anti-inflammatoriske virkninger af 81 kinesiske urteekstrakter og deres sammenhæng med egenskaberne ved traditionel kinesisk medicin

abstrakt

inducerbar kvælstofiltase (iNOS) er den primære bidragyder til overproduktion af salpetersyre og dets inhibitorer er aktivt søgt som effektive antiinflammatoriske midler. I denne undersøgelse forberedte vi 70% ethanolekstrakter fra 81 kinesiske urter. Disse ekstrakter blev efterfølgende evalueret for deres virkning på kvælstofilte (NO) produktion og cellevækst i LPS/IFN-costimulerede og ustimulerede murine makrofag RÅ264, 7 celler ved Griess-reaktion og MTT-analyse. Ekstrakter af Daphne Sieb.et Caesalpinia sappan L., Iles pubescens Hook.et Arn, Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl, isingiber officinale Rosc, Inula japonica Thunb. markant inhiberede ingen produktion (hæmning > 90% ved 100 g/mL). Blandt aktive ekstrakter (hæmning > 50% ved 100 g / mL), Rubia cordifolia L., glabra L., Iles pubescens Hook.et Arn, Nigella glandulifera Freyn et Sint, Pueraria lobata (vil.) Og Scutellaria barbata D. Don udviste ingen cytotoksicitet over for ustimulerede RÅ246, 7 celler, mens væksten af LPS/IFN-costimulerede celler blev øget. Ved at analysere sammenhængen mellem deres aktiviteter og deres traditionelle kinesiske medicin (TCM) egenskaber viste urter med skarp smag potent antiinflammatorisk evne. Vores undersøgelse giver en række potentielle antiinflammatoriske urter og antyder, at urter med skarp smag er kandidater til effektive antiinflammatoriske midler.

1. Introduktion

betændelse er en selvbeskyttelsesmekanisme, der sigter mod at fjerne skadelige stimuli, herunder beskadigede celler, irritanter eller patogener, og begynde sårreparationsprocessen. Imidlertid inducerer betændelse undertiden yderligere betændelse, hvilket fører til selvforstærkende kronisk betændelse, der kan forårsage alvorlig cellulær skade og vævsskade . Kronisk inflammation har været forbundet med en lang række sygdomme som aterosklerose , diabetes og carcinogenese .

salpetersyre (NO), der hovedsageligt genereres af inducerbar salpetersyresyntase (iNOS) under de inflammatoriske tilstande , spiller en nøglerolle i hvert trin i de patologiske processer under betændelse . Selektive inhibitorer af iNOS har vist sig at være både antiinflammatoriske og vævsbeskyttende i forskellige inflammatoriske dyremodeller og betragtes således som lovende midler til behandling af inflammatoriske sygdomme. Høj ekspression af iNOS kan ofte påvises i humane tumorer, hvilket understøtter forestillingen om, at kronisk inflammation er aktivt involveret i tumorprogression . Faktisk anvendes ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler (NSAID ‘ er), herunder aspirin og tolfenaminsyre , i øjeblikket til både kræftforebyggelse og behandling .

en række naturlige produkter er rapporteret at have antiinflammatoriske og anticancereffekter i eksperimentelle dyremodeller. For eksempel har curcumin vist sig at hæmme cyclooksigenase 2 (koks 2) ekspression og er faktisk i klinisk anvendelse som et kemopræventionsmiddel . På grund af løfterne i curcumin er der også udøvet en omfattende indsats for at identificere forbindelser, der er i stand til at målrette inflammatoriske mediatorer . En nylig undersøgelse foretaget af Liao et al. undersøgte den potentielle sammenhæng mellem antioksideringsevne Og egenskaberne ved traditionel kinesisk medicin (TCM) i 45 almindeligt anvendte kinesiske urter, hvor antioksidationsevne af kinesiske urter viste sig at være korreleret med deres smagskarakteristika . Deres resultater er meget opmuntrende, fordi det indikerer, at effektive antiinflammatoriske midler potentielt kan identificeres fra kinesiske urter baseret på deres TCM-egenskaber.

i vores bestræbelser på at identificere effektive antiinflammatoriske midler forberedte vi 70% ethanolekstrakter fra 81 kinesiske urter og testede efterfølgende deres evner til at undertrykke ingen produktion i murine makrofagrå264, 7 celler costimuleret med LPS og IFNy. Desuden analyserede vi også sammenhængen mellem antiinflammatorisk kapacitet og TCM-egenskaber blandt disse urter. Vi konkluderer, at urter med skarp smag er de stærkeste i deres antiinflammatoriske evne.

2. Materialer og metoder

2.1. Kemikalier

IFNy blev købt fra EMD Millpore Chemicals (Billerica, MA, USA). Bovint serumalbumin (BSA), lipopolysaccharid (LPS, E. coli 0111: B4), N-(1-naphthyl)-ethylendiamindihydrochlorid (L-NIL), 3-(4, 5-dimethylthiasol-2-yl)-2, 5-DIPHENYLTETRASOLIUM (MTT), naphthylethylendiamin, sulfanilamid og natriumbicarbonat blev alle opnået fra Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA). RPMI 1640 og trypsin-EDTA blev købt fra Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Fetal bovine serum (FBS) blev købt hos Hyclone Thermo Fisher Scientific (Htham, MA, USA).

2.2. Fremstilling af 70% Ethanolekstrakter af kinesiske urter

alle urter blev opnået fra yang He Tang og Kangkiao Co (Shanghai, Kina). Alle 81 urter valgt til vores undersøgelse er blevet rapporteret eller foreslået at have potentielle antiinflammatoriske aktiviteter af enten TCM-litteraturer eller aktuelle farmakologiske rapporter. Botanisk identifikation af disse urter blev udført af Shanghai Institute for Food and Drug Control (SIFDC). Til fremstilling af ethanolekstrakter blev 100 g af hver tørrede urter skåret og ekstraheret med 1 L 70% ethanol ved C i tre gange. Opnåede ethanolekstrakter blev fordampet under reduceret tryk ved Temperatur C og opbevaret ved C. ekstrakter blev opløst med DMSO før brug.

2.3. Måling af Nitritproduktion

RÅ264, 7 celler blev belagt i 96-brøndsplader (5 ca.103 celler pr.brønd) natten over og derefter genopfyldt med FBS-frit medium i 10 timer efterfulgt af tilsætning af 100 g/mL urteekstrakter i hver brønd. Celler blev costimuleret med 100 ng/mL LPS og 10 U / mL IFNy i 24 timer, og medier blev derefter opsamlet og analyseret for mængden af nitrit, en stabil iltningsmiddel metabolit og trofast ingen indikator ved Griess-reaktionen som tidligere beskrevet . For at gøre det blev 100 liter Griess-reagens (0,1% naphthylethylendiamin og 1% sulfanilamid i 5% phosphorsyre) blandet med 100 liter opsamlet medium i en 96-brøndsplade. Blandingen blev inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter aflæst ved 540 nm. Mængden af nitrit blev beregnet ud fra en standardkurve genereret med natriumnitrit. Procent hæmning i ingen produktion blev beregnet med formlen {/(nitrit uden urtekstrakt)} kur 100.

2.4. Analyse af Cellelevedygtighed

Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-analyse som tidligere beskrevet . 264,7 celler blev kort inkuberet med MTT (5 mg / mL i phosphatbufret saltvand, pH = 7,4) i 4 timer. Cellevækst blev bestemt ved at læse plader ved 570 nm i en mikropladelæser. Kontrolgruppens cellelevedygtighed betragtes som 100%.

2.5. Statistisk analyse

retningen og størrelsen af korrelationen mellem variabler blev udført ved hjælp af analyse af t-test. værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante ().

3. Resultater

3.1. Effekt af urteekstrakter på ingen produktion og cellevækst

ved hjælp af Griess assay analyserede vi ethanolekstrakter af 81 urter for deres antiinflammatoriske aktivitet. En bred vifte af inhibering i ingen produktion blev observeret med disse ekstrakter (tabel 1). Ekstrakter af 7 urter blokeret over 90% ingen produktion i LPS/IFNy-stimuleret RÅ264.7 celler (tabel 1). Blandt de ekstrakter, der fremkaldte over 50% hæmning i ingen produktion, Rubia cordifolia L., Glycyrrhisa glabra L., Iles pubescens Hook.et Arn, Nigella glandulifera Freyn et Sint, Pueraria lobata (vil. Scutellaria barbata D. Don viste ingen cytotoksicitet over for ustimulerede RÅ264, 7 celler, mens de signifikant øgede levedygtigheden af LPS/IFNy-stimulerede celler (tabel 1). Dog Daphne Sieb.et courgetter, som har den stærkeste hæmmende virkning på ingen produktion, var moderat giftige for RÅ264.7 celler (tabel 1).

3.2. Korrelation mellem antiinflammatorisk styrke og TCM-egenskaber ved urter

analyse af TCM-karakteristika for 10 urter, der viser den stærkeste hæmmende effekt på ingen produktion i LPS/IFNy-stimuleret RÅ264.7 celler, fandt vi, at de fleste af dem er i kategorierne bitter eller skarp smag, varm natur og lunge-eller levermeridianfordelinger (tabel 2). For at korrelere TCM-egenskaberne med antiinflammatorisk virkning i disse urter kategoriserede vi TCM-karakteristika for disse urter, der var i stand til at afskaffe 50% af ingen produktion i LPS/IFNy-stimulerede RÅ264.7 celler. Tabel 3 viste, at urter med større antiinflammatorisk virkning blev fordelt i en signifikant højere procentdel hos dem, der blev karakteriseret som bitter/skarp smag, varm natur og lever/lungemeridianfordelinger. Disse resultater tyder på, at antiinflammatoriske urter kan have fælles egenskaber, der er af skarp/bitter smag, varm natur og lunge/levermeridian.

3.3. Korrelation mellem cellebeskyttende virkning og TCM-egenskaber ved urter

kronisk betændelse fører ofte til celleskader, og der søges således aktivt midler, der er i stand til at afskrække denne proces. Undersøgelse 21 urter med TCM karakteristisk for skarp smag, observerede vi, at under costimulation af LPS og IFNy, RÅ264.7 celler behandlet med disse urteekstrakter viste 90% stigning i cellelevedygtighed (Tabel 4). Desuden gav urter med skarp smag også den højeste grad af cellebeskyttelse i LPS/IFNy-stimulerede celler i sammenligning med urter med andre smagsstoffer (Figur 1).

Figur 1

sammenligning af urter med cellelevedygtighed i forskellige smagsstoffer. Gennemsnit af celle levedygtighed af LPS / IFNy-stimuleret RÅ264. 7 celler behandlet med urter, der tilhører forskellige smag. .

4. Diskussion

overproduktion af NO på grund af den forhøjede Inos-ekspression har været overbevisende knyttet til patogenesen af kronisk betændelse og kræft . Derfor bør midler, der selektivt kan undertrykke iNOS-genereret ingen produktion, være effektive til behandling af kronisk betændelse og til forebyggelse af kræft. Faktisk viser nylige undersøgelser, at selektive iNOS-hæmmere L-NIL og 1400 V er terapeutisk effektive som anti-inflammation og anticancer medicin .

makrofager spiller en kritisk rolle i reguleringen af inflammation. Makrofager aktiveres af eksterne stimuli, og aktiverede makrofager producerer forskellige inflammatoriske mediatorer, såsom ingen og reaktive iltarter. Kinesiske urter er de rige kilder til antiinflammatoriske midler, og der er gjort en indsats for at identificere effektive komponenter i disse urter . Ved at drage fordel af den veletablerede rå264.7-cellemodel vurderede vi 81 urteekstrakter for deres hæmmende virkning på LPS/IFNy-induceret ingen produktion. Blandt dem er uddraget af Daphne genkva Sieb.et Cucc viste den stærkeste hæmmende effekt på ingen produktion. De bestanddele, der er isoleret fra Daphne Sieb.et courgetter blev tidligere rapporteret at fremkalde cytotoksisk virkning på forskellige tumorcellelinjer og at undertrykke udvækst af transplanteret musesarkom S180 hos mus . Vi spekulerer på, at anticancereffekten af Daphne genkva Sieb.et Tucc kan være funktionelt forbundet med dets antiinflammatoriske evne. I vores undersøgelse fandt vi, at Rubia cordifolia L. og flere andre reducerer LPS / IFNy-induceret ingen produktion uden at forårsage signifikant cytotoksicitet til RÅ264.7 celler. Disse urter kan således være lovende kandidater som effektive lægemidler til at kontrollere betændelse og kræft. Selvom det i øjeblikket er uklart, hvordan disse ekstrakter blokerer LPS/IFN-induceret ingen produktion i RÅ264.7-celler, indebærer konstateringen af, at Mollugin undertrykker det inflammatoriske respons ved at blokere Janus kinase-signaltransducere og aktivatorer af transkriptionssignalvej, at urter kan målrette mod de forskellige trin i signalkaskaden, der medierer LPS/IFN-induceret ingen produktion for at udøve deres antiinflammatoriske roller.

baseret på teorien om TCM klassificerede vi disse 81 urter efter forskellige smagsstoffer (skarp, sød, sur, bitter, astringerende, salt eller mild), natur (kold, kølig, moderat, varm eller varm) og meridianfordelinger (lever, nyre, hjerte, milt osv.). Vores undersøgelse viste, at TCM—karakteristikken for smag korrelerede meget godt med styrken til at hæmme ingen produktion-skarp smag er den stærkeste, bitter er lidt svagere end skarp, søde smag er mellemliggende, og astringerende, salt, mild eller sur smag er svag eller ikke effektiv. TCM-egenskaber ved natur og meridianfordeling er også forbundet med styrken til at hæmme ingen produktion. For eksempel har højere procentdel af urter med evnen til at blokere ingen produktion egenskaberne af varm natur. Karakteristika for lever-og lungemeridianer er de største meridianfordelinger, der findes i urter, hvis ekstrakter kan blokere 50% af ingen produktion. Samlet set begrunder vi, at TCM-egenskaber potentielt kan være meget nyttige til at lede søgningen efter effektive antiinflammatoriske midler i kinesiske urter.

TCM-karakteristik er et systematisk udtryk for den særskilte egenskab fremkaldt af Materia Medica hos mennesker. Teori om smagsstoffer i TCM udgør kernekonteksten for Kinesisk vejledning til brug af urter. I TCM er karakteristikken for smag kombinationen af både ægte smag og helbredende effekt. Ifølge Shen Nong Ben Cao Jing (Shennongs klassiker af materiale Medica), en vigtig TCM-bog, der først er skrevet om kinesisk urtesmag og ejendomsteori, kan skarp smag, der er relateret til lungemeridian, sprede den indre varme med sudorifics, som igen fremmer cirkulationen af Chi og blod. Urter med skarp smag er faktisk blevet brugt i tusind år i Kina for at styrke blodcirkulationen og bryde blokken af Chi. Det faktum, at betændelsesrelaterede sygdomme er forbundet med symptomet på Chi og blodblokering, kan forklare effektiviteten af urter med skarp smag for at undertrykke betændelse.

vores undersøgelse var begrænset til undersøgelsen af 81 urteekstrakter om deres virkning på LPS/IFNy-induceret ingen produktion og cellevækst i makrofagrå264.7 celler. Resultaterne fra denne undersøgelse understøtter ikke desto mindre en tæt sammenhæng mellem moderne farmakologi/biomedicinsk videnskab og TCM-teori. TCM-teorien blev udviklet baseret på tusind års klinisk erfaring, og det materielle og farmakologiske grundlag for TCM skal stadig forklares af den moderne biomedicinske videnskab. Vi mener, at denne undersøgelse har bidraget til dette mål.

interessekonflikt

forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt med hensyn til offentliggørelsen af dette papir.

anerkendelser

dette arbejde blev støttet af det nationale videnskab og teknologi store projekt fra Kinas ministerium for videnskab og teknologi (2009-09311-003), den unge Videnskabsfond fra National Natural Science Foundation of China (81001666), innovationsprogram for Shanghai Municipal Education Commission (13-048) og grundlæggelsen af Shanghai Education Commission for Outstanding Young Teachers in University (07029).