állatorvosi mikrobiológia
a Clostridium chauvoei azonosítása a feketelábú esetek tenyészeteinek klinikai mintáiban, a PCR –
a Clostridium chauvoei azonosítása az anyagok és a klinikai esetek türkizkék területén, a PCR
Szent miyashiroi,* A. F. C. nassari; M. C. A., M. SOUZAI, J. B. CARVALHOI; J. E. B. AdegasII
IInstituto Biol Xhamgico, s ons Paulo, SP, Brasil
IIMato Grosso do Sul, Brasil
absztrakt
C. chauvoei jelenlétét hét feketeláb-tünetekkel rendelkező borjú máj -, izom-és metatarsi csontvelőmintájából vett, szakácsolt húsközegben, felülúszó tenyészetből nyert polimeráz láncreakcióval (PCR) mutatták ki. Az egyik izomminta anaerob körülmények között történő izolálása Clostridium perfringens-t mutatott ki tiszta tenyészetben.
kulcsszavak: Clostridium chauvoei; fekete láb; szarvasmarha; PCR.
absztrakt
a Clostridium chauvoei jelenlétét PCR-reakcióval mutatták ki máj -, izom-és metatarsalis csontvelőből vett szakácstenyészetből származó, hét, tünetekkel járó karbunkulussal érintett borjúból vett mintákból. Az izomminta anaerob körülmények között történő izolálása Clostridium perfringens-t mutatott ki tiszta tenyészetben.
kulcsszavak: Clostridium chauvoei, tüneti carbuncle, szarvasmarha, PCR.
a Clostridium spp a jelentős orvosi és gazdasági jelentőségű anaerob baktériumok csoportját alkotó nemzetségek egyike. A klostridiózis az e nemzetség baktériumai által okozott különféle betegségek általános neve, amelyek a test bármely olyan részén előfordulhatnak, amely feltételeket kínál fejlődésükhöz, következésképpen toxintermeléssel a szaporodás során (1).
a Clostridium chauvoei a feketeláb és a rosszindulatú ödéma kórokozója szarvasmarhákban, juhokban és más kérődzőkben (4). A szarvasmarhák feketelábja nem traumás endogén fertőzés, és a szarvasmarhák jelentős része C. chauvoei-t hordozhat a májában. Az érintett állatok anorektikusak, depressziósak, lázasak és béna (az egyik oldali végtag), forró, fájdalmas duzzanatot mutatnak, amely hideg lesz, ödémás a krepitációval. A halál 12-48 órán belül látható. Úgy tűnik, hogy ez a szer előnyben részesíti a nagy izmokat (comb, rekeszizom és szív), amelyek a boncoláskor sötétek, vörösek, szárazak és szivacsosak (11). A fekete lábra emlékeztető tüneteket a Clostridium septicum,a C. novyi,a C. perfringens vagy a C. sordellii is okozhatja. A C. chauvoei és a C. septicum filogenetikai helyzetének 16S rRNS gén (rrs) szekvenciáján végzett közelmúltbeli vizsgálat során 99,3% – os hasonlóságot állapítottak meg a C. chauvoei és a C. septicum RRS génjei között, amely a fenotípus szintjén is tükröződik (7,8).
míg a feketeláb és a rosszindulatú ödéma előzetes diagnózisa a klinikai és patológiai eredményektől függ, a betegség megerősítését általában a szervezet izolálásával és azonosításával, például toxintermeléssel és immunológiai módszerekkel találják meg (9,13). Ezek a diagnosztikai módszerek azonban időigényesek és fáradságosak. Ezenkívül az immunológiai módszerek kétértelmű eredményeket hozhatnak, mivel a C. chauvoei és a C. septicum különböző antigénekkel rendelkeznek (4).
a baktériumgenom specifikus célterületének polimeráz láncreakcióval (PCR) történő nukleinsav-amplifikációját széles körben alkalmazták kimutatási és diagnosztikai célokra (15). A PCR azon képessége, hogy specifikusan kis számú baktériumból amplifikálja a DNS-t, valamint egyszerűsége, gyorsasága és reprodukálhatósága előnyt jelent a hagyományos azonosítási módszerekkel szemben, és ténylegesen számos Clostridium faj azonosítására használták, beleértve a C. chauvoei-t tiszta tenyészetekben és klinikai mintákban (5,7,12,14). A blackleg pontos diagnosztizálása ezért gyakran nehéz. A Standard diagnózis immunfluoreszcens vizsgálaton és morfológiai kritériumokon alapul.
ebben a cikkben egy PCR-alapú módszert írunk le, amelyet a fekete lábú borjak mintáinak szakácshúsban történő előzetes dúsításából a C. chauvoei azonosítására. Máj -, izom-és metatarsi csontvelő mintákat vizsgáltak olyan borjakból, amelyek feketeláb tüneteket mutattak a brazil ősz folyamán. Az összegyűjtött minták egy állomány hat borjától származtak S. A. Paulo államból és egy Borjútól Mato Grosso do Sul államból (1.táblázat). Ezek a szarvasmarhák hirtelen elpusztultak, és izomgörcs jelentkezett a hátsó végtagban.
a máj-és izommintákat és a csontvelő-tamponokat csövekbe oltottuk főtt hús közeggel (Difco Ft), amelyet közvetlenül azelőtt hősokknak vetettek alá (100 Ft / C 10 percig, azonnal lehűtve a jelenlegi vízben), majd 37 Ft / C hőmérsékleten inkubáltuk 48 órán keresztül.szakács. Tíz mikroliter főtt húsközeget tenyésztettünk 5% juhvér-agarban, és 37 szakácson inkubáltuk 48 órán át anaerob körülmények között. A jellegzetes formájú, megjelenésű, színű és hemolízisű kolóniákat Gram-festésnek vetettük alá morfológiai és sejtfal-meghatározás céljából. A gyanús izolátumokat kataláz -, lecitináz -, zselatináz -, glükóz -, laktóz-és tejkoagulációs teszteknek vetették alá a baktériumok nemének és fajainak azonosítása céljából.
guanidin-tiocianát-alapú technikát (2) végeztünk a csövek felülúszójából szakácsolt hús közeggel történő DNS-extrakcióhoz. Mindegyik csőből egy mL-t centrifugáltunk 13000 x g-on 20 percen keresztül, majd a pelletet 200 ml tris-EDTA pufferben reszuszpendáltuk az extrakciós protokoll előtt. A Multiplex PCR-t flagelin génre (fliC) tervezett primerekkel végeztük, SASAKI et al. (10), a Clostridium chauvoei és a Clostridium septicum esetében, amelyek 535 bázispárt (bp), illetve 294 bp-t amplifikálnak. Az elülső primer FlaF mindkét faj esetében gyakori, a FlachR és a FlaseR pedig a C. chauvoei és a C. septicum fordított alapozói. A DNS amplifikációját 50 6L össztérfogatban végeztük, mindegyik dNTP – ből 200 ml – rel, 5 ml 10x reakciópufferrel, 2,5 mM MgCl2 – vel, 30 pmol primerrel (FlaF-5′ AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG 3′ , FlachR-5′ TACTAGCAGCATCAAAT GTACC 3′ és Flase R-5′ TTTATTGAATTGTGTTTGTGAAG 3′), 1,25 u Taq polimeráz és 10 MHz DNS. Az amplifikációhoz harminc ciklust használtunk három fázisra osztva, az alábbiak szerint: denaturálás 94-en (60 másodperc), hibridizáció 56-on (60 másodperc), kiterjesztés 72-en (60 másodperc). PCR pozitív kontrollként a C. chauvoei IB 1559 és a C. septicum 10518 törzseket (Instituto Biol Enterprises), normál tehén izommintáját pedig PCR negatív kontrollként használták.
a PCR-t közvetlenül klinikai mintákból (máj, izom és csontvelő) is alkalmazták a fent említett DNS-extrakciós és amplifikációs protokollok alkalmazásával. Az amplifikációkat egy Peltier Thermal Cycler-100-ban (MJ kutatás) végeztük, az amplifikált termékek elemzését elektroforézissel végeztük etidium-bromiddal festett 1,3% – os agaróz gélben.
a gyanús mintákkal beoltott szakácshúsos táptalaj Gram-pozitív foltja a legtöbb mintában (máj 1, izom 1,2 és 7, csontmarha 3,4 és 5) kis gram-pozitív rudakat mutatott szubterminális spórákkal, másokon túl. A Clostridium perfringens-t tiszta tenyészetben azonban csak a 7-es izomból izolálták, és az anaerob körülmények között inkubált többi mintalemezben nem figyeltek meg növekedést. A klinikai mintákból származó Multiplex PCR nem mutatott pozitív eredményt sem a C. chauvoei, sem a C. septicum esetében. Ugyanakkor az azonos mintákkal beoltott főtt húsközeg felülúszójának reakciójában hét közülük pozitív volt a C. chauvoei-ra, és negatív A C. septicum-ra (máj 1, izmok 1,2 és 7, csontlev szakács 3,4 és 5), amint az az 1.táblázatban látható.
a C. chauvoei és a C. septicum közötti szoros filogenetikai kapcsolat molekuláris visszatükrözi ezen organizmusok fenotípusos hasonlóságát. A C. chauvoei-t viszonylag nehéz megkülönböztetni a C. septicum-tól, emellett a C. septicum a fekete láb tüneteihez nagyon hasonló tüneteket okozhat (6,9).
GREGORY et al. (3) egy szarvasmarha feketelábú, nagy dózisú penicillinnel történő előfordulásáról és kezeléséről számoltak be. A diagnózist a C. chauvoei izolálásával végezték el a myonecrosis területének tamponjából, és tengerimalacok beoltásával az azonosításhoz.
KUHNERT et al. (7) A C. chauvoei és a C. septicum megkülönböztetésére szolgáló rendszerről számoltak be, azonban a PCR-termékek enzimemésztésének korlátozását igényli a szervezet végleges azonosításához, mivel mindkét baktérium 16S rRNS génje kicsi.
eredményeink azt mutatják, hogy a Flic génen (10) alapuló multiplex PCR-reakció hatékonyan azonosította a C. chauvoei-t a természetes fertőzött mintákból, szakácsolt húsközegben, guanidin-tiocianát DNS-extrakcióval, és megkülönböztette ezt a fajt a C. septicum-tól. A szövetmintákból közvetlenül származó PCR-eredmények azonban negatívak voltak, valószínűleg a klostridialis mikrorganizmusok alacsony száma vagy a nem hatékony DNS-extrakciós protokoll miatt.
a C. chauvoei izolálása nagyon nehéz, mivel kemény anaerob körülményeket igényel, és a klinikai mintákat gyakran más anaerob baktériumokkal szennyezik, beleértve a talajban lévő clostridiumokat is, amelyek gyorsabban növekednek, mint a C. chauvoei táptalajban (9). Az izom mikrobiológiai tenyészete 7 kiderült Clostridium perfringens tiszta tenyészetben izolálva anaerob körülmények között. Ez a faj is részt vehet a fekete lábú esetekben, és jelen tanulmányban a C. chauvoei-val társítható. Mindenesetre, ha ebben az esetben csak mikrobiológiai módszereket alkalmaztak volna, a blackleg diagnózis helytelen vagy hiányos lenne. A klostridialis vakcinák magas fokú immunitást biztosítanak a klostridialis betegségekkel szemben, és ha a diagnózis helyes, a betegség könnyen kezelhető. Ehhez a klinikai mintákat megfelelően össze kell gyűjteni és laboratóriumi vizsgálatnak kell alávetni. Miután a clostridia okozta összes betegség megelőzhető oltással, ha a probléma az oltás ellenére is fennáll, a diagnózisnak tévesnek kell lennie. Ezenkívül az esetleírás alapvető fontosságú a laboratóriumi elemzés elvégzéséhez (1).
a clostridia mikrorganizmusok okozta fertőzések jelentős veszteségeket okoznak a termelésben, miután a kezelés általában nem kivitelezhető. A védekezésnek és megelőzésnek megfelelő intézkedéseket kell tartalmaznia az állomány kezelésére és rendszeres vakcinázására, mivel az állatok állandó kapcsolatban vannak a kórokozókkal és azokkal a tényezőkkel, amelyek képesek lesznek a betegségek megszüntetésére.
a C. chauvoei nukleinsavának kimutatása a természetesen fertőzött minták előzetes dúsításából szakácsban hús közeg tisztázta a diagnózist a két brazil fekete láb kitörése, amely általában a mikrobiológiai tenyésztés korlátozása miatt nem meggyőző. Ezenkívül a PCR technika magas specifitása miatt a tengerimalacok alkalmazását a szer azonosítására elkerülték.
1. Baldassi, L. (2005). Clostridialis toxinok erős mérgek, erős gyógyszerek. J. Venom. Anim. Toxikológia. Trop. Dis., 11(4), 391-411.
2. Boom, R.; Sol, C. J. A.; Salimans, M. M. M.; Jansen, C. L.; Werthein-Van-Dilen, P. M. E.; Noordaa Van Der J. (1990). Gyors és egyszerű módszer a nukleinsavak tisztítására. J. Clint. Mikrob., 28, 495-503.
3. Gregory, L.; Della Libera, A. M. M.; Birgel Junior, E. H.; Pogliani, F. C.; Birgel, D. B.; Benesi, F. J.; Miyashiro, S.; Baldassi, L. (2006). Tüneti carbuncle: a “manqueira”által érintett szarvasmarhák előfordulásának, klinikai fejlődésének és gyógyulásának nyomon követése. Arq. Szt. Biol., 73(2), 243-246.
4. Hamaoka, T.; Terakado, N. (1994). Közös antigének kimutatása a Clostridium chauvoei és a Clostridium septicum sejtfelszínén indirekt immunfluoreszcens vizsgálattal. J. Állatorvos. Med. Sci., 56, 371-373.
5. Kojima, a.; UIDA, I.; Sekiaki, t.; Sasaki, y.; Ogikubo, y.; Tamura, Y. (2001). A Clostridium chauvoei gyors kimutatása és azonosítása PCR-rel a flagellin génszekvencia alapján. Állatorvos. Mikrob., 78, 363-371.
6. Kuhnert, P.; Capaul, S. E.; Nicolet, J.; Frey, J. (1996). A Clostridium chauvoei és a Clostridium septicum filogenetikai pozíciói a 16S rRNS génszekvenciák alapján. Int. J. Syst. Bact., 46(4), 1174-1176.
7. Kuhnert, P.; Krampe, M.; Capaul, S. E.; Frey, J.; Nicolet, J. (1997). A Clostridium chauvoei azonosítása tenyészetekben és a blackleg klinikai anyagában PCR alkalmazásával. Állatorvos. Mikrob., 51, 291-298.
8. Moussa, J. (1959). A Clostridium septicum és a Clostridium chauvoei antigén képletei.J. Path. Bac., 7, 341-350.
9. Sasaki, Y.; Kojima, A.; Aoki, Hiroshi; Ogikubo, Y.; Takikawa, N.; Tamura, Y. (2002). A Clostridium chauvoei,a Clostridium haemolyticum, az A és B típusú Clostridium novyi és a Clostridium septicum filogenetikai analízise és PCR kimutatása a flagellin gén alapján. Állatorvos. Mikrob., 86, 257-267.
10. Sasaki, Y.; Yamamoto, K.; Kojima, A.; Norimatsu, M.; Tamura, Y. (2000). A patogén klostridiumok gyors azonosítása és differenciálása gázgangrénában polimeráz láncreakcióval a 16S-23S rDNS távtartó régió alapján. Res. Állatorvos. Sci., 69, 289-294.
11. Sippel, W. L. (1982). A Klostridialis betegségek diagnosztizálása. J. Am. Állatorvos. Med. Assoc., 161, 1299-1305.
12. Uzal, F. A.; Plumb, J. J.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1997). Különböző toxinokat termelő Clostridium perfringens kimutatása a kecskék faece-jében PCR-rel. Lett. App. Mikrob., 25, 339-344.
13. Vanelli, S. A.; Uzal, F. A. (1996). Clostridium septicum kimutatása peroxidáz-antiperoxidáz (PAP) technikával, formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott juhszövetekben. Arch. Med. Állatorvos., 28, 125-127.
14. Warren, A. L.; Uzal, F. L.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1998). A D típusú Clostridium perfringens PCR kimutatása kecskék és juhok formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott szöveteiben. Lett. App. Mikrob., 29, 15-19.
15. Whelen, a. c.; persing, d. h. (1996). A nukleinsav amplifikáció és detektálás szerepe a klinikai mikrobiológiai laboratóriumban. Ann. Rev. Microb., 50, 349-373.