Breaking old habits: Moving from common used buffers in pharmaceuticals

the US Food, Drug and Cosmetic Act of 1938 required manufacturers and pharmaceuticals companies to be responsibility the safety of drug additives / apuaineet in their products in response a tragedy where 100 children was killed by the presents of dietylene glycol in an antibacterial product. Auttaakseen selventämään, mitä tarvitaan uuden apuaineen luomiseksi, FDA julkaisi vuonna 2005 ohjeasiakirjan ”Nonclinical Studies for the Safety Evaluation of Pharmaceutical Prepaids”, jossa esitetään ne turvallisuustutkimukset,joita tarvitaan apuaineen hyväksymiseksi 1, 2. Viimeaikaisissa artikkeleissa on vaadittu lisää vaihtoehtoisia apuaineita käytettäväksi formulaatioissa 1, 3, 4. Formuloijat suosivat yleensä aikaisempia apuaineita, koska niiden turvallisuusprofiili on vakiintunut sekä uuden apuaineen hyväksymiseen liittyvät riskit ja kustannukset3. Kun kyseessä on uusi apuaine, on tehtävä turvallisuustutkimuksia, ja jos kyseessä on haittavaikutus, on syytä epäillä, johtuiko haittavaikutus apuaineesta vai tuotteesta. Kun käytetään apuainetta, vaikka aikaisempi kokemus mistä tahansa injektioreitistä on arvokas sen käytön perusteluissa,on syytä huomata, että nykyisten säännösten mukaan antoreitin muuttaminen tai pitoisuuden nostaminen yli nykyisen suurimman annoksen voi vaatia lisää turvallisuustietoa 1.2. Uusien apuaineiden tarve on tunnustettu, mutta tietämyksemme lisääminen vähemmän käytettyjen apuaineiden käytössä on aivan yhtä tärkeää samalla kun se tarjoaa helpomman sääntelypolun eteenpäin.

oikean pH-arvon ja puskurijärjestelmän määrittäminen on todennäköisesti kriittisin vaihe proteiinin muodostamisessa sen liukoisuuden ja stabiilisuuden (kemiallisen ja fysikaalisen)varmistamiseksi 3,5-7. Artikkeli keskittyy bioterapian vakauttamiseen. Puskureita, joita on sekä pienissä molekyyleissä että FDA: n hyväksymissä proteiiniformulaatioissa, käytetään perusteluna näiden puskurien proteiineihin kohdistuvien stabiloivien vaikutusten tutkimiselle. Taulukossa 1 luetellaan FDA: n hyväksymien tuotteiden etiketeistä löydettyjen ainutlaatuisten formulaatioiden määrä. Geneeristen valmisteiden formulaatiosta johtuvat identtiset valmisteet tai eri annosvahvuudet suljettiin pois. Aina kun Puskurin suolamuotoon viitataan, puskurin oletetaan olevan titrattu natriumhydroksidilla tai suolahapolla, sillä nämä ovat yleisimpiä titrantteja.

yleisimpiä parenteraalisissa formulaatioissa käytettyjä puskureita ovat olleet sitraatti, fosfaatti ja asetaatti. Joitakin näihin apuaineisiin liittyviä vahvuuksia ja heikkouksia korostetaan. Tämän paperin tavoitteena on kiinnittää huomiota muihin hyväksyttyihin, mutta harvemmin käytettyihin puskurointiaineisiin, jotka vaativat laajempaa käyttöä tullakseen yleisesti hyväksytyiksi. Vaikka tämä artikkeli keskittyy yksinomaan puskureihin, sama argumentti ulottuu muunlaisiin apuaineisiin. Biotekniikan kehittyessä teollisuudenalana ja yksilöllisempien proteiinitelineiden kehittyessä on yhä tärkeämpää löytää uusia keinoja näiden proteiinien stabiloimiseksi. Joskus yleisimmät apuaineet eivät riitä riittävään stabiilisuuteen tai mahdollistavat lääkkeiden annostelutekniikat.

yleisesti käytetyt Puskurit

natriumfosfaatti

natriumfosfaatti (pKa 2.1, 7.2 ja 12.3) on yleisimmin käytetty puskuri parenteraalisissa formulaatioissa (Taulukko 1). Merkittävin rajoite fosfaatin käytölle puskurina on jäätymisen vaikutus pH: n muutoksiin. pH: n muutosta jäätymisen aikana on tutkittu paljon. PH: n muutoksen katsotaan johtuvan kaksiemäksisen suolan selektiivisestä kiteytymisestä. Kiteytymiseen voivat vaikuttaa jäätymisnopeus, pH: n alkamisnopeus ja muiden kosoluuttien esiintyminen. Noin kahden yksikön pH: n muutos on melko tyypillinen pakastamisen aikana, mutta jopa 3,6 yksikön pH: n muutoksia on raportoitu 8-10. Muuttuva pH-ympäristö saattaa horjuttaa valkuaista irtotavarana olevan lääkeaineen käsittelyssä tai lääkeaineliuoksen kylmäkuivauksessa 11-17. Tämä on huolestuttavinta olosuhteissa, joissa käytetään suuria fosfaattipitoisuuksia tai muita kiteyttäviä apuaineita, koska nämä olosuhteet auttavat indusoimaan fosfaatin kiteytymistä. Liuokset, joissa on suuria pitoisuuksia proteiinia tai ei-kiteytyviä liuoksia (esim.sakkaroosia), estävät fosfaatin kiteytymistä ja minimoivat pH: n siirtymisen.

sitruunahappo

sitruunahappo on yksi yleisimmin käytetyistä puskureista (Taulukko 1). Se on kolmiarvoinen puskuri, joka sisältää kolme karboksyylihappoa, joiden pKa on 3,1, 4,8 ja 6,4 (Taulukko 2) ja jolla on laaja puskurointialue 5. Mukaan FDA: n aktiivinen ainesosa tietokanta, sitraatti löytyy yli 100 Hyväksytty, ruiskeena tuotteita, antaa sille suuri käyttöhistoria ja todistaa sen turvallisuutta.

kuitenkin tutkimukset, joissa verrataan sitraattipuskuroitujen valmisteiden ihonalaisia injektioita fosfaatilla tai histidiinillä puskuroituihin yhdistelmävalmisteisiin, ovat osoittaneet, että sitraattipuskuroidut liuokset aiheuttivat enemmän kipua ihonalaisen injektion jälkeen 18-20. Vaikka tämä kipu oli suhteellisen lyhytkestoinen (alle kaksi minuuttia), se herättää huolta siitä, noudattaako potilas itse annettavia sitraatti18-injektioita. Sitruunahapolla muodostettaessa on otettava huomioon kohde-valmisteprofiili ja suunniteltu antotapa. Jos valmistetta annetaan usein ihon alle, toinen puskuroiva aine voi olla sopivampi.

etikkahapon pKa on noin 4, 8, jolloin puskurointialue on 3, 7-5, 6 (Taulukko 2). Etikkahapon käyttö on ihanteellinen nestemäisessä tilassa stabiilien proteiinien muotoiluun happamissa olosuhteissa. Etikkahappoliuosten kylmäkuivaukseen liittyy pH: n nousu, joka johtuu puskurin haihtuvan happomuodon sublimoitumisesta, jolloin jäljelle jää perussuola. Tämä saattaa aiheuttaa epävakautta proteiinille ja vaikeuttaa kylmäkuivattujen lääkeaineiden pH: n säätelyä.

muut hyväksytyt Puskurit

trometamiini

trometamiini (Tris) (pKa 8.1) on ominaisuuksiltaan samanlainen kuin fosfaatti (pKa 7.2) ja voitaisiin käyttää korvikkeena lähellä neutraaleja pH-olosuhteita. Molemmissa puskureissa esiintyy pH-muutos pakastamisen aikana. Identtisissä olosuhteissa trometamiinin pH-muutos (+2,1) oli suunnilleen yhtä suuri kuin fosfaatin ( 1,8), mutta vastakkaiseen suuntaan (Taulukko 2)8.

yhden puskurin valinta toisen sijaan riippuisi tällöin todennäköisesti yksittäisen proteiinin herkkyydestä pH: n siirtymisen suuntaan ja mahdollisista spesifisistä proteiini-puskuri-vuorovaikutuksista. Trometamiinin ja histidiinin on osoitettu olevan fosfaattia parempia stabiloijia erytropoietiiniin kohdistuneessa korkeassa lämpötilassa kohdistuneessa rasituksessa, mikä estää aggregaatiota auttamalla avautumisen palautuvuutta21. Ure2p: n osoitettiin olevan stabiilimpi fibrilin muodostumista vastaan, kun se muotoiltiin trometamiiniin verrattuna fosfaatti22: een.

histidiini

histidiini, välttämätön aminohappo, on yleistymässä proteiinihoitojen valmisteissa. Sen pKa-arvo on 6,1, joten se sopii proteiiniformulaatioihin lähellä neutraaleja olosuhteita (Taulukko 2).

histidiinin on osoitettu suojaavan monoklonaalista vasta-ainetta sekä nestemäisessä että kylmäkuivatussa tilassa lämpöstressiä23-25 vastaan. Interferoni-tau: n stabiilisuutta selvittäneissä tutkimuksissa havaittiin, että histidiiniä (jota seurasi Tris ja sitten fosfaatti) sisältävät valmisteet olivat stabiileimpia lämmön aiheuttamaa aggregaatiota vastaan. Tämän stabiloitumisen katsottiin johtuvan histidiinin suorasta sitoutumisesta26. Kylmäkuivauksen aikana histidiinin ja asparagiinihapon on osoitettu suojaavan vasta-aineita toimimalla vetysidoksen luovuttajana, joka säilyttää molekyylinsisäisen β-sheets24-25: n. Lisäksi histidiinillä on todettu olevan antioksidanttisia ominaisuuksia,koska se kykenee sitomaan rautaioneja ja singlet oxygen24, 27. Histidiinin käytön haittapuolena on se, että histidiiniliuosten on havaittu muuttavan väriä kiihtyneissä lämpötiloissa ja happamassa pH: ssa sekä uuttavan rautaa ruostumattomasta teräksestä 24.

Glukoni -, maitohappo-ja viinihappo

Glukoni -, maitohappo-ja viinihappo ovat apuaineita, joita on käytetty lähes yksinomaan pienimolekyylisissä valmisteissa. Kalsiumglukonaatti on saanut toimiluvan vetyfluoridipalojen hoitoon paikallisella levityksellä. Vakavammissa tapauksissa on käytetty neljäprosenttisen kalsiumglukonaattiliuoksen infuusiona suolaliuoksessa kudosten vaurioitumisen estämiseksi28. 23 kaupallisesti saatavilla, ruiskeena formulaatiot sisältävät maitohappoa löytyy FDA aktiivinen ainesosa tietokanta, neljä muotoiluja käytetään biologics-kaksi peptidejä ja kaksi proteiinia. Viinihappoa sisältävistä 12 formulaatista vain yhtä on käytetty proteiinin muodostamiseen. Nämä Puskurit voivat olla asetaatin ja sitraatin korvikkeita.

glukonihappo on glukoosin hapettumisesta luontaisesti muodostuva yhdiste. Se on mielenkiintoinen yhdiste, koska sillä on potentiaalia toimia puskurina, stabilointiaineena ja kelatoivana aineena, koska sen rakenne sisältää karboksyylihappoja ja hydroksyyliryhmiä.

Tartaraatin on osoitettu parantavan monomeerin retentiota sitraattiin nähden vasta-ainemuodossa pH 4, 0-4, 5, kun sitä säilytetään nesteenä 25°C29: ssa. On arveltu, että tartaraatin, sitraatin, malaatin ja sitä kautta laktaatin ja glukonaatin hydroksyyliryhmät voisivat toimittaa stabiloivia vetysidoksia kylmäkuivattavan cake30-31: n amorfisessa vaiheessa.

asparagiinia ja glutamiinihappoa

sekä asparagiinia että glutamiinihappoa on löydetty imeväisille ja lapsipotilaille annetuista infuusioista, joiden aminohappopitoisuudet plasmassa ovat riittämättömät. Trofamiinissa® aspartaattia ja glutamaattia infusoidaan 22 mM: n ja 34 mM: n pitoisuuksina, vastaavasti 32. Nämä pitoisuudet ovat riittävän suuria, jotta proteiinivalmisteet puskuroituvat riittävästi.

glutamiinihapon on osoitettu parantavan solunsisäisten proteiinien23,33 stabiilisuutta ja liukoisuutta sekä estävän aggregaatiota käyttövalmiiksi saattamisen aikana23,34-35, kun sitä valmistetaan yhtä paljon arginiinia. Insuliini-ja ihmisen seerumin albumiinitutkimukset osoittavat, että glutamaatin ja aspartaatin lisääminen pystyi estämään aggregaattien muodostumista36-38. Pegfilgrastiimilla tehdyt tutkimukset osoittivat, että glutamaatissa tai formiaatissa valmistetun pegfilgrastiimin stabiilisuus oli verrattavissa asetaattiin39.

sitruunahappokierron välituotteet

sitraatti, fumaraatti, α-ketoglutaraatti, malaatti ja sukkinaatti ovat kaikki sitruunahappokierron välituotteita, joiden on todettu olevan turvallisia ja tehokkaita puskureina tai vasta-ioneina injektoitavissa valmisteissa. Fumaraattia, α-ketoglutaraattia, malaattia ja sukkinaattia on käytetty rajoitetussa määrässä tuotteita (taulukko 1). On selvää, että myös muut Krebs-syklin välituotteet voivat soveltua parenteraaleihin. Näitä yhdisteitä ovat muun muassa akonitaatti, isositraatti ja oksaloasetaatti. Koska ne ovat kaksiarvoisia ja kolmiarvoisia karboksyylihappoja, niiden pKa: t vaihtelevat 2,0: sta 6,4: ään, joten nämä yhdisteet soveltuvat monenlaisiin formulaatioihin (Taulukko 2).

koska näitä yhdisteitä käytetään puskureina vain vähän, on epäselvää, liittyykö näihin yhdisteisiin sama injektiokipu, joka liittyy ihonalaisiin sitraattipistoksiin. Niiden käyttöön liittyy kuitenkin muitakin etuja. Sitraatin on osoitettu indusoivan vasta-aineliuosten hyytelöimistä, kun proteiinipitoisuus oli yli 100 mg/mL. Tämän katsottiin johtuvan puskurin kolmiarvoisuudesta. Sukkinaatilla, jossa on vain kaksi karboksyylihappoa, ei havaittu olevan samaa vaikutusta samassa pH40: ssä.

johtopäätös

oikean pH-arvon ja puskurijärjestelmän määrittäminen on ratkaisevan tärkeää bioterapeuttisten aineiden saattamiseksi klinikalle ja markkinoille. Uusien apuaineiden tarve sekä olemassa olevien apuaineiden parempi ymmärtäminen on erittäin toivottavaa. Histidiini, trometamiini ja useat muut vaihtoehtoiset Puskurit tarjoavat etuja tavanomaisiin apuaineisiin verrattuna. Näiden vaihtoehtoisten puskureiden käyttö ei voi muuta kuin auttaa lisäämään formulaattoreiden työkaluja ja saattaa mahdollistaa sellaisen terapeuttisen kehittämisen, joka muuten on saattanut epäonnistua. Kehitteillä olevien proteiinihoitojen suuren määrän vakauttamiseksi kaikkien lähestymistapojen tulisi olla avoimia harkittavaksi.

1. Osterberg, R. E., Demerlis, C. C., Hobson, D. W., Mcgovern, T. J. (2011). Trends in apuaine Safety Evaluation. Int. J. Tox. 30, 600-610

2. FDA (2005) Guidance for Industry: Nonclinical Studies for the Safety Evaluation of Pharmaceutical Depositors

5. Stoll, V. S., Blanchard, J. S. (1990) Buffers: Principles and Practice. Entsymologian menetelmät. 182, 24-38

6. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. (2008). Measuring and Increasing Protein Solubility. J. Pharm. Sci. 97, 4155-4166

7. Wang, W., Nema, S., Teagarden, D. (2010). Protein Aggregation-Pathways and Influencing Factors. Int. J. Pharmaceutics. 390, 89–99

8. Williams-Smith, D. (1977) Changes in Apparent pH on Freezing Aqueous Buffer Solutions and their Relevance to Biochemical Electron-Paramagnetic-Resonance Spectroscopy. Biochem. J. 167, 593-600.

27. Wade, A. M., Tucker, H.N. (1998) Antioxidant Characteristics of L-Histidine. J. Nutr. Biochem. 9, 308-315

32. B. Braun Medical Inc. TROPHAMINE – isoleucine, leucine, lysine acetate, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, cysteine hydrochloride, histidine, tyrosine, n-acetyl-tyrosine, alanine, arginine, proline, serine, glycine, aspartic acid, glutamic acid and taurine solution

34. Zhang M.Z., Wen J., Arakawa T., Prestrelski S.J. (1995) A New Strategy for Enhancing the Stability of Lyophilized Protein: The Effect of the Reconstitution Medium on Keratinocyte Growth Factor. Pharmacol. Res. 12, 1447–1452

36. Quinn, R., Andrade, J. D. (1983) neutraalien Insuliiniliuosten aggregaation minimoiminen. J. Pharm. Sci. 72, 1472-1473

39. Piemonte, D. M., Treuheit, M. J. (2008) Formulation of Neulasta (pegfilgrastim). ADV. Huumeiden Toimitus Arvostelut. 60, 50–58

41. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R. (2011), Predicting the Crystalization Propensity of Carboxylic Acid Buffers In Frozen Systems—Relevance to Freeze – Drying. J. Pharm. Sci. 100, 1288–1293

42. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R. (2011), Thermophysical Properties of Carboxylic and Amino Acid Buffers at Subzero Temperatures: Relevanssi jäätyneen tilan vakauttamisessa. J. Phys. Kemiaa. B. 115, 7154-7164

tekijästä

David Sek sai BS-arvosanansa kemiassa Bates Collegesta ja MS-arvosanansa kemiassa ja kemiallisessa biologiassa Northeastern Universitystä. Hänellä on 10 vuoden kokemus muotoilutieteilijänä ja hän on viettänyt viimeiset kahdeksan vuotta Pfizerilla tutkimassa uusien bioterapeuttien vakautta.