritt hinweist. Später entwickelten diese Zellen Mikrokerne oder mehrlappige Kerne, die für mitotische Katastrophen charakteristisch sind (Abb. 2B). Die Zellzählung zeigte, dass GFP-Chk1-S den nuklearen Phänotyp in ∼20% der U2OS-Zellen induzierte (Abb. 2C). Ähnliche Effekte zeigten YFP-Chk1-S und Chk1-S-Myc (Abb. 2C), was darauf hinweist, dass der beobachtete nukleare Phänotyp durch Chk1-S und nicht durch die Fusionsprotein-Tags induziert wurde. Im Gegensatz dazu wurde ein vorzeitiger mitotischer Eintritt nicht durch Chk1 oder seine Kinase-tote Mutante Chk1-KD induziert (Abb. 2C). Chk1-S induzierte auch in anderen Zelltypen den auffälligen Kernphänotyp (SI-Anhang, Abb. 7). Bemerkenswerterweise wurde ein ähnlicher nuklearer Phänotyp in Zellen und Mausmodellen berichtet, denen ein oder beide Chk1-Allele fehlten (7, 36, 37), was darauf hindeutet, dass Chk1-S als endogener Inhibitor von Chk1 wirken kann. Um diese Möglichkeit weiter zu testen, erzeugten wir Tet-on-U2OS-Zelllinien, die zur Expression von Chk1, Chk1-KD oder Chk1-S induziert werden können. Die Zellen wurden in der G1 / S-Phase durch einen doppelten Thymidinblock synchronisiert, durch Doxycyclin induziert und dann in Nocodazol-haltiges Medium freigesetzt. Etwa 80% der Chk1-S-exprimierenden Zellen traten in die Mitose ein , während ∼60% der Chk1- oder Chk1-KD-exprimierenden Zellen dies taten (Abb. 2D). Während die meisten mitotischen Zellen in den Chk1- und Chk1-KD-exprimierenden Gruppen 4n-DNA aufwiesen, wiesen ∼25% der mitotischen Zellen aus der Chk1-S-exprimierenden Gruppe weniger als 4n-DNA auf (Abb. 2D), was auf einen abweichenden mitotischen Eintritt in diese Zellen ohne Abschluss der DNA-Replikation hinweist. Darüber hinaus führte die Chk1-S-Überexpression zu einem früheren Eintritt in die Mitose, wie durch das Auftreten von pH3-positiven Zellen angezeigt (SI-Anhang, Abb. 8). Chk1 ist ein Schlüsselregulator des mitotischen Eintritts oder des S-zu-G2 / M-Übergangs im Zellzyklus. Durch Phosphorylierung von CDC25A (Induzierung seines Abbaus) und Wee1 verhindert Chk1 die CDK1-Aktivierung und den mitotischen Eintritt (5, 15-20). Wir zeigten, dass die Induktion von Chk1-S durch Doxycyclin in den Tet-on-U2OS-Zellen zu höheren CDC25A-Spiegeln und niedrigeren Phospho-CDK1-Spiegeln führte, was darauf hindeutet, dass Chk1-S Chk1 antagonisiert, um den mitotischen Eintritt zu induzieren (Abb. 2E). Spezifischer Knockdown von Chk1-S über RNAi war nicht erfolgreich, da die Chk1-S Sequenz in Chk1 mRNA enthalten ist. Ein Antisense-Oligonukleotid, das komplementär zum einzigartigen Exon2–exon4-Übergang in Chk1-S ist, könnte jedoch die Chk1-S-Expression spezifisch reduzieren (SI-Anhang, Abb. 9A). Chk1-S-Down-Regulation deutlich reduzierte Zellproliferation (SI-Anhang, Abb. 9B). Interessanterweise veränderte die Herunterregulierung von Chk1-S das Zellzyklusprofil nicht signifikant (SIEHE Anhang, Abb. 9C). Da Chk1 an mehreren Zellzykluskontrollpunkten (z. B. G2 / M, Spindel, Intra-S) wirkt, kann Chk1-S Chk1 antagonisieren, um das Fortschreiten des Zellzyklus an mehreren Stellen zu erleichtern. Infolgedessen kann die Hemmung von Chk1-S den Zellzyklus in verschiedenen Phasen verlangsamen und zur Unterdrückung der Proliferation ohne größere Änderungen der Zellzyklusverteilung führen.
Regulation des Zellzyklus durch Chk1-S. (A) HEK293-Zellen wurden durch doppelten Thymidinblock synchronisiert und dann in Nocodazol-haltiges Medium freigesetzt. (Links) Zellzyklusprofil analysiert durch Propidiumiodid (PI) -Färbung und FACS-Analyse. (Rechts) Immunoblot-Analyse von Chk1 und Chk1-S im Zelllysat, das zu angegebenen Zeitpunkten nach der Freisetzung aus dem Thymidinblock gesammelt wurde. ALS asynchrone Zellen (B) wurden U2OS-Zellen mit GFP-Chk1 oder GFP-Chk1-S (grün) transfiziert und dann für die Immunfluoreszenz von Phospho-Histon H3 (rot) und Kernfärbung mit Hoechst33342 (blau) fixiert. (Oben) Chk1-S, aber nicht Chk1, induzierte eine vorzeitige Chromatinkondensation und eine schwache pH3-Färbung (Pfeile). (Niedriger) Im späten Stadium zeigten Chk1-S-transfizierte Zellen die Eigenschaften von mitotischen Zellen einschließlich Mikronuclei und multilobed Kerne (Pfeile). (C) U2OS-Zellen wurden mit den angegebenen Genen transfiziert, und Zellen mit dem Kernphänotyp der vorzeitigen Chromatinkondensation und der mitotischen Katastrophe wurden gezählt. Die Daten zeigen den Mittelwert ± SD an; * P < 0,05 gegenüber der Vektorgruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass die Chk1-S-Überexpression spezifisch zum nuklearen Phänotyp führte. (D) U2OS-Zellen wurden mit den angegebenen Genen transfiziert, durch doppelten Thymidinblock synchronisiert und für 7 h freigesetzt. Die Zellen wurden dann für pH3-Immunfluoreszenz und PI-Färbung fixiert und durch FACS analysiert. Die Daten zeigen den Mittelwert ± SD an; * P < 0,05 gegenüber der Vektorgruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass Chk1-S spezifisch einen vorzeitigen mitotischen Eintritt ohne Abschluss der DNA-Replikation induzierte (Zellen mit < 4n DNA). (E) Tet-on-U2OS-Zellen wurden mit oder ohne Doxycyclin induziert. Die Zellen wurden dann in der S-Phase durch doppelten Thymidinblock synchronisiert und für 7 h freigegeben. Ganzzelllysat wurde für die Immunoblot-Analyse der angegebenen Proteine gesammelt. Die Ergebnisse zeigen, dass die induzierte Chk1-S-Expression zu einem Anstieg von CDC25A und einer Abnahme von Phospho-CDK1 führte, was zu einem vorzeitigen mitotischen Eintritt beitrug.
Wie funktioniert Chk1-S antagonisieren Chk1? Wir stellten die Hypothese auf, dass Chk1-S mit Chk1 interagieren könnte, um seine Kinaseaktivität zu blockieren. Konsistent exprimierte FLAG-Chk1-S in HEK293-Zellen coimmunopräzipitiert mit endogenem Chk1 (Abb. 3A). Darüber hinaus wurden in vitro translatierte Myc-Chk1 und Chk1-S coimmunpräzipitiert (Abb. 3B), was auf eine direkte Chk1–Chk1-S-Wechselwirkung hindeutet. Wir zeigten weiterhin die Coimmunpräzipitation von Chk1 mit der N-terminalen Domäne, aber nicht der C-terminalen Domäne von Chk1-S (Abb. 3C), was auf die Notwendigkeit der N-terminalen Sequenz in Chk1-S für seine Wechselwirkung mit Chk1 hindeutet. Funktionell haben wir die Auswirkungen von Chk1-S auf die Chk1-Kinaseaktivität bestimmt. Chk1-Myc wurde exprimiert und für den in vitro Kinase Assay in Abwesenheit oder Anwesenheit von gereinigtem Chk1-S immunpräzipitiert. 3D wurde die Chk1-Kinaseaktivität teilweise noch signifikant durch Chk1-S unterdrückt, jedoch nicht durch hitzedenaturiertes Chk1-S. Im Gegensatz dazu verringerte Chk1-S die Chk2-Aktivität nicht, die ähnliche Substratpräferenzen wie Chk1 aufweist. Im Vergleich zu Chk1 fehlt Chk1-S ein Teil der Kinasedomäne einschließlich der ATP-Bindungsstelle (Abb. 1D) und zeigten erwartungsgemäß keine signifikante Proteinkinaseaktivität (Fig. DREIDIMENSIONAL). Chk1-S kann auch die Kinaseaktivität von N-terminal markiertem Chk1 (FLAG-Chk1) in einem In vitro Kinase Assay unterdrücken (SIEHE Anhang, Abb. 10). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Chk1-S Chk1 über molekulare Interaktion hemmen kann. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass das Waschen von Chk1-Immunpräzipitaten mit einem strengeren RIPA-Puffer (Radio Immuno-Precipitation Assay) die Chk1-Kinaseaktivität deutlich erhöhen kann, was darauf hindeutet, dass Chk1 normalerweise durch Repressionsfaktoren inhibiert wird (29); Die Identität der Repressionsfaktoren ist jedoch unbekannt. Wir bestätigten die Wirkung der RIPA-Pufferwäsche und zeigten insbesondere, dass die Zugabe von exogenem Chk1-S die Wirkung der RIPA-Pufferwäsche auf die Chk1-Kinaseaktivität umkehren kann (SIEHE Anhang, Abb. 11), was darauf hindeutet, dass Chk1-S einer der wichtigsten endogenen Unterdrückungsfaktoren für Chk1 sein kann.
Chk1-S interagiert mit Chk1, um seine Kinaseaktivität zu unterdrücken. (A) HEK293-Zellen wurden mit FLAG-Chk1-S oder leerem Vektor transfiziert, um Lysat für die Immunpräzipitation (IP) unter Verwendung von Anti-FLAG-Antikörpern zu sammeln. Die Immunpräzipitate wurden auf Chk1 und FLAG-Chk1-S durch Immunoblotting unter Verwendung von Anti-FLAG- bzw. Anti-N-Terminus-Chk1-Antikörpern analysiert. Die Ergebnisse zeigen die Koexistenz von FLAG-Chk1-S mit endogenem Chk1. (B) Chk1-Myc und Chk1-S wurden unter Verwendung des TnT in vitro transcription/translation Kit (Promega) hergestellt. (Links) In vitro produziert Chk1-Myc und Chk1-S durch Immunoblotting gezeigt. (Rechts) Chk1-Myc wurde nach Inkubation mit oder ohne Chk1-S unter Verwendung von Anti-Myc-Antikörpern immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden durch Immunoblotting auf Chk1-S und Chk1-Myc analysiert. Die Ergebnisse zeigen eine direkte Interaktion zwischen Chk1 und Chk1-S. (C) HEK293-Zellen wurden mit Myc-markiertem Chk1-S oder seinen C- oder N-terminalen Deletionsmutanten transfiziert, um Lysat für die Immunpräzipitation unter Verwendung von Anti-Myc-Antikörpern zu sammeln. Die Immunpräzipitate wurden auf das Vorhandensein von Chk1 untersucht. Die Ergebnisse zeigen die Coimmunpräzipitation von Chk1 mit Chk1-S und seiner C-terminalen Deletionsmutante, jedoch nicht mit seiner N-terminalen Deletionsmutante. (D) HEK293-Zellen wurden mit Myc-markiertem Chk1-S, Chk1 oder Chk2 transfiziert, um Lysat für die Immunpräzipitation unter Verwendung von Anti-Myc-Antikörpern zu sammeln. Die Chk1-S-Myc, Chk1-Myc oder Chk2-Myc enthaltenden Immunpräzipitate wurden mit oder ohne Chk1-S für 1 h inkubiert und anschließend unter Verwendung von Chk2 als Substrat in den Kinaseaktivitätstest gegeben. Denaturiertes Chk1-S wurde durch Kochen hergestellt. Die Daten zeigen den Mittelwert ± SD an; * P < 0,05 gegenüber der Chk1-Myc-Gruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass natives Chk1-S Chk1 spezifisch hemmen kann. (E) HEK293-Zellen wurden mit Chk1-Myc- oder Chk1-Myc(S317A/S345A)-Mutante transfiziert. Die Zellen wurden dann unbehandelt oder 2 h lang mit 100 nM Camptothecin behandelt, um Lysat zur Immunpräzipitation mit Anti-Myc-Antikörpern zu sammeln. Die Immunpräzipitate wurden auf Myc-Chk1, phosphoryliertes (Serin 345) Chk1 und Chk1-S durch Immunoblotting analysiert. Der Chk1-Eingang wurde ebenfalls in den Proben verifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass Chk1-S in normalen Zellen coimmunpräzipitiert oder mit Chk1 assoziiert ist und dass die Assoziation während Camptothecin-induzierter DNA-Schädigung vermindert war. Die Assoziation zwischen Chk1-S und der Chk1 (S345A / S317A) -Mutante wurde jedoch während der DNA-Schädigung nicht gestört, was darauf hindeutet, dass die Phosphorylierung von Chk1 bei S345 und S317 für die Dissoziation von Chk1-S von Chk1 erforderlich sein könnte. (F) HEK293-Zellen wurden entweder mit Chk1-Myc + Leervektor oder Chk1-Myc + dn-ATR kotransfiziert, gefolgt von einer Behandlung mit 100 nM Camptothecin für 2 h. Das zelluläre Lysat wurde zur Immunpräzipitation mit Anti-Myc-Antikörpern gesammelt, gefolgt von einer Immunoblot-Analyse der angegebenen Proteine. Die Ergebnisse zeigen, dass die Camptothecin-induzierte Störung der Chk1-Chk1-S-Dissoziation von der ATR und der Chk1-Phosphorylierung abhängt.
In der DNA-Schadensreaktion (DDR) wird Chk1 durch Phosphorylierung an S345- und S317-Resten deutlich aktiviert (7, 13, 38, 39). Trotz der Anerkennung der Bedeutung der S345 / S317-Phosphorylierung bleibt unklar, wie diese Phosphorylierung Chk1 aktiviert (28-30). Wir zeigten, dass sich die Chk1-S-Expression in DDR nicht merklich veränderte (SI-Anhang, Abb. 12). Die Chk1–Chk1-S-Wechselwirkung wurde jedoch in der DDR durch Camptothecin, einen DNA-Topoisomerase-I-Inhibitor und DNA-schädigenden Wirkstoff, abgeschwächt (Abb. 3E). Bemerkenswerterweise schien die Dissoziation von Chk1 von Chk1-S in DDR von der Chk1-Phosphorylierung bei S345 / S317 abhängig zu sein, da die Chk1 (S345A / S317A) -Mutante während der Camptothecin-Behandlung nicht von Chk1-S dissoziierte (Abb. 3E). In DDR hängt die Chk1-Aktivierung von der ATR-vermittelten Phosphorylierung ab (7, 13, 14). Wir zeigten, dass die Hemmung von ATR über eine dominant-negative Mutante (dn-ATR) nicht nur die Camptothecin-induzierte Chk1-S–Phosphorylierung unterdrückte, sondern auch die Chk1-Chk1-S-Dissoziation verhinderte (Abb. 3F). In ähnlicher Weise dissoziierte Chk1 während der Cisplatin-induzierten DDR von Chk1-S, und die Dissoziation wurde durch dn-ATR verhindert (SI-Anhang, Abb. 13). Zusammen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Phosphorylierung von Chk1 seine Wechselwirkung mit dem endogenen Inhibitor Chk1-S stören kann, was zu einer Aktivierung von Chk1 in DDR führt.
Die Identifizierung von Chk1-S als einzigartiger Regulator der Zellzyklusprogression und Zellproliferation veranlasste uns, seine Expression in Krebsgeweben zu untersuchen. Auf mRNA-Ebene exprimierten die meisten Krebsgewebe höhere Chk1- und Chk1-S-Spiegel als normale Gewebe (SI-Anhang, Abb. 14). Interessanterweise zeigten Hodenkarzinome eine ausgeprägte Hochregulation von Chk1-S, aber nicht von Chk1 (Abb. 4A). Die spezifische Hochregulation von Chk1-S wurde durch Immunoblot-Analyse in Hodenkarzinomgeweben, insbesondere in Krebsproben im Spätstadium, weiter bestätigt (Abb. 4B). Wie bereits berichtet (5) wiesen sowohl normale als auch maligne Hodengewebe eine hohe Chk1-Expression auf. Eine erhöhte Expression von Chk1-S wurde auch während des Fortschreitens von Eierstockkrebs festgestellt (Abb. 4B). Das relativ hohe Niveau der Chk1- und Chk1-S-Expression in beiden fetalen (SI-Anhang, Abb. 3) und Krebs (Abb. 4) dies deutet darauf hin, dass Chk1-S das Fortschreiten des Zellzyklus beschleunigen und die Zellproliferation unter diesen Bedingungen fördern kann.
Chk1-S-Regulation bei Krebs. (A) Echtzeit-PCR-Analyse der Chk1- und Chk1-S-mRNA-Expression in normalen Hodengeweben und Hodenkarzinomproben, die eine Up-Regulation von Chk1-S in Hodenkarzinomen zeigt. (B) Immunoblot-Analyse von Chk1 und Chk1-S in menschlichen normalen Hoden- und Hodenkrebsgeweben, die eine erhöhte Chk1-S-Expression in Krebsgeweben im Spätstadium zeigt. (C) Nacktmäusen wurden 10 × 106 Tet-auf MDA-MB-231-Zellen injiziert, die Doxycyclin-induzierbar waren, um Chk1, Chk1-KD bzw. Chk1-S zu exprimieren. Nach Tumorbildung auf ∼100 mm3 wurden die Mäuse auf Trinkwasser mit oder ohne Doxycyclin gehalten. Das Tumorvolumen wurde wöchentlich gemessen (gezeigt für Werte der vierten Woche, n = 8). Daten zeigen Mittelwert ± SD an. Die Ergebnisse zeigen, dass induzierte Expression von Chk1-S, aber nicht Chk1 oder Chk-KD, Tumorwachstum gehemmt. (D) Densitometrie der Immunoblot-Ergebnisse der Doxycyclin-induzierten Chk1-Myc-, Chk1-KD-Myc- und Chk1-S-Myc-Expression in exzidierten Tumoren (n = 3 für jede Gruppe). Die Signale wurden mit Chk1-Myc normalisiert (willkürlich auf 100 gesetzt). Daten zeigen Mittelwert ± SD an. Die Ergebnisse zeigen, dass Doxycyclin ähnliche Expressionsniveaus von Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc und Chk1-S-Myc in den Tumoren induzierte. (E) Nacktmäusen wurden Chk1-S-induzierbare Zellen injiziert, um Tumore zu etablieren, und dann 4 Wochen lang mit oder ohne Doxycyclin auf Trinkwasser gehalten. Tumorgewebe wurden für die Immunoblot-Analyse gesammelt. Die Ergebnisse zeigen eine höhere CDC25A-Expression in den Tumor-Xenotransplantaten mit Doxycyclin-induzierter Chk1-S-Expression.
Wir untersuchten weiter die Wirkung der ektopischen Chk1-S-Expression auf das Xenotransplantat-Tumorwachstum bei Mäusen. Tumor-Xenotransplantate wurden in Nacktmäusen unter Verwendung von Tet-on-MDA-MB-231-Brustkrebszelllinien etabliert, die durch Doxycyclin zur Expression von Chk1, Chk1-S oder Chk1-KD induziert werden können. Die Induktion von Chk1 oder Chk1-KD durch Doxycyclin beeinflusste das Tumorwachstum nicht; Die Induktion von Chk1-S führte jedoch zu einer Verringerung des Tumorvolumens um 40% (Abb. 4C). Chk1-S-induzierte Tumorgewebe zeigten ebenfalls eine cdc25A-Akkumulation, was auf die Hemmung von Chk1 hinweist (Abb. 4E). Obwohl die Ergebnisse eine einzigartige Antikrebsstrategie implizieren können, bleibt die physiologische Relevanz der erzwungenen Überexpression von ektopischem Chk1-S unklar. Diese Ergebnisse liefern jedoch einen prinzipiellen Beweis dafür, dass ein Kippen des Chk1-Chk1-S-Gleichgewichts zu einer mitotischen Katastrophe und einer Verringerung der Zellproliferation führen kann.
Die Beobachtung, dass die Chk1-S-Überexpression das Xenotransplantat-Tumorwachstum reduzierte (Abb. 4C-E) schien der Beobachtung zu widersprechen, dass die Tumorproben von menschlichen Patienten relativ hohe Konzentrationen von Chk1-S für die Zellproliferation exprimierten (Abb. 4A und B und im Anhang, Fig. 14). Um diese Daten abzugleichen, ist es wichtig, die Unterschiede zwischen den experimentellen Bedingungen zu erkennen. Eine relativ hohe Chk1-S-Expression in menschlichen Tumoren kann auf das Vorhandensein proliferativer Zellen in diesen Geweben zurückgeführt werden. Konsistent ist Chk1-S auch in fetalen Geweben hoch, die stark proliferativ sind (SI-Anhang, Abb. 3A). Wichtig ist, dass die Chk1-S-Expression in diesen proliferativen Geweben zeitlich auf die späte S- bis M-Phase beschränkt ist (Abb. 2 und im Anhang, Fig. 4). Diese zeitliche Regulierung kann sicherstellen, dass die Chk1-Aktivität nach (und erst nach) dem Abschluss der DNA-Replikation in der S-Phase für das Fortschreiten des Zellzyklus in die G2 / M-Phase gehemmt wird. Wenn jedoch ektopisches Chk1-S in kultivierten Zellen oder Xenotransplantat-Tumoren zur Überexpression gezwungen wird, ist die zeitliche Einschränkung der Chk1-S-Expression gestört; mit anderen Worten, Chk1-S ist während des gesamten Zellzyklus einschließlich der S-Phase hoch, was zu einer konstanten Blockade von Chk-1 und einem vorzeitigen mitotischen Eintritt führt, was zu einer mitotischen Katastrophe und einer verringerten Zellproliferation führt.
Zusammenfassend hat diese Studie eine Spleißvariante von Chk1, Chk1-S, identifiziert, die ein Schlüsselregulator von Chk1 im normalen Zellzyklus und während der DDR ist (SI-Anhang, Abb. 15). Im ungestörten Zellzyklus nimmt die Chk1-Expression in der S-Phase zu und einige Chk1-Moleküle können durch ATR phosphoryliert werden, wodurch die Chk1-S-Bindung verhindert wird, was zu einer hohen Chk1-Aktivität und einer Aufrechterhaltung der S-Phase bis zum Abschluss der DNA-Replikation führt. In der G2-Phase nimmt die Chk1-S-Expression zu und, wie berichtet (29), nimmt die Chk1–Phosphorylierung ab, was eine Chk1-Chk1-S-Wechselwirkung zur Unterdrückung der Chk1-Aktivität fördert. Die Abnahme der Chk1-Aktivität in der G2 / M-Phase ist entscheidend für den mitotischen Eintritt. Unter Bedingungen der Chk1-S-Induktion oder Überexpression sequestrieren übermäßige Mengen von Chk1-S Chk1 und verringern seine Kinaseaktivität während der S-Phase, was zu einem vorzeitigen mitotischen Eintritt ohne Abschluss der DNA-Replikation führt, was zu einer mitotischen Katastrophe führt. Während der DNA-Schädigung wird Chk1 phosphoryliert, was zu einer verminderten Chk1-S-Bindung, einer erhöhten Chk1-Aktivität und einem G2 / M-Arrest führt (SI-Anhang, Abb. 11). Unsere Ergebnisse unterstützen den „De-Repression“ -Mechanismus der Chk1-Aktivierung (29). Wichtig ist, dass Chk1-S einer der wichtigsten Unterdrückungsfaktoren der Chk1-Aktivität zu sein scheint. Durch die Antagonisierung von Chk1 kann Chk1-S den Zellzyklus beschleunigen, was zu einer erhöhten Proliferation in fetalen und krebsartigen Geweben führt. Hohe Chk1-Spiegel in proliferierenden Zellen koordinieren die S-Phase und die Mitose, während hohe Chk1-S-Spiegel einen starken Schalter für den S-zu-G2 / M-Phasenübergang darstellen können. Im Gegensatz dazu induziert eine erzwungene Überexpression von Chk1-S in übermäßigen Mengen, die durch Chk1 unausgewogen sind, einen vorzeitigen mitotischen Eintritt und Zelltod (Abb. 2) und unterdrückt das Tumorwachstum in Tumor-Xenograft-Modellen (Abb. 4). Es wurde vorgeschlagen, dass Chk1 ein wirksames therapeutisches Ziel in der Krebstherapie ist, und Chk1-Inhibitoren werden in klinischen Studien untersucht (40-43). Die Identifizierung von Chk1-S als endogener Inhibitor von Chk1 kann neue Forschungsbereiche in der Zellzyklusregulation, der DNA-Schadensreaktion und der Krebstherapie eröffnen.