Resultados e Discussão
Durante nosso estudo de danos ao DNA de sinalização (32, 33), observamos dois proeminentes bandas de Chk1 immunoblots: o Chk1 banda de 56 kDa e mais rápida migração de banda de 43 kDa. A faixa de migração mais rápida foi detectada por anticorpos Chk1 que foram reativos ao Domínio cinase interno ou à sequência C-terminal, mas não por anticorpos Chk1 reconhecendo o terminus N(Fig. 1A). Esta banda não foi reconhecida pelo anticorpo monoclonal G4 da biotecnologia Santa Cruz que é comumente usado para a análise imunoblot de Chk1 (24, 29). Knockdown of Chk1 via siRNA levou ao desaparecimento tanto da banda Chk1 quanto da banda 43-kDa, confirmando ainda mais sua relevância (Fig. 1B). A proteína de 43 kDa não foi afectada pelo proteosoma e pelos inibidores da protease (apêndice SI, Fig. 1), levantando a possibilidade de que poderia ser uma variante alternativa do chk1. O National Center for Biotechnology Information database atualmente lista três mRNAs Chk1 humanos alternativamente com spliced que têm diferentes regiões não traduzidas, mas codificam a mesma proteína Chk1 de 476 aminoácidos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). No entanto, a nossa análise usando um banco de dados preditivo baseado em splicing alternativo baseado em EST (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) sugeriu a possibilidade de uma variante de splice única de Chk1 em que exon 3 é alternativamente spliced ou deletado. Para testar diretamente esta possibilidade, realizamos RT-PCR usando iniciadores dentro da sequência de codificação Chk1(Fig. 1C). RT-PCR, usando o conjunto de primers P1, em que o forward primer foi projetado dentro do éxon 3, gerado um único produto amplificado de tamanho esperado, considerando que a RT-PCR com o P2 ou P3 conjunto de primers (ambos baseados em seqüências de acompanhamento exão 3) gerou dois amplicons, uma com o tamanho esperado do Chk1 e o outro ∼200 bp menor (Fig. 1C). Sequenciamento confirmou que o amplificador mais longo era de fato Chk1 e, notavelmente, o amplificador mais curto era uma variante alternativa do chk1 sem exon 3 (Fig. 1D and SI Appendix, Fig. 2A). Esta variante de splice foi prevista para se traduzir em uma forma n-terminalmente truncada de Chk1 consistindo de 382 aminoácidos que denominamos Chk1-short, ou Chk1-S (Fig. 1D and SI Appendix, Fig. 2). In gel electroforese, in vitro translated Chk1-S migrated similarly as the 43-kDa protein from HEK293 cells(Fig. 1E). Além disso, imunoprecipitou a proteína de 43 kDa do lisato de células HEK293 para espectrometria de massa e confirmou a sua identidade como Chk1-S. A truncação N-terminal no Chk1 – s é consistente com os resultados do imunoblot mostrando que não foi reconhecido pelos anticorpos reativos à sequência N-terminal do Chk1 (Fig. 1A). A análise em tempo Real e RT-PCR detectou a expressão de mRNA Chk1 – s em vários tecidos humanos, e a expressão é geralmente mais elevada em tecidos fetais (Apêndice SI, Fig. 3 A E D). A análise imunoblot detectou ainda a expressão proteica Chk1-s nas linhagens de células humanas, de rato e de Rato, bem como nos tecidos fetais humanos (Apêndice SI, Fig. 3B) e células tubulares renais primárias do Ratinho (Apêndice SI, Fig. 3C). O cDNA completo de Chk1 – S também foi clonado a partir de três tecidos humanos normais (timo, cólon, fígado fetal) e sequenciado para confirmar que ele codifica uma variante n-terminalmente truncada do chk1. Juntos, estes experimentos identificaram uma variante única do chk1 que é N-terminalmente truncada e amplamente expressa em células e tecidos de mamíferos.
identificação do Chk1 – s como uma variante única e truncada do Chk1. (A) o lisato de células HEK293 foi analisado por imunoblotting usando anticorpos que reconhecem especificamente o terminus N (α-Chk1-NT), o domínio da cinase (α-Chk1-KD), ou o terminus C do Chk1 (α-Chk1-CT). Além do Chk1, uma proteína de 43 kDa foi revelada por α-Chk1-KD e α-Chk1-CT, mas não Por α-Chk1-NT. B) as células HEK293 foram transfectadas com siRNA Chk1 (siChk1) ou uma sequência codificada (siCon) durante 48 h para recolher lisato de células inteiras para análise imunoblot utilizando α-Chk1-KD. siChk1 diminuiu a expressão tanto da proteína Chk1 quanto da proteína 43-kDa. (C) RNA was isolated from HEK293 cells for RT-PCR using three different sets of primers for Chk1: P1, P2, and P3 (relative sequence locations are shown in the diagram). Dois amplificadores foram detectados pela RT-PCR usando os conjuntos de iniciadores flanqueando exon 3 (P2 e P3), enquanto apenas um amplificador foi amplificado usando o conjunto de primer P1, do qual o primer dianteiro estava dentro do exon 3 do Chk1. D) representação esquemática da articulação alternativa do Chk1, resultando numa proteína N-terminal truncada, Chk1-S. (E) o Chk1-s foi clonado para tradução in vitro, e a proteína traduzida juntamente com o lisato de células HEK293 foram analisados por análise imunoblot. In vitro translated Chk1 migrated similarly to the 43-kDa band in HEK293 cells.
Qual é a função do Chk1-s? Regula pontos de controlo do ciclo celular como o Chk1? Com estas questões, determinamos primeiramente os padrões de expressão temporal e espacial de Chk1-S no ciclo celular. As células HEK293 foram sincronizadas nas fases G1, G1/S, ou G2/M por fome sérica, bloqueio duplo de timidina ou nocodazol, respectivamente. O Chk1-S foi baixo nas células de fase G1 e superior nas células G1/S e G2/M (Apêndice SI, Fig. 4 A E B). Além disso, quando as células foram sincronizadas na fase G1/S por duplo bloco de timidina e então liberadas, tanto a expressão Chk1 e Chk1-s aumentou após entrar na fase S (Fig. 2A). Uma diferença distinta entre a expressão Chk1 e Chk1-S foi que, enquanto a expressão Chk1 atingiu o pico na fase Mid-S, a expressão Chk1-s continuou a aumentar da fase S para a fase M (Fig. 2A). Curiosamente, níveis elevados de expressão de Chk1-s foram observados às 7 horas após a libertação do ciclo celular a partir do duplo bloco de timidina, um ponto Temporal em que as células ainda estavam para ser mitóticas (Apêndice SI, Fig. 4C). Nós quantificamos ainda a razão Chk1-S: Chk1 em células sincronizadas assíncronas e S ou G2/M. Apesar das variações da expressão de Chk1-s em HEK293, U2OS e células tubulares renais primárias, a razão Chk1-s:Chk1 estava acima de 1 em todas as células na fase G2/M (Apêndice SI, Fig. 5). Em células assíncronas, Chk1 – s e Chk1 foram localizados principalmente no núcleo (Apêndice SI, Fig. 6A). No entanto, em células de fase G2 / M, alguns Chk1-s e Chk1 acumularam-se em centrosomas (Apêndice SI, Fig. 6 B E C). A localização do Chk1 nos centrosomas é fundamental para a sua função de ponto de verificação G2/M, onde previne a ativação prematura do Cdk1 e a entrada mitótica (34, 35). Nossos resultados indicam que o Chk1-S também pode se localizar a centrosomas, proporcionando uma regulação espacial e temporal do Chk1 para iniciar a entrada mitótica. Em seguida, determinamos os efeitos da sobreexpressão Chk1 ou Chk1-s nas células HEK293 e U2OS. Comparado com GFP-Chk1, GFP-Chk1-S induziu um fenótipo Nuclear distinto que foi caracterizado pela condensação nuclear e formação de micronúcleos e núcleos múltiplos ou múltiplos (Fig. 2B). Em momentos anteriores, as células transfectadas mostraram condensação nuclear / cromatina marcada por fosforilação histona-H3 fraca e pontuada(Fig. 2B), indicativo de entrada mitótica prematura. Mais tarde, estas células desenvolveram micronúcleos ou núcleos multicolobados, características da catástrofe mitótica (Fig. 2B). A contagem de células mostrou que o GFP-Chk1-S induziu o fenótipo nuclear em ∼20% das células U2OS (Fig. 2C). Efeitos semelhantes foram apresentados por YFP-Chk1 – s e Chk1-s-Myc (Fig. 2C), indicando que o fenótipo nuclear observado foi induzido pelo Chk1-S e não pelas marcas de proteínas de fusão. Em contraste, a entrada mitótica prematura não foi induzida pelo Chk1 ou pelo seu mutante morto por cinase Chk1-KD (Fig. 2C). Chk1 – S também induziu o fenótipo Nuclear impressionante em outros tipos de células (Apêndice SI, Fig. 7). Notavelmente, um fenótipo nuclear similar foi relatado em células e modelos murinos sem um ou ambos alelos Chk1 (7, 36, 37), sugerindo que Chk1-s pode atuar como um inibidor endógeno do Chk1. Para testar ainda mais esta possibilidade, nós geramos linhas celulares Tet-on U2OS que podem ser induzidas a expressar Chk1, Chk1-KD, ou Chk1-S. As células foram sincronizadas na fase G1/S por duplo bloco de timidina, induzido pela doxiciclina, e então liberado em meio contendo nocodazol. Cerca de 80% das células que expressam Chk1-S entraram na mitose , enquanto ∼60% das células que expressam Chk1 – ou Chk1-KD entraram (Fig. 2D). Importante, enquanto que a maioria das células mitóticas nos grupos que expressam o Chk1 e o Chk1 – KD tinham DNA 4n, ∼25% das células mitóticas do grupo que expressava o Chk1-S tinham menos de 4N de DNA(Fig. 2D), indicativo de entrada mitótica aberrante nestas células sem completar a replicação do ADN. Além disso, a sobreexpressão Chk1-s resultou na entrada anterior na mitose, como indicado pelo aparecimento de células pH3-positivas (Apêndice SI, Fig. 8). O Chk1 é um regulador chave da entrada mitótica ou da transição S-para-G2/M no ciclo celular. Através da fosforilação do CDC25A (induzindo a sua degradação) e do Wee1, o Chk1 previne a activação do CDK1 e a entrada mitótica (5, 15-20). Nós mostramos que a indução de Chk1 – s pela doxiciclina nas células U2OS Tet-on resultou em níveis mais elevados de CDC25A e níveis mais baixos de fosfo-CDK1, sugerindo que Chk1-s antagonizou Chk1 para induzir a entrada mitótica (Fig. 2E). Knockdown específico de Chk1-s via RNAi não foi bem sucedido porque a sequência Chk1-s está contida em chk1 mRNA. However, an antisense oligonucleotide complementary to the unique exon2-exon4 junction in Chk1-S could specifically reduce Chk1-S expression (SI Appendix, Fig. 9A). Chk1-S down-regulation markedly reduced cell proliferation (SI Appendix, Fig. 9B). Curiosamente, a regulação descendente Chk1-s não alterou significativamente o perfil do ciclo celular (apêndice SI, Fig. 9C). Como o Chk1 funciona em vários pontos de verificação do ciclo celular (por exemplo, G2/M, spindle, intra-S), O Chk1-S pode antagonizar o Chk1 para facilitar a progressão do ciclo celular em múltiplos locais. Como resultado, a inibição da Chk1 – s pode atrasar o ciclo celular em várias fases e resultar na supressão da proliferação sem grandes alterações na distribuição do ciclo celular.
regulação do ciclo celular por Chk1-S. A) as células HEK293 foram sincronizadas por duplo bloqueio da timidina e depois libertadas em meio contendo nocodazol. Perfil do ciclo celular (esquerdo) analisado por coloração de iodeto de propídio (PI) e análise FACS. (Direita) análise Imunoblot de Chk1 e Chk1-s na célula lisato colhido nos pontos de tempo indicados após a libertação do bloco timidina. As células assíncronas (B) U2OS foram transfectadas com GFP-Chk1 ou GFP-Chk1-S (verde), e então fixadas para imunofluorescência de fosfo-histona H3 (vermelho) e coloração nuclear com Hoechst33342 (azul). (Superior) Chk1-s, mas não Chk1, induziu condensação prematura de cromatina e fraca coloração de pH3 (setas). (Lower) At late stage, Chk1-S-transfected cells showed the characteristics of mitotic catastrophe including micronuclei and multilobed nuclei (arrows). C) As células U2OS foram transfectadas com os genes indicados e as células com o fenótipo nuclear de condensação prematura de cromatina e catástrofe mitótica foram contadas. Os dados indicam a média ± DP; * P < 0, 05 versus Grupo vector. Os resultados mostram que a sobreexpressão Chk1-s especificamente levou ao fenótipo nuclear. D) as células U2OS foram transfectadas com os genes indicados, sincronizadas por duplo bloco de timidina, e libertadas durante 7 h. as células foram então fixadas para imunofluorescência pH3 e coloração de PI e analisadas por FACS. Os dados indicam a média ± DP; * P < 0, 05 versus Grupo vector. Os resultados mostram que o Chk1-s induziu especificamente uma entrada mitótica prematura sem completar a replicação do ADN (células com <4N de ADN). E) as células U2OS Tet-on foram induzidas com ou sem doxiciclina. As células foram então sincronizadas na fase S por bloco duplo de timidina e liberadas por 7 h. O lisato de células inteiras foi recolhido para análise imunoblot das proteínas indicadas. Os resultados mostram que a expressão Chk1-s induzida levou a um aumento de CDC25A e diminuição de fosfo-CDK1, contribuindo para a entrada mitótica prematura.
como é que o Chk1-S antagoniza o Chk1? Hipotetizamos que o Chk1-S poderia interagir com o Chk1 para bloquear a sua actividade cinase. Consistentemente, FLAG-Chk1-s expresso em células HEK293 coimmunoprecipitado com chk1 endógeno (Fig. 3A). Além disso, In vitro traduziu Myc-Chk1 e Chk1-S coimmunoprecipitated (Fig. 3B), sugerindo uma interação direta Chk1-Chk1-S. Demonstrámos ainda a coimmunoprecipitação do Chk1 com o domínio N-terminal, mas não o domínio C-terminal, do Chk1-S (Fig. 3C), sugerindo a exigência da sequência N-terminal em Chk1-S para sua interação com Chk1. Funcionalmente, determinamos os efeitos do Chk1 – s na atividade da kinase do Chk1. Chk1-Myc foi expresso e imunoprecipitado para o ensaio in vitro de cinase na ausência ou presença de Chk1-S. purificado, como demonstrado na Fig. 3D, Chk1 quinase atividade foi parcialmente ainda significativamente suprimido por Chk1-S, mas não pelo calor-desnaturado Chk1-S. Em contraste, Chk1-S não diminuir Chk2 atividade, que tem similares substrato preferências como Chk1. Comparado com o Chk1, o Chk1-S carece de parte do domínio kinase, incluindo o site ATP-binding (Fig. 1D) e, como esperado, não apresentaram actividade significativa de cinase proteica(Fig. 3D). O Chk1-S pode também suprimir a actividade cinase do Chk1 marcado terminalmente (FLAG-Chk1) num ensaio in vitro de cinase (Apêndice SI, Fig. 10). Estes resultados sugerem que o Chk1 – s pode inibir o Chk1 através da interacção molecular. Um estudo recente mostrou que a lavagem de imunoprecipitados Chk1 com um tampão de Radio-Precipitação Mais rigoroso (RIPA) pode aumentar significativamente a actividade da cinase Chk1, sugerindo que o Chk1 é normalmente inibido por factores de repressão (29); no entanto, a identidade dos factores de repressão é desconhecida. Nós confirmamos o efeito da lavagem buffer RIPA e, notavelmente, nós mostramos ainda que a adição de Chk1-s exógenos poderia reverter o efeito da lavagem buffer RIPA na atividade cinase Chk1 (Apêndice SI, Fig. 11), sugerindo que o Chk1 – s pode ser um dos principais factores endógenos de repressão do Chk1.
Chk1-S interage com Chk1 para suprimir a sua actividade cinase. A) as células HEK293 foram transfectadas com FLAG-Chk1-s ou vector vazio para recolher lisato para imunoprecipitação (IP) utilizando anticorpos anti-FLAG. Os imunoprecipitados foram analisados para os anticorpos Chk1 e FLAG-Chk1-s por imunoblotting usando anticorpos anti-FLAG e anti-n terminus Chk1, respectivamente. Os resultados mostram o co-IP do FLAG-Chk1-s com o endógeno Chk1. B) os Chk1-Myc e Chk1-s foram produzidos utilizando o kit de transcrição/tradução in vitro de TnT (Promega). (Esquerda) in vitro produziram Chk1-Myc e Chk1-s demonstrados por imunoblotting. (Direita) Chk1-Myc foi imunoprecipitado usando anticorpos anti-Myc após incubação com ou sem Chk1-S. Os imunoprecipitados foram analisados para Chk1-s e Chk1-Myc por imunoblotting. Os resultados indicam uma interacção directa entre as células Chk1 e Chk1-S. (C) HEK293 foram transfectadas com células Chk1-s marcadas com Myc ou com os seus mutantes C-ou n – terminais de eliminação para recolher lisato para imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-Myc. Os imunoprecipitados foram examinados para a presença de Chk1. Os resultados demonstram a coimmunoprecipitação do Chk1 com o Chk1-s e o seu mutante de deleção C-terminal, mas não com o seu mutante de deleção N-terminal. D) as células HEK293 foram transfectadas com Chk1-s, Chk1 ou Chk2 marcados com Myc para recolher lisato para imunoprecipitação utilizando anticorpos anti-Myc. Os imunoprecipitados, contendo Chk1-S-Myc, Chk1-Myc ou Chk2-Myc, foram incubados com ou sem Chk1-S durante 1 h E, em seguida, adicionados ao ensaio de actividade cinase utilizando Chktide como substrato. O Chk1 – S desnaturado foi preparado por ebulição. Os dados indicam a média ± DP; * P < 0, 05 versus o Grupo Chk1-Myc. Os resultados mostram que o chk1-s nativo pode inibir especificamente o Chk1. E) as células HEK293 foram transfectadas com mutantes Chk1-Myc ou Chk1-Myc(S317A/S345A). As células foram então tratadas ou tratadas com 100 nM de camptotecina durante 2 h para recolher lisato para imunoprecipitação com anticorpos anti-Myc. Os imunoprecipitados foram analisados para o Myc-Chk1, fosforilados (serina 345) Chk1 e Chk1-s por imunoblotting. A entrada de Chk1 também foi verificada nas amostras. Os resultados mostram que o chk1-s coimmunoprecipitava ou estava associado ao Chk1 nas células normais e que a associação estava diminuída durante os danos de ADN induzidos pela camptotecina. No entanto, a associação entre Chk1-s e o mutante Chk1(S345A/S317A) não foi interrompida durante danos no DNA, sugerindo que a fosforilação do Chk1 em S345 e S317 pode ser necessária para a dissociação do Chk1-s do Chk1. F) as células HEK293 foram co-transferidas com um vector Chk1-Myc + vazio ou Chk1-Myc + dn-ATR, seguido de um tratamento com 100 nM de camptotecina durante 2 h. O lisato celular foi recolhido para imunoprecipitação com anticorpos anti-Myc, seguido de uma análise imunoblot das proteínas indicadas. Os resultados mostram que a ruptura induzida pela camptotecina da dissociação Chk1-Chk1–s depende da fosforilação ATR e Chk1.
na resposta às lesões do ADN (DDR), o Chk1 é marcadamente activado através da fosforilação nos resíduos S345 e S317.(7, 13, 38, 39). Apesar do reconhecimento da importância da fosforilação S345/s317, não é claro como esta fosforilação ativa Chk1 (28-30). Nós mostramos que a expressão do Chk1-s não mudou apreciavelmente em DDR (si Apêndice, Fig. 12). No entanto, a interacção Chk1–Chk1-s foi atenuada na DDR induzida pela camptotecina, um inibidor da topoisomerase I do ADN e um agente prejudicial ao ADN (Fig. 3E). Nomeadamente, a dissociação de Chk1 de Chk1-S em DDR apareceu dependente Chk1 fosforilação em S345/S317, porque o Chk1(S345A/S317A) mutante não dissociar a partir de Chk1-S durante camptothecin tratamento (Fig. 3E). Na DDR, a ativação do Chk1 depende da fosforilação mediada pelo ATR (7, 13, 14). Demonstrámos que a inibição da ATR através de um mutante negativo dominante (dn-ATR) não só suprimiu a fosforilação Chk1-s induzida pela camptetecina, como também impediu a dissociação Chk1-Chk1-s (Fig. 3F). Da mesma forma, o Chk1 dissociado do Chk1-S durante a DDR induzida pela cisplatina, e a dissociação foi impedida pelo DN-ATR (Apêndice SI, Fig. 13). Em conjunto, os resultados sugerem que a fosforilação do Chk1 pode perturbar a sua interacção com o inibidor endógeno Chk1-s, conduzindo à activação do Chk1 em DDR.
a identificação do Chk1 – s como um regulador único da progressão do ciclo celular e da proliferação celular levou-nos a examinar a sua expressão em tecidos cancerígenos. Ao nível do ARNm, a maioria dos tecidos cancerígenos expressou níveis mais elevados de Chk1 e Chk1 – s do que os tecidos normais (Apêndice SI, Fig. 14). Curiosamente, carcinomas testiculares mostraram uma marcada regulação superior de Chk1 – s, mas não Chk1(Fig. 4A). A regulação específica do Chk1 – s foi confirmada pela análise imunoblot em tecidos de carcinoma testicular, especialmente em amostras de cancro em fase terminal (Fig. 4B). Tal como notificado anteriormente (5), tanto os tecidos testiculares normais como os malignos apresentavam níveis elevados de expressão Chk1. Foi também detectado um aumento da expressão de Chk1-s durante a progressão do cancro do ovário (Fig. 4B). O nível relativamente alto de Chk1 e Chk1-s expressão em ambos fetal(Apêndice SI, Fig. 3) e cancro (Fig. 4) Os tecidos sugerem que o Chk1-S pode acelerar a progressão do ciclo celular, promovendo a proliferação celular nestas condições.
chk1-s regulação do cancro. A) análise PCR em tempo Real da expressão do ARNm Chk1 e Chk1-s em tecidos testiculares normais e amostras de carcinoma testicular, apresentando regulação do carcinoma Chk1-s em carcinomas testiculares. B) análise Imunoblot do Chk1 e do Chk1-s nos tecidos do cancro testicular e testicular normal em humanos, com expressão aumentada do Chk1-s nos tecidos do cancro em Estadio tardio. (C) ratos nus foram injectados com 10 × 106 células Tet-on MDA-MB-231 que eram indutíveis da Doxiciclina para expressar Chk1, Chk1-KD, ou Chk1-S, respectivamente. Após o estabelecimento tumoral atingir ∼100 mm3, os ratinhos foram mantidos em água potável com ou sem doxiciclina. O volume tumoral foi medido semanalmente (mostrado para os valores da quarta semana, n = 8). Os dados indicam média ± DP. Os resultados mostram que a expressão induzida de Chk1-S, mas não Chk1 ou Chk-KD, inibiu o crescimento do tumor. D) Densitometria dos resultados imunoblot da expressão Chk1-Myc induzida pela doxiciclina, Chk1-KD-Myc e chk1-S-Myc em tumores excisados (n = 3 para cada grupo). Os sinais foram normalizados com Chk1-Myc (arbitrariamente definido como 100). Os dados indicam média ± DP. Os resultados mostram que a doxiciclina induziu níveis similares de expressão de Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc, e Chk1-S-Myc nos tumores. E) os ratos nus foram injectados com células indutíveis de Chk1-S para estabelecer tumores e, em seguida, mantidos na água de beber com ou sem doxiciclina durante 4 wk. Os tecidos tumorais foram coletados para análise de imunoblot. Os resultados mostram maior expressão CDC25A no tumor xenografts com a expressão Chk1-s induzida pela doxiciclina.
examinámos ainda o efeito da expressão ectópica Chk1-s no crescimento do tumor xenogénico em ratinhos. Xenografts tumorais foram estabelecidos em ratinhos nus usando linhas celulares Tet-on MDA-MB-231 de câncer de mama que podem ser induzidas pela doxiciclina para expressar Chk1, Chk1-s, ou Chk1-KD. A indução de Chk1 ou Chk1-KD pela doxiciclina não afectou o crescimento tumoral; no entanto, a indução de Chk1-S resultou numa redução de 40% no volume tumoral (Fig. 4C). Os tecidos tumorais induzidos pelo Chk1 também mostraram acumulação cdc25A, indicando a inibição do Chk1(Fig. 4E). Embora os resultados possam implicar uma estratégia anticancerosa única, a relevância fisiológica da sobre-expressão forçada de Chk1-s ectópico permanece incerta. Estes resultados, no entanto, fornecem uma prova de princípio de que inclinar o equilíbrio Chk1–Chk1-S pode levar à catástrofe mitótica e redução da proliferação celular.
a observação de que a sobre-expressão de Chk1-s reduziu o crescimento do tumor xenogénico (Fig. 4 C-E) pareceu contraditório com a observação de que as amostras de tumor de pacientes humanos expressaram níveis relativamente elevados de Chk1-s para proliferação celular (Fig. 4 A E B E Si Apêndice, Fig. 14). Para conciliar estes dados, é importante reconhecer as diferenças entre as condições experimentais. A expressão relativamente elevada de Chk1 – s em tumores humanos pode ser atribuída à presença de células proliferativas nestes tecidos. Consistentemente, Chk1-S também é alta em tecidos fetais que são altamente proliferativos(Apêndice SI, Fig. 3A). Importante, a expressão de Chk1-s nestes tecidos proliferativos é temporariamente restrita à fase S tardia A M (Fig. 2 and SI Appendix, Fig. 4). Esta regulação temporal pode assegurar que a actividade do Chk1 é inibida Após (e apenas após) a conclusão da replicação de ADN na fase S para a progressão do ciclo celular para a fase G2/M. No entanto, quando ectópica Chk1-S é forçado a overexpress em células cultivadas ou xenograft tumores, o temporal restrição de Chk1-S-expressão é interrompida; em outras palavras, Chk1-S é alta durante todo o ciclo celular, incluindo o S de fase, resultando em constante bloqueio das Chk-1 e prematura mitotic entrada, levando a mitotic catástrofe e reduziu a proliferação celular.
em conclusão, este estudo identificou uma variante de splice de Chk1, Chk1-s, que é um regulador chave de Chk1 no ciclo celular normal e durante a DDR(apêndice SI, Fig. 15). No ciclo celular não perturbado, a expressão Chk1 aumenta na fase S e algumas moléculas Chk1 podem ser fosforiladas pelo ATR impedindo a ligação Chk1 – s, resultando em alta atividade Chk1 e manutenção da fase S até a conclusão da replicação do DNA. Na fase G2, a expressão de Chk1-S aumenta e, conforme relatado (29), a fosforilação de Chk1 diminui, promovendo uma interacção Chk1–Chk1-s para suprimir a actividade Chk1. A diminuição da actividade Chk1 na fase G2/M é fundamental para a entrada mitótica. Sob condições de indução ou sobre-expressão de Chk1-s, quantidades excessivas de sequestrador Chk1-s Chk1 e diminuem sua atividade cinase durante a fase S, resultando em entrada mitótica prematura sem completar a replicação do DNA, levando a uma catástrofe mitótica. Durante a lesão do ADN, o Chk1 é fosforilado, resultando numa diminuição da ligação Chk1-s, aumento da actividade Chk1 e paragem G2/M (apêndice SI, Fig. 11). As nossas conclusões apoiam o mecanismo de “repressão” da ativação do Chk1 (29). Importante, Chk1-S parece ser um dos principais fatores de repressão da atividade Chk1. Ao antagonizar o Chk1, o Chk1-S pode acelerar o ciclo celular, levando ao aumento da proliferação em tecidos fetais e cancerosos. Níveis elevados de Chk1 em células proliferantes coordenam a fase S e a mitose, enquanto níveis elevados de Chk1-S podem fornecer um poderoso interruptor para a transição de fase S-para-G2/M. Em contraste, a sobreexpressão forçada de Chk1-s em níveis excessivos, desequilibrada por Chk1, induz entrada mitótica prematura e morte celular (Fig. 2) e suprime o crescimento tumoral em modelos de Xeno enxerto tumoral (Fig. 4). Tem sido sugerido que o Chk1 seja um alvo terapêutico eficaz na terapêutica contra o cancro, e os inibidores Chk1 estão a ser avaliados em ensaios clínicos (40-43). A identificação do Chk1 – s como um inibidor endógeno do Chk1 pode abrir novas áreas de investigação na regulação do ciclo celular, resposta a lesões do ADN e terapia oncológica.