- absztrakt
- 1. Bevezetés
- 2. Anyagok és módszerek
- 2.1. Chemicals
- 2.2. Előállítása 70% etanol kivonatok kínai gyógynövények
- 2.3. A Nitrittermelés mérése
- 2.4. A sejtek életképességének elemzése
- 2.5. Statisztikai elemzés
- 3. Eredmények
- 3.1. A gyógynövénykivonatok hatása a nem termelésre és a sejtnövekedésre
- 3.2. A gyulladáscsökkentő hatás és a gyógynövények TCM jellemzői közötti korreláció
- 3.3. A
- 4.
- összeférhetetlenség
- elismerések
absztrakt
az indukálható nitrogén-oxid-szintáz (iNOS) a nitrogén-monoxid túltermelésének elsődleges hozzájárulója, és inhibitorait aktívan keresik hatékony gyulladáscsökkentő szerként. Ebben a tanulmányban 70% etanol kivonatot készítettünk 81 kínai gyógynövényből. Ezeket a kivonatokat a nitrogén-oxid (NO) termelésre és sejtnövekedésre gyakorolt hatásukat LPS/IFN-kostimulált és nem stimulált egér makrofág raw264.7 sejtekben Griess-reakcióval és MTT-vizsgálattal értékelték. Daphne genkwa kivonatok Sieb.et zucc, Caesalpinia sappan L., Iles pubescens Hook.et Arn, Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl, Zingiber officinale Rosc, Inula japonica Thunb., és a Ligusticum chuanxiong Hort jelentősen gátolta a NO termelést (gátlás > 90% 100 g/mL-nél). Az aktív kivonatok közül (gátlás > 50% 100 g/mL-nél) Rubia cordifolia L., Glycyrrhiza glabra L., Iles pubescens Hook.et Arn, Nigella glandulifera Freyn et Sint, Pueraria lobata (Willd.) Az Ohwi és a Scutellaria barbata D. Don nem mutatott citotoxicitást a nem stimulált RAW246.7 sejtekre, miközben fokozta az LPS/IFN-kostimulált sejtek növekedését. A tevékenységük és a hagyományos kínai orvoslás (TCM) jellemzői közötti összefüggés elemzésével a csípős ízű gyógynövények erős gyulladáscsökkentő képességet mutattak. Tanulmányunk egy sor potenciális gyulladáscsökkentő gyógynövényt tartalmaz, és azt sugallja, hogy a csípős ízű gyógynövények hatékony gyulladáscsökkentő szerek jelöltjei.
1. Bevezetés
a gyulladás egy önvédelmi mechanizmus, amelynek célja a káros ingerek eltávolítása, beleértve a sérült sejteket, irritáló anyagokat vagy kórokozókat, és a sebjavítási folyamat megkezdése. A gyulladás azonban néha további gyulladást vált ki, ami önfenntartó krónikus gyulladáshoz vezet, amely súlyos sejtkárosodást és szövetkárosodást okozhat . A krónikus gyulladás számos betegséghez kapcsolódik, mint például az ateroszklerózis , az Alzheimer-kór , a cukorbetegség és a karcinogenezis .
a gyulladás során a kóros folyamatok minden lépésében kulcsszerepet játszik a nitrogén-monoxid (NO), amelyet főként indukálható nitrogén-monoxid-szintáz (iNOS) generál gyulladásos körülmények között . Az iNOS szelektív inhibitorai különböző gyulladásos állatmodellekben mind gyulladáscsökkentőnek, mind szövetvédőnek bizonyultak, ezért ígéretes szereknek tekintik a gyulladásos betegségek kezelésében. Az iNOS magas expressziója gyakran kimutatható az emberi daganatokban, alátámasztva azt az elképzelést, hogy a krónikus gyulladás aktívan részt vesz a tumor progressziójában . Valójában a nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszereket (NSAID-ok), beleértve az aszpirint és a tolfenaminsavat , jelenleg mind a rák megelőzésére, mind a kezelésre használják .
különböző természetes termékekről számoltak be gyulladáscsökkentő és rákellenes hatásokról kísérleti állatmodellekben. Például kimutatták, hogy a kurkumin gátolja a ciklooxigenáz 2 (COX2) expresszióját, és valójában klinikai használatban van kemoprevenciós szerként . A kurkumin ígéretei miatt kiterjedt erőfeszítéseket tettek a gyulladásos mediátorok megcélzására képes vegyületek azonosítására is . Egy nemrégiben készült tanulmány szerint Liao et al. az antioxidációs képesség és a hagyományos kínai orvoslás (TCM) jellemzői közötti lehetséges összefüggést 45 általánosan használt kínai gyógynövénynél vizsgálták, amelyekben a kínai gyógynövények antioxidációs képessége korrelációt mutatott ízjellemzőikkel . Eredményeik nagyon biztatóak, mert azt jelzi, hogy a kínai gyógynövényekből potenciálisan hatékony gyulladáscsökkentő szereket lehet azonosítani TCM jellemzőik alapján.
a hatékony gyulladáscsökkentő szerek azonosítása érdekében 70% – os etanolkivonatot készítettünk 81 kínai gyógynövényből, és ezt követően teszteltük képességeiket, hogy elnyomják az egér makrofág RAW264.7 sejtekben az LPS-szel és az IFNy-vel kostimulált egértermelést. Ezenkívül elemeztük a gyulladásgátló képesség és a TCM jellemzői közötti összefüggést ezen gyógynövények között. Megállapítottuk, hogy a csípős ízű gyógynövények a legerősebbek gyulladáscsökkentő képességükben.
2. Anyagok és módszerek
2.1. Chemicals
az IFNy-t az EMD Millpore Chemicals-tól (Billerica, MA, USA) vásárolták. Szarvasmarha szérumalbumint (BSA), lipopoliszacharidot (LPS, E. coli 0111: B4), N-(1-naftil)-etilén-diamin-dihidrokloridot (L-NIL), 3-(4, 5-dimetil-tiazol-2-Il)-2, 5-difenil-tetrazoliumot (MTT), naftil-etilén-diamint, szulfanilamidot és nátrium-hidrogén-karbonátot a Sigma-Aldrich Co-tól (St. Louis, MO, USA). Az RPMI 1640-et és a tripszin-EDTA-t a Life Technologies (Grand Island, NY, USA) vásárolta meg. A magzati szarvasmarha szérumot (FBS) a Hyclone Thermo Fisher Scientific-től (Waltham, MA, USA) vásárolták.
2.2. Előállítása 70% etanol kivonatok kínai gyógynövények
minden gyógynövények nyertünk YANG He Tang és Kangqiao Co (Shanghai, Kína). A vizsgálatunkhoz kiválasztott mind a 81 gyógynövényről számoltak be, vagy azt javasolták, hogy a TCM irodalmai vagy a jelenlegi farmakológiai jelentések potenciális gyulladáscsökkentő hatásúak legyenek. Ezeknek a gyógynövényeknek a botanikai azonosítását a sanghaji élelmiszer-és Gyógyszerellenőrzési Intézet (Sifdc) végezte. Az etanolkivonatok elkészítéséhez minden szárított gyógynövényből 100 g-ot felszeleteltünk, majd 1 liter 70% – os etanollal C hőmérsékleten háromszor extraháltuk. A kapott etanolkivonatokat csökkentett nyomáson, C hőmérsékleten elpárologtattuk és C hőmérsékleten tároltuk.
2.3. A Nitrittermelés mérése
RAW264.7 sejteket 96 lyukú lemezekben (5 db 103 sejt/kút) egy éjszakán át bevontuk, majd FBS-mentes közeggel feltöltöttük 10 órán keresztül, majd 100 db g / mL gyógynövénykivonatot adtunk minden kútba. A sejteket 100 ng/mL LPS-sel és 10 U/mL IFNy-vel kostimuláltuk 24 órán keresztül, majd a táptalajt összegyűjtöttük és elemeztük a nitritnek, egy stabil oxidatív metabolitnak és hűséges no indikátornak a mennyiségét a korábban leírt Griess-reakcióval . Ehhez 100 db griess-reagenst (0,1% naftil-etilén-diamin és 1% szulfanilamid 5% – os foszforsavban) 100 db 66 lyukú lemezen összegyűjtött közeggel keverünk össze. Az elegyet szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk, majd 540 nm-en olvastuk. A nitritmennyiséget a nátrium-nitrittel előállított standard görbe alapján számítottuk ki. A százalékos gátlást nem termelésben a {/(nitritet gyógynövénykivonat nélkül)} képlettel számítottuk ki .. 100.
2.4. A sejtek életképességének elemzése
a sejtek életképességét MTT-vizsgálattal határoztuk meg a korábban leírtak szerint . Röviden, RAW264. 7 sejteket inkubáltunk MTT-vel (5 mg/mL foszfátpufferelt sóoldatban, pH = 7,4) 4 órán át. a képződött MTT formazánt 50 db 0,01 M-es HCl pufferrel oldottuk fel, amely 10% SDS-t és 5% izobutanolt tartalmazott. A sejtnövekedést úgy határoztuk meg, hogy a lemezeket 570 nm-en olvastuk egy mikrolemez-olvasóban. A kontrollcsoport sejt életképességét 100% – nak tekintik.
2.5. Statisztikai elemzés
a változók közötti korreláció irányát és nagyságát t-teszt elemzésével végeztük. a 0,05-nél kisebb értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintették ().
3. Eredmények
3.1. A gyógynövénykivonatok hatása a nem termelésre és a sejtnövekedésre
Griess assay segítségével 81 gyógynövény etanol kivonatát elemeztük gyulladáscsökkentő hatásuk szempontjából. Ezekkel a kivonatokkal a NO termelés gátlásának széles skáláját figyelték meg (1.táblázat). Kivonatok 7 gyógynövények blokkolt több mint 90% nincs termelés LPS / IFNy-stimulált RAW264.7 sejt (1. táblázat). A kivonatok közül, amelyek több mint 50% – os gátlást váltottak ki a No termelésben, Rubia cordifolia L., Glycyrrhiza glabra L., Iles pubescens Hook.et Arn, Nigella glandulifera Freyn et Sint, Pueraria lobata (Willd.) Az Ohwi és a Scutellaria barbata D. Don nem mutatott citotoxicitást a nem stimulált RAW264.7 sejtekre, miközben jelentősen növelte az LPS/IFNy-stimulált sejtek életképességét (1.táblázat). Daphne genkwa azonban Sieb.et a zucc, amely a legerősebb gátló hatást fejt ki a NO-termelésre, mérsékelten mérgező volt a RAW264.7 sejtekre (1.táblázat).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HR: herb; RT: gyökér; ST: szár; LF: levél; TW: gally; FL: virág; FR: gyümölcs; SD: mag; SC: sclerotium; HW: szívfa; SR: szár és gyökér; PE: pericarp. a NO-termelés százalékos gátlása: Griess-reakciót végeztünk a nitrittermelés mérésére LPS / IFNy-stimulált RAW264.7 sejtekben 100 g/mL gyógynövénykivonat hiányában vagy jelenlétében. cCell növekedés: MTT-t végeztünk a sejtnövekedés mérésére. A kontroll növekedési ütemét (nincs gyógynövénykivonat kezelés) 100% – nak tekintették. dNO termelés: Griess-reakciót használtunk a nitritmennyiség mérésére stimulálatlan nyersanyag-BAN264.7 sejt 100 g/mL gyógynövénykivonat hiányában és jelenlétében. eCell citotoxicitás: MTT vizsgálatot végeztek a gyógynövénykivonatokkal kezelt, nem stimulált RAW264.7 sejtek sejt citotoxicitásának meghatározására. A kezeletlen csoportot 100% – nak tekintették. minden egyes 100 g száraz gyógynövény 70% – os etanolos extrakciójából nyert kivonat százalékos hozama. az iNOS aktivitás gPercent gátlása 50 m vizsgálati koncentrációban. |
3.2. A gyulladáscsökkentő hatás és a gyógynövények TCM jellemzői közötti korreláció
10 gyógynövény TCM jellemzőinek elemzése, amelyek a legerősebb gátló hatást mutatják az LPS/IFNy-stimulált RAW264.7 sejtekben, azt találtuk, hogy a legtöbbjük a keserű vagy csípős íz, a meleg természet és a tüdő vagy a máj meridián eloszlásának kategóriájába tartozik (2.táblázat). A TCM jellemzőinek korrelálása a gyulladásgátló hatással ezekben a gyógynövényekben kategorizáltuk ezeknek a gyógynövényeknek a TCM jellemzőit, amelyek képesek voltak eltörölni az LPS/IFNy által stimulált raw264.7 sejtek NO-termelésének 50% – át. A 3. táblázat azt mutatta, hogy a nagyobb gyulladáscsökkentő hatású gyógynövények szignifikánsan nagyobb százalékban oszlanak meg azokban, amelyeket keserű/csípős ízek, meleg természet és máj/tüdő meridián eloszlások jellemeznek. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a gyulladáscsökkentő gyógynövények közös tulajdonságokkal rendelkezhetnek, amelyek csípős / keserű ízűek, meleg természetűek és tüdő/máj meridiánok.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
a kínai Gyógyszerkönyv alapján (2010). BBA Kínai Materia Medica (1998) alapján. |
|
3.3. A
gyógynövények sejtvédő hatása és TCM jellemzői közötti összefüggés a krónikus gyulladás gyakran sejtkárosodáshoz vezet, ezért aktívan keresik az e folyamatot visszatartó szereket. 21 csípős ízre jellemző TCM-vel rendelkező gyógynövényt vizsgálva megfigyeltük, hogy az LPS és az IFNy kostimulációja alatt a RAW264.7 az ezekkel a gyógynövénykivonatokkal kezelt sejtek 90% – kal növelték a sejtek életképességét (4.táblázat). Ezenkívül a csípős ízű gyógynövények a legmagasabb szintű sejtvédelmet is biztosították az LPS / IFNy-stimulált sejtekben, összehasonlítva más ízesítésű gyógynövényekkel (1.ábra).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
a stimulált RAW264.7 sejtekben több mint 90% – os sejtvédő képességgel rendelkező gyógynövények. bherb-k, amelyek képesek 90% – kal növelni a sejtek proliferációját a nyugalmi RAW264.7 sejtekben. |
a gyógynövények összehasonlítása a sejtek életképességével különböző ízekben. Az LPS/IFNy-stimulált RAW264.7 sejtek életképességének átlaga különböző ízű gyógynövényekkel kezelt sejtek. .
4.
a megnövekedett iNOS expresszió miatti NO túltermelés meggyőzően kapcsolódik a krónikus gyulladás és a rák patogeneziséhez . Ezért azok a szerek, amelyek szelektíven elnyomják az iNOS által generált NO termelést, hatékonynak kell lenniük a krónikus gyulladás kezelésére és a rák megelőzésére. Sőt, a legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy a szelektív iNOS inhibitorok L-NIL és 1400 W terápiásán hatékony gyulladásgátló és rákellenes gyógyszerek .
a makrofágok kritikus szerepet játszanak a gyulladás szabályozásában. A makrofágokat külső ingerek aktiválják, és az aktivált makrofágok különböző gyulladásos mediátorokat termelnek, mint például a NO és a reaktív oxigén fajok. A kínai gyógynövények a gyulladáscsökkentő szerek gazdag forrásai, és erőfeszítéseket tettek ezeknek a gyógynövényeknek a hatékony összetevőinek azonosítására . Kihasználva a jól bevált raw264.7 sejtmodellt, 81 gyógynövénykivonatot értékeltünk az LPS/IFNy által kiváltott NO-termelésre gyakorolt gátló hatásuk szempontjából. Közülük a Daphne genkwa kivonat Sieb.et a zucc a legerősebb gátló hatást mutatta a NO termelésre. A Daphne genkwától elkülönített alkotóelemek Sieb.et korábban beszámoltak arról, hogy a Zucc citotoxikus hatást vált ki különböző tumorsejtvonalakra, és elnyomja az átültetett egér sarcoma S180 kinövését egerekben . Feltételezzük, hogy a Daphne genkwa rákellenes hatása Sieb.et a Zucc funkcionálisan társulhat gyulladásgátló képességével. Tanulmányunkban azt találtuk, hogy a Rubia cordifolia L. és még sokan mások csökkentik az LPS / IFNy által kiváltott NO termelést anélkül, hogy jelentős citotoxicitást okoznának a RAW264.7 sejtekben. Ezek a gyógynövények tehát ígéretes jelöltek lehetnek, mint hatékony gyógyszerek a gyulladás és a rák kezelésére. Bár jelenleg nem világos, hogy ezek a kivonatok hogyan blokkolják az LPS / IFN által indukált NO termelést a RAW264.7 sejtekben, az a megállapítás, hogy a Mollugin elnyomja a gyulladásos választ azáltal, hogy blokkolja a Janus kináz-jelátalakítók és a transzkripciós jelátviteli út aktivátorai azt sugallják, hogy a gyógynövények megcélozhatják az LPS/IFN által indukált NO termelés különböző lépéseit gyulladáscsökkentő szerepük kifejtésére.
a TCM elmélete alapján ezeket a 81 gyógynövényt különböző ízek (csípős, édes, savanyú, keserű, összehúzó, sós vagy enyhe), természet (hideg, hűvös, Mérsékelt, meleg vagy meleg) és meridián eloszlások (máj, vese, szív, lép stb.). Tanulmányunk kimutatta, hogy az ízre jellemző TCM nagyon jól korrelált a termelés gátlásának képességével—a csípős íz a legerősebb, a keserű kissé gyengébb, mint a csípős, az édes ízek közbülső, a fanyar, sós, enyhe vagy savanyú íz gyenge vagy nem hatékony. A természet és a meridián Eloszlás TCM jellemzői szintén összefüggenek a NO-termelés gátlásának hatékonyságával. Például a gyógynövények nagyobb százaléka, amelyek képesek blokkolni a termelést, a meleg természet jellemzőivel rendelkeznek. A máj és a tüdő meridiánjainak jellemzői A fő meridián eloszlások, amelyek olyan gyógynövényekben találhatók, amelyek kivonatai blokkolhatják a termelés 50% – át. Összességében azt gondoljuk, hogy a TCM jellemzői potenciálisan nagyon hasznosak lehetnek a hatékony gyulladásgátló szerek keresésének irányításához a kínai gyógynövényekben.
a TCM jellemző a Materia Medica által emberben kiváltott különálló tulajdonság szisztematikus kifejeződése. Az ízek elmélete a TCM-ben képezi a kínai gyógynövény-használati útmutató alapvető kontextusát. A TCM-ben az íz jellemzője mind a valódi íz, mind a gyógyító hatás kombinációja. Szerint Shen Nong Ben Cao Jing (Shennong klasszikus anyagi Medica), egy fontos TCM könyv először írt kínai gyógynövény íz és tulajdonság elmélet, csípős íz, amely kapcsolatban áll a tüdő meridián, eloszlathatja a belső hőt sudorifics amelyek viszont elősegítik a keringést a Qi és a vér. A csípős ízű gyógynövényeket Kínában már ezer éve használják a vérkeringés élénkítésére és a Qi blokkjának megtörésére. Az a tény, hogy a gyulladással kapcsolatos betegségek a Qi tüneteivel és a vér elzáródásával járnak, megmagyarázhatja a csípős ízű gyógynövények hatékonyságát a gyulladás elnyomására.
Vizsgálatunk 81 gyógynövénykivonat vizsgálatára korlátozódott az LPS/IFNy által kiváltott NO termelésre és sejtnövekedésre gyakorolt hatásukra a makrofág RAW264.7 sejtekben. A tanulmány eredményei mindazonáltal alátámasztják a modern farmakológia/orvosbiológiai tudomány és a TCM elmélet szoros kapcsolatát. A TCM elméletet ezer éves klinikai tapasztalat alapján fejlesztették ki, és a TCM anyagi és farmakológiai alapjait a modern orvosbiológiai tudomány magyarázza. Úgy gondoljuk, hogy ez a tanulmány hozzájárult ehhez a célhoz.
összeférhetetlenség
a szerzők kijelentik, hogy e cikk közzétételét illetően nincs összeférhetetlenség.
elismerések
ezt a munkát a Kínai Tudományos és Technológiai Minisztérium Nemzeti Tudományos és technológiai Nagyprojektje támogatta (2009zx09311-003), A Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány fiatal tudósainak alapja (81001666), a sanghaji önkormányzati oktatási bizottság innovációs programja (13yz048), valamint a sanghaji Oktatási Bizottság megalapítása az egyetemi kiemelkedő fiatal tanárok számára (szy07029).