Selkeys

CLARITY-tekniikalla otettu 3-ulotteinen kuva, jossa on 1 millimetrin siivu hiiren hippokampusta. Eri värit edustavat fluoresoivilla vasta-aineilla värjättyjä proteiineja. Eksitatoriset neuronit merkitään vihreillä, Inhibitoriset neuronit punaisilla ja astrosyytit sinisillä.

CLARITY-kuvantamisprosessi alkaa kuolemanjälkeisestä kudosnäytteestä. Seuraavaksi avoimuuden saavuttamiseksi on tehtävä sarja kemiallisia käsittelyjä, joissa näytteen rasvapitoisuus poistetaan ja lähes kaikki alkuperäiset proteiinit ja nukleiinihapot jätetään paikoilleen. Tämän tarkoituksena on tehdä kudoksesta läpinäkyvä ja siten otettavissa yksityiskohtaiseen mikroskooppiseen tutkimukseen sen toiminnallisista osista (jotka ovat pääasiassa proteiineja ja nukleiinihappoja). Tämän saavuttamiseksi olemassa oleva proteiinirakenne on sijoitettava läpinäkyvään telineeseen, joka säilyttää sen, kun taas lipidikomponentit poistetaan. Tämä ”teline” koostuu hydrogeelimonomeereista, kuten akryyliamidista. Molekyylien, kuten formaldehydin, paraformaldehydin tai glutaarialdehydin lisääminen voi helpottaa telineen kiinnittymistä säilöttäviin proteiineihin ja nukleiinihappoihin, ja lämmön lisääminen on tarpeen solukomponenttien ja akryyliamidin välisten todellisten sidosten selvittämiseksi.

kun tämä vaihe on suoritettu, kohdekudoksen solujen proteiini-ja nukleiinihappokomponentit pysyvät lujasti paikoillaan, kun taas lipidikomponentit pysyvät irrallaan. Lipidit poistetaan sitten 1-2 viikon passiivisen diffuusion aikana pesuaineessa tai kiihdytetään elektroforeettisin menetelmin vain tunteihin tai päiviin. Kun pesuaine läpäisee ne, sen lipofiiliset ominaisuudet mahdollistavat sen, että se pystyy poimimaan ja valmistamaan matkan varrella mahdollisesti havaitut lipidit. Lipofiiliset värit kuten DiI poistetaan, mutta on olemassa selkeyteen sopivia lipofiilisiä väriaineita, jotka voidaan kiinnittää lähiproteiineihin. Suurin osa ei-lipidimolekyyleistä, kuten proteiineista ja DNA: sta, ei vaikuta tähän menettelyyn akryyliamidigeelin ja mukana olevien molekyylien kemiallisten ominaisuuksien ansiosta.

kuten alkuperäisessä paperissa on ilmoitettu, kudos laajenee tämän prosessin aikana, mutta tarvittaessa se voidaan palauttaa alkuperäisiin mittoihinsa inkubaatiovaiheessa taitekertoimen täsmäävässä liuoksessa.

tässä vaiheessa prosessia näyte on täysin valmis kuvantamista varten. Kuvantamisen kontrasti voi tulla endogeenisistä fluoresoivista molekyyleistä, nukleiinihapon (DNA-tai RNA) merkinnöistä tai immunosäilytyksestä, jolloin käytetään nimenomaan tiettyyn kohdeaineeseen sitoutuvia vasta-aineita. Lisäksi nämä vasta-aineet on merkitty fluoresoivilla tunnisteilla, jotka ovat avain lopulliseen kuvantamistulokseen. Standardikuvausmenetelmät konfokaali -, kaksifoton-tai valolevykuvausmenetelmät ovat kaikki sopivia havaitsemaan fluoresenssipäästöt aina proteiinin lokalisoinnin mittakaavaan asti, jolloin saadaan lopulliset erittäin yksityiskohtaiset ja kolmiulotteiset kuvat, jotka selkeys tuottaa.

kun näyte on immunisoitu kuvaa varten, on mahdollista poistaa vasta-aineet ja levittää uusia, jolloin näyte voidaan kuvata useita kertoja ja kohdentaa useisiin proteiinityyppeihin.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.