Checkpoint kinase 1 (Chk1)-short is een splice variant en endogene remmer van Chk1 die de celcyclus en DNA schade controlepunten

resultaten en discussie

tijdens onze studie van DNA schade signalering (32, 33), we waargenomen twee prominente banden in chk1 immunobloten: de chk1 band op 56 kDa en een sneller migreren band van 43 kDa. De sneller-migrerende band werd ontdekt door antilichamen Chk1 die aan het interne kinasedomein of de C-eindsequentie reactief waren, maar niet door antilichamen chk1 die de terminus van N erkennen (Fig. 1 bis). Deze band werd niet herkend door het g4 monoklonale antilichaam uit Santa Cruz Biotechnologie dat algemeen wordt gebruikt voor immunoblot analyse van Chk1 (24, 29). Het neerhalen van Chk1 via siRNA leidde tot het verdwijnen van zowel Chk1 als de 43-kDa band, wat hun relevantie verder bevestigde (Fig. 1 ter). Het 43-kDa-eiwit werd niet beïnvloed door proteasoom en proteaseremmers (SI Appendix, Fig. 1), het verhogen van de mogelijkheid dat het een alternatieve splice variant van Chk1 zou kunnen zijn. Het National Center for Biotechnology Information database bevat momenteel drie alternatief gesplitste menselijke chk1 mRNA ’s die verschillende onvertaalde regio’ s hebben, maar hetzelfde Chk1-eiwit van 476 aminozuren (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111) over de volledige lengte coderen. Echter, onze Analyse met behulp van een Est-gebaseerde alternatieve splicing predictive database (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) suggereerde de mogelijkheid van een unieke splice variant van Chk1 waarin exon 3 alternatief wordt gesplitst of verwijderd. Om deze mogelijkheid direct te testen, voerden wij RT-PCR uit gebruikend primers binnen de chk1 codeeropeenvolging (Fig. 1C). RT-PCR met behulp van de primer set P1, waarin de forward primer werd ontworpen binnen exon 3, genereerde een enkele amplicon van de verwachte grootte, terwijl RT-PCR met de P2 of P3 primer set (beide gebaseerd op sequenties flankerend exon 3) twee amplicons genereerde, een met de verwachte grootte van Chk1 en de andere ∼200 bp korter (Fig. 1C). Het rangschikken bevestigde dat het langere amplicon inderdaad Chk1 was en, met name, het kortere amplicon een alternatieve lasvariant van Chk1 was zonder exon 3 (Fig. 1D en SI aanhangsel, Fig. 2 bis). Deze splice variant werd voorspeld te vertalen in een n-terminaal afgeknotte vorm van Chk1 bestaande uit 382 aminozuren die we chk1-short, of Chk1-S (Fig. 1D en SI aanhangsel, Fig. 2). In gelelektroforese migreerde in vitro vertaalde Chk1-S op dezelfde manier als het 43 – kDa-eiwit uit HEK293-cellen (Fig. 1E). Wij verder immunoprecipiteerden de 43-kDa proteã ne van hek293 cel lysate voor massaspectrometrie en bevestigden zijn identiteit als Chk1-S. N-terminale afkaping in Chk1-S is consistent met de immunoblot resultaten die aantonen dat het niet werd herkend door de antilichamen die reageren op de N-terminale sequentie van Chk1 (Fig. 1 bis). Real-time en RT-PCR analyse gedetecteerd chk1-s mRNA expressie in meerdere menselijke weefsels, en de expressie is over het algemeen hoger in foetale weefsels (SI Appendix, Fig. 3 A en D). Immunoblot analyse verder ontdekt chk1-s eiwituitdrukking in menselijke, muis, en rat cellijnen, en ook in menselijke foetale weefsels (si Appendix, Fig. 3B) en primaire renale tubulaire cellen bij muizen (SI Appendix, Fig. 3C). De volledige cDNA van Chk1-S werd ook gekloond uit drie normale menselijke weefsels (thymus, colon, foetale lever) en gesequenced om te bevestigen dat het codeert voor een n-terminaal afgeknotte splice variant van Chk1. Samen, hebben deze experimenten een unieke lasvariant van Chk1 geà dentificeerd die n-terminally wordt afgekapt en wijd in zoogdiercellen en weefsels wordt uitgedrukt.

Wat is de functie van Chk1-S? Regelt het de controlepunten van de celcyclus zoals Chk1? Met deze vragen bepaalden we eerst de temporele en ruimtelijke expressiepatronen van Chk1-S in de celcyclus. HEK293 cellen werden gesynchroniseerd bij g1, G1/S, of G2/M fasen door serum verhongering, dubbel thymidine blok, of nocodazole, respectievelijk. Chk1-S was laag in G1-fase cellen en hoger in G1/S en G2 / M cellen (SI Appendix, Fig. 4 A en B). Bovendien, toen de cellen bij de fase van G1/S door dubbel thymidine blok werden gesynchroniseerd en toen vrijgegeven, stegen zowel chk1 als chk1-s uitdrukking na het ingaan van S fase (Fig. 2 bis). Een duidelijk verschil tussen chk1 en chk1-s expressie was dat terwijl chk1 expressie piekte in de mid-s fase, Chk1 – s expressie bleef toenemen van de s naar M fase (Fig. 2 bis). Interessant, werden de hoge niveaus van chk1-s uitdrukking waargenomen bij 7 h na de versie van de celcyclus van dubbel thymidine blok, een tijdstip toen cellen nog mitotic waren (si bijlage, Fig. 4C). We gekwantificeerd verder de verhouding Chk1-S:Chk1 in asynchrone en s of G2 / M gesynchroniseerde cellen. Ondanks de variaties van chk1-s expressie in HEK293, u2os en primaire renale tubulaire cellen, was de chk1-S:Chk1 verhouding boven 1 in alle cellen in de G2/M fase (SI Appendix, Fig. 5). In asynchrone cellen werden Chk1-S en Chk1 voornamelijk gelokaliseerd in de kern (SI Appendix, Fig. 6 bis). Echter, in G2 / M-fase cellen, sommige Chk1-S en Chk1 geaccumuleerd in centrosomen (SI Appendix, Fig. 6 B en C). De lokalisatie van Chk1 in centrosomes is kritiek voor zijn G2/M controlepuntfunctie, waar het voorbarige activering van Cdk1 en mitotic ingang (34, 35) verhindert. Onze resultaten wijzen erop dat Chk1-S ook aan centrosomes kan lokaliseren, die een ruimtelijke en temporele verordening van Chk1 verstrekken om mitotic ingang in werking te stellen. Vervolgens bepaalden we de effecten van chk1 of Chk1-s overexpressie in HEK293 en u2os cellen. Vergeleken met GFP-Chk1, veroorzaakte GFP-Chk1-S een onderscheiden nucleair fenotype dat door nucleaire condensatie en vorming van micronuclei en veelvoudige of meervoudig gelobde kernen werd gekenmerkt (Fig. 2B). Op vroegere tijdpunten, vertoonden de getransfecteerde cellen nucleaire / chromatine condensatie die door zwakke en punctate histone-H3 phosphorylation wordt gekenmerkt (Fig. 2B), indicatief voor premature mitotische entry. Later ontwikkelden deze cellen micronuclei of meerlobbige kernen, kenmerken van mitotische catastrofe (Fig. 2B). Het tellen van cellen toonde aan dat GFP-Chk1-S het nucleaire fenotype in ∼20% van u2os cellen veroorzaakte (Fig. 2C). Soortgelijke effecten werden aangetoond door YFP-Chk1-S en Chk1-s-Myc (Fig. 2C), wat aangeeft dat het waargenomen nucleaire fenotype werd geïnduceerd door Chk1-S en niet door de fusie-eiwit tags. In tegenstelling, premature mitotische entry werd niet veroorzaakt door Chk1 of zijn kinase-dode mutant Chk1-KD (Fig. 2C). Chk1-S veroorzaakte ook het opvallende nucleaire fenotype in andere celtypes (si bijlage, Fig. 7). Met name werd een soortgelijk nucleair fenotype gerapporteerd in cellen en muismodellen zonder één of beide chk1-allelen (7, 36, 37), wat erop wijst dat Chk1-S kan werken als een endogene remmer van Chk1. Om deze mogelijkheid verder te testen, produceerden wij TET-op u2os cellijnen die kunnen worden veroorzaakt om Chk1, Chk1-KD, of Chk1-S. uit te drukken de cellen werden gesynchroniseerd in G1/S fase door dubbel thymidine blok, veroorzaakt door doxycycline, en dan vrijgegeven in nocodazole-bevattend medium. Ongeveer 80% van chk1-s-uitdrukkende cellen ging mitose in , terwijl ∼60% van chk1 – of Chk1-KD-uitdrukkende cellen deed (Fig. 2D). Belangrijk, terwijl de meeste mitotische cellen in de chk1-en Chk1-KD-uitdrukkende groepen 4n DNA hadden, ∼25% van de mitotische cellen van de chk1-S-uitdrukkende groep minder dan 4N DNA inhoud had (Fig. 2D), indicatief voor afwijkende mitotische ingang in deze cellen zonder voltooiing van de replicatie van DNA. Bovendien resulteerde de overexpressie van Chk1-S in vroegere ingang in mitose, zoals door het verschijnen van pH3-positieve cellen wordt aangegeven (si bijlage, Fig. 8). Chk1 is een belangrijke regelgever van mitotic ingang of de s-aan-G2/M overgang in de celcyclus. Door cdc25a te fosforyleren (het veroorzaken van zijn degradatie) en Wee1, verhindert Chk1 activering CDK1 en mitotic ingang (5, 15-20). We toonden aan dat inductie van Chk1-s door doxycycline in de Tet-on u2os-cellen resulteerde in hogere niveaus van CDC25A en lagere niveaus van fosfo-CDK1, wat suggereert dat Chk1-s Chk1 antagoniseerde om mitotische entry te induceren (Fig. 2E). Het specifieke neerhalen van Chk1-s via RNAi was niet succesvol omdat de opeenvolging Chk1-S in chk1 mRNA is vervat. Nochtans, kon een antisense oligonucleotide complementair aan de unieke verbinding exon2-exon4 in chk1-S specifiek chk1-s uitdrukking verminderen (si bijlage, Fig. 9 bis). Chk1-s down-regulation aanzienlijk verminderde celproliferatie (SI Appendix, Fig. 9B). Interessant, chk1-s down-verordening veranderde niet beduidend het profiel van de celcyclus (si bijlage, Fig. 9C). Omdat Chk1 op verscheidene controlepunten van de celcyclus functioneert (b. v., G2/M, spindel, intra-S), kan Chk1-S Chk1 antagoniseren om de vooruitgang van de celcyclus op veelvoudige plaatsen te vergemakkelijken. Dientengevolge, kan de remming van Chk1-S de celcyclus bij diverse fasen vertragen en in de afschaffing van proliferatie zonder belangrijke veranderingen van de distributie van de celcyclus resulteren.

Hoe werkt Chk1-S chk1 tegenwerken? We veronderstelden dat Chk1-S zou kunnen interageren met Chk1 om zijn kinase activiteit te blokkeren. Consequent, FLAG-Chk1-S uitgedrukt in HEK293 cellen coimmunoprecipitated met endogeen Chk1 (Fig. 3A). Bovendien, in vitro vertaald Myc-Chk1 en Chk1-s coimmunoprecipitated (Fig. 3B), wat een directe chk1–Chk1-S interactie suggereert. Wij demonstreerden verder de coimmunoprecipitation van Chk1 met het n-einddomein, maar niet het C-einddomein, van Chk1-S (Fig. 3C), wat suggereert dat de N-terminale sequentie in Chk1-S nodig is voor zijn interactie met Chk1. Functioneel, bepaalden we de effecten van Chk1-S op chk1 kinase activiteit. Chk1-Myc werd uitgedrukt en immunoprecipitated voor in vitro kinase assay in de afwezigheid of aanwezigheid van gezuiverd Chk1-S. zoals getoond in Fig. 3D, chk1 kinase activiteit werd gedeeltelijk nog significant onderdrukt door Chk1-S, maar niet door warmte-gedenatureerde Chk1-S. In tegenstelling, chk1-S verminderde niet chk2 activiteit, die soortgelijke substraatvoorkeuren als Chk1 heeft. Vergeleken met Chk1 mist Chk1-S een deel van het kinasedomein inclusief de ATP-bindingsplaats (Fig. 1D) en vertoonde, zoals verwacht, geen significante eiwitkinase-activiteit (Fig. 3D). Chk1-S kan ook de kinaseactiviteit van n-terminaal geëtiketteerd chk1 (vlag-Chk1) in een in vitro kinaseanalyse onderdrukken (si bijlage, Fig. 10). Deze resultaten suggereren dat Chk1-S Chk1 via moleculaire interactie kan remmen. Een recente studie toonde aan dat wassen van chk1 immunoprecipitates met een strengere Radio Immuno-Precipitation Assay (RIPA) buffer duidelijk kan verhogen chk1 kinase activiteit, suggereren dat Chk1 normaal wordt geremd door het onderdrukken van factoren (29); nochtans, is de identiteit van de onderdrukkende factoren onbekend. Wij bevestigden het effect van RIPA buffer wassen en, met name, wij toonden verder aan dat de toevoeging van exogene Chk1-S het effect van RIPA buffer wassen op chk1 kinase activiteit kon omkeren (SI bijlage, Fig. 11), wat suggereert dat Chk1-S een van de belangrijkste endogene onderdrukkende factoren voor Chk1 kan zijn.

In de reactie van de schade van DNA (DDR), wordt Chk1 duidelijk geactiveerd via phosphorylation bij s345 en s317 residuen (7, 13, 38, 39). Ondanks erkenning van het belang van s345/s317 phosphorylation, blijft het onduidelijk hoe deze phosphorylation chk1 (28-30) activeert. Wij toonden aan dat de uitdrukking Chk1-S niet merkbaar veranderde in DDR (SI Appendix, Fig. 12). Echter, de chk1-Chk1-S interactie werd verzwakt in de DDR geïnduceerd door camptothecin, een DNA topoisomerase I remmer en DNA-schadelijk middel (Fig. 3E). Met name de dissociatie van Chk1 van Chk1-S in DDR bleek afhankelijk van chk1 fosforylering bij S345/s317, omdat de chk1(S345A / S317A) mutant niet van Chk1-s scheidde tijdens de behandeling met camptothecin (Fig. 3E). In DDR hangt de activering van Chk1 af van ATR-gemedieerde fosforylering (7, 13, 14). We toonden aan dat remming van ATR via een dominant-negatieve mutant (dn-ATR) niet alleen de door camptothecin geïnduceerde chk1-s fosforylering onderdrukte, maar ook de dissociatie van Chk1-Chk1–S verhinderde (Fig. 3F). Op dezelfde manier scheidde Chk1 van Chk1-s tijdens cisplatine-geïnduceerde DDR, en de dissociatie werd voorkomen door dn-ATR (SI Appendix, Fig. 13). Samen suggereren de resultaten dat fosforylering van Chk1 zijn interactie met de endogene remmer Chk1-S kan verstoren, wat leidt tot chk1-activering in DDR.

de identificatie van Chk1-S als een unieke regulator van de progressie van de celcyclus en de cellulaire proliferatie heeft ons ertoe gebracht de expressie ervan in kankerweefsels te onderzoeken. Op het mRNA-niveau, de meeste kankerweefsels uitgedrukt hogere niveaus van Chk1 en Chk1-S dan normale weefsels (SI Appendix, Fig. 14). Interessant, testiculaire carcinomen toonden een duidelijke up-regulatie van Chk1-S maar niet Chk1 (Fig. 4A). Specifieke up-regulatie van Chk1-S werd verder bevestigd door immunoblot analyse in testiculaire carcinoom weefsels, vooral in late stadium kanker monsters (Fig. 4B). Zoals eerder gemeld (5), hadden zowel normale als kwaadaardige testiculaire weefsels hoge niveaus van chk1-expressie. Verhoogde expressie van Chk1-S werd ook gedetecteerd tijdens de progressie van eierstokkanker (Fig. 4B). Het relatief hoge niveau van chk1 en Chk1-S expressie in beide foetale (SI Appendix, Fig. 3) en kanker (Fig. 4) weefsels suggereert dat Chk1-S de progressie van de celcyclus kan versnellen, waardoor celproliferatie onder deze omstandigheden wordt bevorderd.

we onderzochten verder het effect van ectopische chk1-S expressie op xenograft tumorgroei bij muizen. Tumorxenografts werden gevestigd in naakte muizen gebruikend TET-op MDA-MB-231 cellijnen van borstkanker die door doxycycline kunnen worden veroorzaakt om Chk1, Chk1-S, of Chk1-KD uit te drukken. Inductie van Chk1 of Chk1-KD door doxycycline had geen invloed op de tumorgroei; inductie van Chk1-S resulteerde echter in een afname van 40% van het tumorvolume (Fig. 4C). Chk1-s-geïnduceerde tumorweefsels vertoonden ook accumulatie van cdc25A, wat wijst op de remming van Chk1 (Fig. 4E). Hoewel de resultaten een unieke antikankerstrategie kunnen impliceren, blijft de fysiologische relevantie van geforceerde overexpressie van ectopische Chk1-S onduidelijk. Deze resultaten leveren echter een principieel bewijs dat het kantelen van de chk1–Chk1-s balans kan leiden tot mitotische catastrofe en vermindering van celproliferatie.

de waarneming dat chk1-S overexpressie de groei van xenotransplantaten verminderde (Fig. 4 C-E) leek tegenstrijdig met de observatie dat de tumor monsters van menselijke patiënten uitgedrukt relatief hoge niveaus van Chk1-S voor celproliferatie (Fig. 4 A en B en Si aanhangsel, Fig. 14). Om deze gegevens te verzoenen, is het belangrijk om de verschillen tussen de experimentele voorwaarden te erkennen. De vrij hoge chk1-s uitdrukking in menselijke tumors kan aan de aanwezigheid van proliferative cellen in deze weefsels worden toegeschreven. Consistent, is Chk1-S ook hoog in foetale weefsels die zeer proliferative zijn (Si Appendix, Fig. 3A). Belangrijk is dat chk1-S expressie in deze proliferatieve weefsels tijdelijk beperkt is tot de late S tot M fase (Fig. 2 en Si bijlage, Fig. 4). Deze tijdelijke verordening kan ervoor zorgen dat de chk1-activiteit wordt geremd na (en alleen na) de voltooiing van de replicatie van DNA in de S-fase voor de progressie van de celcyclus in de G2/M-fase. Echter, wanneer ectopische Chk1-S wordt gedwongen om overexpress in gekweekte cellen of xenotum tumoren, wordt de tijdelijke beperking van chk1-s expressie verstoord; met andere woorden, Chk1-S is hoog door de celcyclus met inbegrip van S-fase, resulterend in constante blokkade van Chk-1 en voortijdige mitotische ingang, wat leidt tot mitotische catastrofe en verminderde celproliferatie.

concluderend heeft deze studie een lasvariant van Chk1, Chk1-S, geïdentificeerd die een belangrijke regulator van Chk1 is in de normale celcyclus en tijdens DDR (SI Appendix, Fig. 15). In de onverstoorde celcyclus neemt de chk1-expressie toe bij S-fase en sommige chk1-moleculen kunnen gefosforyleerd zijn door ATR die de binding van Chk1-S verhinderen, resulterend in hoge chk1-activiteit en S-fase-onderhoud tot de voltooiing van de replicatie van DNA. In de G2-fase neemt de chk1-s-expressie toe en, zoals gerapporteerd (29), neemt de chk1–fosforylering af, waardoor een chk1-Chk1-s-interactie wordt bevorderd om de chk1-activiteit te onderdrukken. De afname van de chk1-activiteit in de G2/M-fase is cruciaal voor mitotische entry. Onder omstandigheden van chk1-s inductie of overexpressie, overmatige hoeveelheden Chk1-s sequesteren Chk1 en verminderen de kinaseactiviteit tijdens de S-fase, resulterend in voortijdige mitotische entry zonder voltooiing van DNA-replicatie, wat leidt tot mitotische catastrofe. Tijdens DNA-schade, is Chk1 gefosforyleerd, resulterend in verminderde chk1-s Band, verhoogde chk1 activiteit, en G2/M arrestatie (si bijlage, Fig. 11). Onze bevindingen ondersteunen het” de-repressie ” mechanisme van chk1 activering (29). Belangrijk is dat Chk1-S een van de belangrijkste onderdrukkende factoren van chk1-activiteit lijkt te zijn. Door chk1 tegen te werken, kan Chk1-S de celcyclus versnellen, wat leidt tot verhoogde proliferatie in foetale en kankerweefsels. De hoge niveaus van Chk1 in prolifererende cellen coördineren S fase en mitose, terwijl de hoge niveaus van Chk1-S een krachtige schakelaar voor de s-aan-G2/M faseovergang kunnen verstrekken. In tegenstelling, veroorzaakt geforceerde overexpressie van Chk1-S op bovenmatige niveaus, onevenwichtig door Chk1, voortijdige mitotische binnenkomst en celdood (Fig. 2) en onderdrukt tumorgroei in tumorxenotransplantaatmodellen (Fig. 4). Chk1 is voorgesteld om een effectief therapeutisch doel in kankertherapie te zijn, en de inhibitors van Chk1 worden geëvalueerd in klinische proeven (40-43). De identificatie van Chk1-S als endogene inhibitor van Chk1 kan nieuwe gebieden van onderzoek in de regelgeving van de celcyclus, de reactie van de schade van DNA, en kankertherapie openen.