CLEC9A je nový aktivační receptor podobný lektinu typu C exprimovaný na BDCA3+ dendritických buňkách a podskupině monocytů | Anne Marie

experimentální postupy

primární buňky, buněčné linie a růstové podmínky-mononukleární buňky periferní krve (Pbmc) byly izolovány z buffy coats (Western Province Blood Transfusion Service, Kapské Město, Jižní Afrika) pomocí Ficoll-Paque™ Plus (Amersham Biosciences), jak bylo dříve popsáno (14). Makrofágy odvozené od monocytů a dendritické buňky byly generovány z Pbmc, jak je popsáno (14). Nih3t3 a hek293t fibroblasty, RAW264.7 makrofágů, Phoenix ecotropic retroviral packaging buněčné linie založené na Hek293t (dárek od Dr. Gary Nolan, Stanford University), Syk-deficientní (C35) a SYK-rekonstituované (WT8) B-buněčné linie (15) byly udržovány v médiu Dulbecco ‚s modified Eagle‘ s medium nebo RPMI1640 medium (Cambrex) doplněné 10% teplem inaktivovaným fetálním telecím sérem (Invitrogen), 20 mm HEPES, 2 mm L-glutamin, 100 jednotek/ml penicilinu a 0, 1 mg/ml streptomycinu (cambrex). Všechny buňky byly pěstovány při 37 °C v 5% CO2.

generace konstrukcí a Transdukovaných buněčných linií—kompletní CLEC9A otevřený čtecí rámec (ORF) byl izolován z lidské pbmc cDNA pomocí PCR a klonován do retrovirového vektoru pFBneo (Stratagene) obsahujícího ha tag (16) pomocí následujících primerů; AAAGAATTCCCACCATGCACGAGGAAGAAATATAC a AAACTCGAGGACAGAGGATCTCAACGC. C-terminálně ha-značená myš CLEC9A (mCLEC9A) byla podobně klonována z myších splenických cDNA pomocí následujících primerů; AAAGTCGACCACCATGCATGCGGAAGAAATA a GTACTCGACGATGCAGGATCCAAATGC.

chiméra CLEC9A / Dectin-1 v pFBneo byla generována pomocí překryvné extenze PCR s primery CTGCTAAACTTTTACAGAAAACCACAAGCCACA a TCTGGGCTTGTGGTTTTCTGTAAAGTTTAGCAG tak, že sekvence byla přeložena jako CLEC9A-79LLNFTECLEC9A-84/Dectin-91NHKPTDectin-95. Konstrukt exprese Fc-CLEC9A byl generován pomocí PCR pomocí následujících primerů; TTTGGTACCAGCAGCAAGAAAAACTC a GCGGAATTCGACAGAGGATCTCAACGC a klonován do vektoru pSecTag2 (Invitrogen) proti proudu od lidské oblasti IgG1 Fc, generované podle popisu (17). Věrnost všech konstrukcí byla ověřena sekvenováním. Lidské a myší CLEC9A a izoformy byly uloženy v GenBank™ pod následujícími přístupovými čísly: hCLEC9A, EU339276; mCLEC9A, EU339277; mCLEC9Aß, EU339278; mCLEC9Ay, EU339279; mCLEC9Aδ, EU339280; mCLEC9Ae, EU339281.

pro vytvoření stabilních buněčných linií byly konstrukty zabaleny do vironů pomocí Ekotropních buněk Phoenixu založených na HEK293T a různé buněčné linie byly transdukovány, jak bylo popsáno výše (16). Všechny buněčné linie byly použity jako neklonální populace ke snížení účinků zakladatele a byly generovány a testovány nejméně dvakrát k potvrzení fenotypu. V případě potřeby byly buněčné linie vybrány a udržovány v 0, 6 mg/ml Geneticinu (G418) (Merck) nebo 4 µg/ml puromycinu (Invitrogen).

exprese člověka CLEC9A byla analyzována pomocí PCR panelů cDNA lidské tkáně (Clontech) pomocí následujících primerů kódujících celý ORF, ATGCACGAGGAAGAAATATACACC a GACAGAGGATCTCAACGCATA. exprese mCLEC9A byla analyzována pomocí PCR myších tkáňových cDNA panelů (Clontech) za použití stejných myších primerů popsaných výše. Exprese G3PDH byla použita jako pozitivní kontrola.

generace monoklonální protilátky proti CLEC9A-monoklonální protilátka (mAb), 9A11, specifická pro CLEC9A, byla generována imunizací 129sv myší rozpustným fúzním proteinem Fc-CLEC9A. Byly vytvořeny HYBRIDOMY NS1 a supernatanty z klonálně zředěných buněk byly testovány pomocí ELISA. Mab 9A11 (IgG1) byl následně vybrán na základě jeho schopnosti fungovat v ELISA, průtokové cytometrii a Western blotting, za neredukovaných podmínek.

Západní blotování a Deglykosylace—pro přípravu buněčných extraktů byly buňky promyty PBS a poté lyzovány v pufru Nonidet P-40 (1% Nonidet P-40, 0,15 m NaCl, 10 mm EDTA, 10 mm NaN3, 10 mm Tris-HCl, pH 8), doplněné inhibitory proteázy (Roche Applied Science) po dobu 30 minut při 4 °C.buněčné zbytky/jádra byly odstraněny centrifugací a supernatanty byly odebrány a uloženy při -20 °C. koncentrace proteinu buněčné extrakty byly stanoveny testem BCA (Pierce) a stejná množství bílkovin byla prováděna na gelech SDS-PAGE podle standardních protokolů. Po přenosu na Hybrondc+ nitrocelulózové membrány (Amersham Biosciences) byl CLEC9A detekován imunostainingem s 9A11 nebo anti-HA (klon 16B12, Covance) následovanou kozí anti-myší křenovou peroxidázou (Jackson). Bloty byly vyvinuty pomocí sady ECL-plus (Amersham Biosciences). Buněčné lyzáty byly deglykosylovány pomocí Pngázy F a / nebo o-glykosidázy (Roche Applied Science), jak je popsáno výrobcem.

protilátky, průtoková cytometrie a třídění buněk-buňky byly vyšetřeny vícebarevnou průtokovou cytometrií na Fasccaliberu (Bd Biosciences), prováděné podle konvenčních protokolů při 4 °C v přítomnosti 2 mm NaN3. Buňky byly blokovány v PBS obsahujících 5 mm EDTA, 0,5% BSA a 5% tepelně inaktivovaného králičího séra (myší buňky) nebo myší sérum (periferní krev) a 50 µg/ml lidského IgG (Sigma; in vitro Kultivované lidské buňky a Pbmc) před přidáním primárních protilátek. Buňky byly fixovány 1% formaldehydem, 0,25% BSA v PBS před analýzou.

k izolaci 9a11 + buněk pro analýzu bylo 30 milionů Pbmc izolovaných, jak je popsáno výše, blokováno 5% myším sérem nebo 50 µg/ml lidským IgG po dobu 15 minut při 4 °C. buňky byly poté obarveny biotinylovanou 9A11 mAb po dobu 30 minut při 4 °C, následované streptavidinem-APC (BD Pharmingen) a buňky APC+ byly tříděny pomocí FACSVantage s. e. (Beckton Dickinson). Tříděné buňky byly udržovány při 4 °C po celou dobu třídění a poté obarveny pro různé povrchové markery, jak je popsáno výše. Tříděné buňky představovaly 0,21% ± 0,07% výchozí populace Pbmc a byly 72,89 ± 6.21% čisté. Dále byly analyzovány pouze buňky 9A11+ v tříděné populaci (viz obr. 3B).

testy endocytózy – pro testy endocytózy, transdukované NIH3T3 nebo RAW264.7 buněk bylo naneseno na 4 × 105 buněk / jamka a 5 × 105 buněk / jamka v 6-jamkových deskách den před experimentem. Na začátku testu byly buňky promyty a poté blokovány PBS obsahujícími 5 mm EDTA, 10 mm NaN3, 0,5% BSA a 5% tepelně inaktivované králičí sérum po dobu 30 minut při 4 °C. buňky byly obarveny biotinylovaným 9A11 nebo anti-mdektinem-1 (2A11; 10 µg/ml) a inkubovány po dobu 50 minut při 4 °C a následně promyty FACS wash (PBS, 05% BSA, 10 mm NaN3 a 5 mm EDTA), aby se odstranila nevázaná protilátka. Zesíťující ovčí protilátka proti myším (Jackson; 5 µg / ml) bylo přidáno a buňky inkubovány dalších 30 minut při 4 °C. po promytí v kultivačním médiu za účelem odstranění nevázané sekundární protilátky a azidu byly buňky inkubovány v kultivačním médiu po dobu uvedenou při 37 nebo 4 °C. buňky byly poté obarveny streptavidinem-PE (BD Pharmingen) a vyšetřeny na zbývající expresi povrchu receptoru průtokovou cytometrií, jak je popsáno výše.

pro mikroskopii byly buňky naneseny na 2 × 105/jamku na skleněných krytech v 6-jamkových deskách den před experimentem. Buňky byly ošetřeny stejně jako u testu založeného na FACS, pouze obarveny 9A11 po dobu 1 hodiny při 4 °C a následně promyty FACS promytím, aby se odstranila nevázaná protilátka. Buňky byly inkubovány po dobu 30 minut při teplotě 37 °C nebo 4 °C v kultivačním médiu. Po inkubaci byly buňky fixovány v 1 ml fixačního činidla (4% paraformaldehydu; 250 mm HEPES v dH2O) po dobu 20 minut. Aldehydové skupiny byly uhaseny PBS-glycinem (25 mm glycinový prášek v PBS) po dobu 10 minut a poté permeabilizovány 0,5% Tritonem X-100 po dobu 20 minut. Buňky byly promyty 0,1% PBS-Tweenem a poté blokovány 0,5% saponinem po dobu 20 minut. Buňky byly obarveny LAMP-1 (clone ID4B; vývojové studie Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a promyty 0,1% PBS-Tween. Buňky byly poté obarveny oslí anti-myší Cy3 a oslí anti-krysí Alexa488 (ředění 1: 100; oba od Jacksona) po dobu 50 minut při pokojové teplotě a následně promyty 0,1% PBS-Tween. Kryty byly namontovány pomocí Vectashield (Vector Laboratories) a zkoumány konvenční fluorescenční mikroskopií na Zeiss Axiovert 40. Obrázky byly zpracovány pomocí Adobe Photoshop verze 6.0.

Zymosan vazebné a cytokinové testy-RAW264. 7 a nih3t3 transfektanty byly pokoveny na 5 × 104 buněk / jamka v 24-jamkových destičkách den před experimentem. Buňky byly promyty, případně přidány rozpustné β-glukany (glukan fosfát; laskavý dárek od Davida Williamse, ETSU; 5 µg/ml) a buňky inkubovány po dobu 20 minut při 4 °C, aby se umožnila inhibice CRD Dectin-1 (18). Po přidání FITC značeného zymosanu (Invitrogen; 25 částic/buňka) byly buňky inkubovány při 4 °C po dobu 60 minut, aby se umožnila vazba, a poté se extenzivně promyly, aby se odstranily nevázané částice. Pro stanovení TNF byly buňky RAW264.7 inkubovány po dobu dalších 3 hodin a množství TNF uvolněného do supernatantů bylo stanoveno pomocí ELISA (Bd Biosciences). Pro měření vazby zymosanu byly buňky lyzovány v 3% Tritonu X-100 (Sigma)a množství vázaného zymosanu bylo kvantifikováno fluorometrií pomocí Titertek Fluoroskan II (Labsystems Group Ltd.).

pro analýzu B-buněk s dostatečným množstvím Syk a deficitem Syk byly 2 × 106 transdukované buňky stimulovány neoznačeným zymosanem (Sigma; 1 částice na buňku) ve 24-jamkových suspenzních deskách po dobu 24 hodin při 37 °C. IL-2 vylučovaný do supernatantů byl kvantifikován pomocí ELISA (BD Biosciences). Tam, kde je uvedeno, byl piceatennol (Sigma) zahrnut na 50 µm.

testy fagocytózy-pro kvantifikaci fagocytózy průtokovou cytometrií byly transdukované nih3t3 fibroblasty nebo RAW264. 7 makrofágy naočkovány na 2 × 105celky/jamka v 6-jamkových destičkách den před experimentem. V případě potřeby byly buňky předběžně ošetřeny 5 µm cytochalasinem D (Calbiochem) po dobu 40 minut při 37 °C, aby se inhibovala fagocytóza, a byly udržovány po celou dobu testu. Buňky se pak promyjí a přidá se FITC značený zymosan (1 částice/buňka) a nechá se vázat po dobu 1 hodiny při 4 °C.po této inkubaci se nevázaný zymosan odstraní promytím a buňky se inkubují při 37°C po dobu 2 h (buňky NIH3T3) nebo 30 minut (buňky RAW264.7), aby se umožnilo vychytávání částic. Množství internalizovaného zymosanu bylo poté stanoveno průtokovou cytometrií, jak bylo dříve popsáno (19). Krátce byl vnější zymosan obarven polyklonálním králičím anti-zymosanem (Invitrogen), který byl následně detekován kozími anti-králičími protilátkami značenými APC (Invitrogen). Průtoková cytometrická analýza byla provedena bránou na FITC-pozitivních buněčných populacích, které vázaly zymosan, a procento internalizace bylo stanoveno porovnáním APC-negativních (internalizovaných částic) versus APC-pozitivních (neinternalizovaných částic) buněčných populací.

vyšetření fagocytózy imunofluorezenční mikroskopií bylo provedeno podobně, s výjimkou toho, že transdukované buňky byly naočkovány na 3 × 104 buněk / jamka na skleněných krytech, bylo přidáno 10 částic na buňku FITC značeného zymosanu a buňky umožnily internalizovat částice po dobu 45 minut při 37 °C. po této inkubaci byly buňky promyty, fixovány 4% paraformaldehydem a permeabilizovány 0,25% saponinu v FACS bloku po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Aktin byl obarven 1 µm tetramethylrhodamin isothiokyanátem (TRITC) značeným phalloidinem (Sigma). Kryty byly namontovány pomocí Vectashield (Vector Laboratories) a zkoumány konvenční fluorescenční mikroskopií na Zeiss Axiovert 40. Obrázky byly zpracovány pomocí Adobe Photoshop verze 6.0.

Imunoprecipitace – 1 × 107 RAW264.7 buňky byly stimulovány pervanadátem po dobu 1 minuty při 37 °C a buňky byly lyzovány v ledově studeném lyzačním pufru (25 mm Tris, pH 8,0, 140 mm NaCl, 4 mm EDTA, 1,1% Nonidet P-40, 10 mm NaF, 1 mm na3vo4) s inhibitory proteázy (Roche Applied Science). Jádra a zbytky buněk byly odstraněny centrifugací a získané supernatanty byly přidány do streptavidinových kuliček (Sigma), předkupovaných biotinylovanými fosforylovanými nebo nefosforylovanými peptidy (25 µm). Peptidy CLEC9A byly generovány komerčně (Sigma) a odpovídaly následující oblasti cytoplazmatického ocasu receptoru, 1MHEEEIYRSLQWD13. Peptidy Dectin-1 byly popsány dříve (11). Kuličky se otáčely po dobu 2 h při 4 °C a poté se promyly, před analýzou Western blotting. Proteiny v imunoprecipitátech byly detekovány pomocí anti-fosfotyrosinu (klon 4G10) a anti-Syk nebo anti-Lyn (Santa Cruz Biotechnology), následované vhodnými sekundárními protilátkami vázanými na křenovou peroxidázu (Jackson).