VETERINAIRE MICROBIOLOGIE
Identificatie van Clostridium chauvoei in klinische stalen van culturen uit blackleg gevallen, door middel van de PCR –
Identificatie van Clostridium chauvoei op het gebied van materialen en klinische gevallen turquoise, het is een symptoom van het gebruik van de PCR –
St MiyashiroI,* A. F. C. NassarI; M. C. A., M. SouzaI, J. B. CarvalhoI; J. E. B. AdegasII
IInstituto Biológico, São Paulo, SP, Brasil
IIMato Grosso do Sul, Brasil
ABSTRACT
C. chauvoei aanwezigheid werd gedetecteerd door middel van polymerasekettingreactie (PCR) uit supernatant van kweek in gekookt vleesmedium van lever -, spier-en metatarsisch beenmergmonsters van zeven kalveren met zwartbenige symptomen. De isolatie onder anaërobe omstandigheden van één spiermonster toonde Clostridium perfringens in zuivere cultuur aan.
trefwoorden: Clostridium chauvoei; blackleg; bovine; PCR.
abstract
de aanwezigheid van Clostridium chauvoei werd gedetecteerd door PCR-reactie uit gekookte vleesmedium kweek van lever -, spier-en middenvoetsbeenmergmonsters van zeven kalveren met symptomatische karbonkel. Isolatie van een spiermonster onder anaërobe omstandigheden toonde Clostridium perfringens in zuivere cultuur aan. Sleutelwoorden: Clostridium chauvoei, symptomatic carbuncle, bovine, PCR.Clostridium spp is een van de geslachten waaruit de groep anaerobe bacteriën bestaat die medisch en economisch van groot belang zijn. Clostridiosis is de algemene naam gegeven aan een verscheidenheid van ziekten veroorzaakt door de bacteriën van dit geslacht, die kunnen optreden in elk deel van het lichaam dat de voorwaarde voor hun ontwikkeling biedt met de daaruit voortvloeiende toxine productie tijdens de vermenigvuldiging (1).
Clostridium chauvoei is de veroorzaker van zwartbenig en kwaadaardig oedeem bij runderen, schapen en andere herkauwers (4). Blackleg bij runderen is een niet-traumatische endogene infectie en een aanzienlijk deel van de runderen kan C. chauvoei in hun lever Herbergen. Aangetaste dieren zijn anorectisch, depressief, febriele, en kreupel (een kant ledemaat), de presentatie van een hete, pijnlijke zwelling die koud wordt, oedemateuze met crepitaties. De dood wordt binnen 12 tot 48 uur gezien. Dit middel lijkt een voorkeur te hebben voor grote spieren (dij, middenrif en hart), die bij necropsie Donker, rood, droog en sponsachtig zijn (11). Symptomen die lijken op blackleg kunnen ook worden veroorzaakt door Clostridium septicum,C. novyi,C. perfringens of C. sordellii. In een recente studie naar de fylogenetische positie van C. chauvoei en C. septicum op hun 16S rRNA gen (rrs) sequenties, werd een overeenkomst van 99,3% tussen de RRS genen van C. chauvoei en C. septicum vastgesteld die ook weerspiegeld wordt op het fenotypische niveau (7,8).
hoewel de presuntieve diagnose van zwartbenig en maligne oedeem afhangt van klinische en pathologische bevindingen, wordt de bevestiging van de ziekte meestal gevonden door het organisme te isoleren en te identificeren, zoals toxineproductie en immunologische methoden (9,13). Deze diagnostische methoden zijn echter tijdrovend en moeizaam. Bovendien kunnen immunologische methoden twijfelachtige resultaten opleveren omdat C. chauvoei en C. septicum verschillende antigenen gemeen hebben (4).
Nucleïnezuuramplificatie van een specifiek doelgebied van het bacteriële genoom door de polymerasekettingreactie (PCR) is op grote schaal gebruikt voor detectie-en diagnosedoeleinden (15). De capaciteit van PCR om DNA specifiek van lage aantallen bacteriën, evenals zijn eenvoud, snelheid en reproduceerbaarheid te vergroten, biedt voordelen over conventionele methodes voor identificatie, en is eigenlijk gebruikt om vele Clostridium species, met inbegrip van C. chauvoei in zuivere culturen en in klinische steekproeven te identificeren (5,7,12,14). Een nauwkeurige diagnose van blackleg is daarom vaak moeilijk. De standaarddiagnose is gebaseerd op een immunofluorescentietest en op morfologische criteria.
in dit artikel wordt een PCR-methode beschreven die is gebaseerd op eerdere verrijking in gekookt vleesmedium van monsters van kalveren met zwarte poten om C. chauvoei te identificeren. Lever -, spier-en middenvoetsbeenmergmonsters van kalveren die tijdens de Braziliaanse herfst zwartbenige symptomen vertoonden, werden geanalyseerd. De verzamelde monsters waren afkomstig van zes kalveren van een koppel uit de staat São Paulo en één kalf uit de staat Mato Grosso do Sul (Tabel 1). Al deze runderen stierven plotseling, en vertoonden spiercrepitatie in de achterste ledemaat.
gemacereerd van lever – en spiermonsters en beenmergwabs werden geïnoculeerd in buisjes met gekookt vleesmedium (Difco ®) die vlak daarvoor aan een thermische schok werden onderworpen (100 ° C gedurende 10 minuten onmiddellijk gekoeld in het huidige water), en vervolgens gedurende 48 uur bij 37 ° C werden geïncubeerd. Tien microliter gekookt vlees medium werden gekweekt in 5% schapen bloed agar en geïncubeerd bij 37ºC gedurende 48 uur onder anaerobe omstandigheden. Kolonies met karakteristieke vorm, uiterlijk, kleur en hemolyse werden onderworpen aan gramkleuring voor morfologische en cellulaire wandbepaling. Verdachte isolaten werden onderworpen aan catalase -, lecitinase -, gelatinase -, glucose -, lactose-en tumultueuze melkstollingstesten om het bacteriële geslacht en de bacteriële soorten te identificeren.
Guanidinetyocianaat gebaseerde techniek (2) werd toegepast voor DNA-extractie uit supernatans van buisjes met gekookt vleesmedium. Eén mL van elke buis werd gedurende 20 minuten gecentrifugeerd bij 13000 x g en de pellet werd geresuspendeerd in 200 µL Tris-EDTA-buffer vóór het extractieprotocol. Multiplex PCR werd uitgevoerd met primers ontworpen voor flagelin gen (fliC), beschreven door SASAKI et al. (10), specifiek voor Clostridium chauvoei en Clostridium septicum, die respectievelijk 535 basenparen (bp) en 294 bp versterken. De voorste primer FlaF is gebruikelijk voor beide soorten en FlachR en FlaseR zijn de omgekeerde primers voor C. chauvoei en C. septicum, respectievelijk. Amplificatie van DNA werd uitgevoerd in een totaal volume van 50 µL, met 200 µM van elk dNTP, 5 µL 10x reactiebuffer, 2,5 mM MgCl2, 30 pmol van elke primer (FlaF – 5′ AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG 3′ , FlachR – 5′ TACTAGCAGCATCAAAT GTACC 3′ , en Flase R – 5′ tttattgaattgtttgtgaag 3′ ), 1,25 u Taq polymerase en 10 µl DNA. Voor versterking hebben we dertig cycli gebruikt die als volgt in drie fasen zijn verdeeld: denaturatie bij 94ºC gedurende 60 seconden, hybridisatie bij 56ºC gedurende 60 seconden en verlenging bij 72ºC gedurende 60 seconden. C. chauvoei IB 1559 en C. septicum 10518 (Instituto Biológico stammen) werden gebruikt als PCR-positieve controle, en spiermonster van een normale koe werd gebruikt als PCR-negatieve controle. PCR werd ook rechtstreeks toegepast uit klinische monsters (lever, spier en beenmerg) met behulp van dezelfde DNA-extractie-en amplificatieprotocollen die hierboven zijn genoemd. Versterkingen werden uitgevoerd in een Peltier Thermal Cycler-100 (MJ onderzoek) en de analyse van de versterkte producten werd uitgevoerd door elektroforese in agarose gel 1,3% gekleurd met ethidiumbromide.
Gramkleur van gekookt vleesmedium geïnoculeerd met de verdachte monsters vertoonde kleine grampositieve staafjes met subterminale sporen in de meeste monsters (lever 1, spieren 1,2 en 7 en botmarrows 3,4 en 5), verder dan andere. Echter, alleen in spier 7 monster werd geïsoleerd Clostridium perfringens in pure cultuur, en, geen groei werd waargenomen in de andere monsters platen geïncubeerd onder anaërobe omstandigheden. Multiplex PCR uit klinische monsters toonde geen positief resultaat noch voor C. chauvoei of C. septicum. In de reactie van het supernatans van gekookt vleesmedium dat met dezelfde monsters werd geïnoculeerd, waren er echter zeven positief voor C. chauvoei en negatief voor C. septicum (lever 1, spieren 1,2 en 7, botmarrows 3,4 en 5), zoals blijkt uit Tabel 1.
de nauwe fylogenetische relatie tussen C. chauvoei en C. septicum is een moleculaire reflectie van de fenotypische gelijkenis van deze organismen. C. chauvoei is relatief moeilijk te onderscheiden van C. septicum, en bovendien kan C. septicum symptomen veroorzaken die sterk lijken op blackleg symptomen (6,9).
GREGORY et al. (3) gemeld het voorkomen en de behandeling van een rund met zwarte poten met hoge doses peniciline. De diagnose werd bereikt door het isoleren van C. chauvoei van een uitstrijkje van het myonecrose gebied, en cavia ‘ s inenting voor de identificatie.
KUHNERT et al. (7) rapporteerde een systeem voor het onderscheiden van C. chauvoei en C. septicum, maar het vereist beperking van de enzymvertering van de PCR-producten voor de definitieve identificatie van het organisme vanwege het kleine verschil in het 16S rRNA-gen van beide bacteriën.
onze resultaten tonen aan dat multiplex PCR-reactie op basis van fliC gen (10) efficiënt was om C. chauvoei te identificeren uit natuurlijk geïnfecteerde monsters gekweekt in gekookt vleesmedium die guanidine thiocyanaat voor DNA-extractie opleverden, en deze soort te onderscheiden van C. septicum. Nochtans, waren de PCR-resultaten direct van weefselsteekproeven negatief, waarschijnlijk wegens het lage aantal clostridial microrganismen, of inefficiënt het extractieprotocol van DNA.
de isolatie van C. chauvoei is zeer moeilijk, omdat hiervoor harde anaërobe omstandigheden nodig zijn en klinische specimens zijn vaak besmet met andere anaërobe bacteriën, waaronder clostridia in de bodem, die sneller groeien dan C. chauvoei in een kweekmedium (9). Microbiologische cultuur van spier 7 toonde Clostridium perfringens geïsoleerd in zuivere cultuur onder anaerobe omstandigheden. Deze soort kan ook betrokken zijn bij zwartbenige gevallen, en in de huidige studie kan hij geassocieerd worden met C. chauvoei. Hoe dan ook, als alleen microbiologische methoden waren toegepast in dit geval, blackleg diagnose zou verkeerd of onvolledig zijn. Clostridiale vaccins bieden een hoge mate van immuniteit tegen clostridiale ziekten, en wanneer de diagnose correct is, kan de ziekte gemakkelijk worden gecontroleerd. Hiertoe moeten de klinische monsters naar behoren worden verzameld en aan laboratoriumonderzoek worden onderworpen. Zodra alle ziekten als gevolg van clostridia kunnen worden voorkomen door vaccinatie, als het probleem blijft ondanks vaccinatie, moet de diagnose verkeerd zijn. Bovendien is een gevalbeschrijving van fundamenteel belang voor het uitvoeren van laboratoriumanalyses (1).
infecties veroorzaakt door clostridia MICR-organismen veroorzaken aanzienlijke verliezen in de productie, zodra behandeling in het algemeen onuitvoerbaar is. De bestrijding en de preventie moeten adequate maatregelen voor de behandeling en de systematische vaccinatie van het koppel omvatten, aangezien de dieren permanent in contact zijn met de agentia en de factoren die de ziekten kunnen ontketenen.
detectie van nucleïnezuur van C. chauvoei uit voorafgaande verrijking van natuurlijk geïnfecteerde monsters in gekookt vleesmedium maakte de diagnose duidelijk bij deze twee Braziliaanse uitbraken van zwartbenig, die meestal niet overtuigend blijft vanwege microbiologische kweekbeperking. Bovendien, wegens hoge specificiteit van PCR techniek, werd het gebruik van cavia ‘ s voor identificatie van de agent vermeden.
1. Baldassi, L. (2005). Clostridiale toxines krachtige vergiften, krachtige medicijnen. J. Venom. Anim. Tox. Trop. Dis., 11(4), 391-411.
2. Boom, R.; Sol, C. J. A.; Salimans, M. M. M.; Jansen, C. L.; Werthein-Van-Dillen, P. M. E.; Noordaa Van Der J. (1990). Snelle en eenvoudige methode voor zuivering van nucleïnezuren. J. Clin. Microb., 28, 495-503.
3. Gregory, L.; Della Libera, A. M. M.; Birgel Junior, E. H.; Pogliani, F. C.; Birgel, D. B.; Benesi, F. J.; Miyashiro, S.; Baldassi, L. (2006). Symptomatische karbonkel: voorkomen, klinische evolutie en follow-up van het herstel van runderen getroffen door “manqueira”. Arq. Inst. Biol., 73(2), 243-246.
4. Hamaoka, T.; Terakado, N. (1994). Demonstratie van gemeenschappelijke antigenen op het celoppervlak van Clostridium chauvoei en Clostridium septicum door middel van een indirecte immunofluorescentietest. J. Vet. Med. Sci., 56, 371-373.
5. Kojima, A.; UIDA, I.; Sekiaki, T.; Sasaki, Y.; Ogikubo, Y.; Tamura, Y. (2001). Snelle detectie en identificatie van Clostridium chauvoei door PCR op basis van flagellin-gensequentie. Dierenarts. Microb., 78, 363-371.
6. Kuhnert, P.; Capaul, S. E.; Nicolet, J.; Frey, J. (1996). Fylogenetische posities van Clostridium chauvoei en Clostridium septicum gebaseerd op 16S rRNA gensequenties. Int. J. Syst. Bact., 46(4), 1174-1176.
7. Kuhnert, P.; Krampe, M.; Capaul, S. E.; Frey, J.; Nicolet, J. (1997). Identificatie van Clostridium chauvoei in culturen en klinisch materiaal van blackleg met behulp van PCR. Dierenarts. Microb., 51, 291-298.
8. Moussa, J. (1959). Antigene formules voor Clostridium septicum en Clostridium chauvoei.J. Path. Bac., 7, 341-350.
9. Sasaki, Y.; Kojima, A.; Aoki, Hiroshi; Ogikubo, Y.; Takikawa, N.; Tamura, Y. (2002). Fylogenetische analyse en PCR-detectie van Clostridium chauvoei, Clostridium haemolyticum, Clostridium novyi types A en B, en Clostridium septicum op basis van het flagellingen. Dierenarts. Microb., 86, 257-267.
10. Sasaki, Y.; Yamamoto, K.; Kojima, A.; Norimatsu, M.; Tamura, Y. (2000). Snelle identificatie en differentiatie van pathogene clostridia in gasgangreen door polymerasekettingreactie op basis van de 16S-23S rDNA spacer regio. Res. Veteraan. Sci., 69, 289-294.
11. Sippel, W. L. (1982). Diagnose van Clostridiale ziekten. J. Am. Dierenarts. Med. Assoc., 161, 1299-1305.
12. (1997). (1997). (1997). (1997). Detectie van Clostridium perfringens die verschillende toxines produceren in faece van geiten door PCR. Lett. Applicatie. Microb., 25, 339-344.
13. Vanelli, S. A.; Uzal, F. A. (1996). Clostridium septicum detectie door de peroxidase-antiperoxidase (PAP) techniek, in formaline-gefixeerde, paraffine ingebed weefsel van schapen. Boog. Med. Dierenarts., 28, 125-127.
14. Warren, A. L.; Uzal, F. L.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1998). PCR-detectie van Clostridium perfringens Type D in formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefsels van geiten en schapen. Lett. Applicatie. Microb., 29, 15-19.
15. Whelen, a. c.; persing, d. h. (1996). De rol van nucleic zure versterking en opsporing in het klinische microbiologielaboratorium. Anne. Rev.Microb., 50, 349-373.