VETERINARY MICROBIOLOGY
Identification of Clostridium chauvoei in clinical samples cultures from blackleg cases by means of PCR
identificación de Clostridium chauvoei en cultivos de materiales clínicos de casos de carbunclo sintomático utilizando PCR
S. miyashiroi,*; A. F. C. NASSARI; M. C. A. M. SOUZAI; J. B. carvalhoi; J. E. B. AdegasII
Instituto Biológico, São Paulo, SP, Brasil
IIMato Grosso do Sul, Brasil
RESUMEN
C. Se detectó la presencia de chauvoei por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de sobrenadante de cultivo en medio de carne cocida de muestras de hígado, músculo y médula ósea metatarsiana de siete terneros con síntomas de labio negro. El aislamiento en condiciones anaeróbicas de una muestra muscular reveló Clostridium perfringens en cultivo puro.
Palabras clave: Clostridium chauvoei; blackleg; bovine; PCR.
resumen
se detectó la presencia de Clostridium chauvoei por reacción de PCR a partir del cultivo en cooked meat medium de muestras de hígado, músculo y médula ósea metatarsiana de siete terneros afectados de carbunclo sintomático. El aislamiento de una muestra de músculo en condiciones anaeróbicas reveló Clostridium perfringens en cultivo puro.
palabras clave: Clostridium chauvoei, carbunclo sintomático, bovino, PCR.
Clostridium spp es uno de los géneros que componen el grupo de bacterias anaerobias de considerable importancia médica y económica. La clostridiosis es el nombre general dado a una variedad de enfermedades causadas por las bacterias de este género, que pueden ocurrir en cualquier parte del cuerpo que ofrezca condiciones para su desarrollo con la consiguiente producción de toxinas durante la multiplicación (1).
El clostridium chauvoei es el agente causante de los edema negro y maligno en bovinos, ovinos y otros rumiantes (4). El cerdo negro en el ganado bovino es una infección endógena no traumática, y una proporción considerable de bovinos puede albergar C. chauvoei en su hígado. Los animales afectados son anoréxicos, deprimidos, febriles y cojos (un miembro lateral), que presentan una hinchazón caliente y dolorosa que se vuelve fría, edematosa con crepitación. La muerte se observa en 12 a 48 horas. Este agente parece preferir los músculos grandes (muslo, diafragma y corazón), que en la necropsia son oscuros, rojos, secos y esponjosos (11). Los síntomas que se asemejan al labio negro también pueden ser causados por Clostridium septicum, C. novyi, C. perfringens o C. sordellii. En un estudio reciente sobre la posición filogenética de C. chauvoei y C. septicum en sus secuencias del gen 16S RRN (rrs), se determinó una similitud del 99,3% entre los genes rrs de C. chauvoei y C. septicum que también se refleja a nivel fenotípico (7,8).
Mientras que el diagnóstico presunto de parálisis cerebral y edema maligno depende de los hallazgos clínicos y patológicos, la confirmación de la enfermedad se encuentra típicamente aislando e identificando el organismo, como la producción de toxinas y los métodos inmunológicos (9,13). Sin embargo, estos métodos de diagnóstico consumen mucho tiempo y son laboriosos. Además, los métodos inmunológicos pueden dar resultados equívocos porque C. chauvoei y C. septicum tienen varios antígenos en común (4).
La amplificación de ácido nucleico de una región diana específica del genoma bacteriano mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha utilizado ampliamente con fines de detección y diagnóstico (15). La capacidad de la PCR para amplificar el ADN específicamente a partir de un bajo número de bacterias, así como su simplicidad, rapidez y reproducibilidad, ofrece ventajas sobre los métodos convencionales de identificación, y en realidad se ha utilizado para identificar muchas especies de Clostridium, incluida C. chauvoei en cultivos puros y en muestras clínicas (5,7,12,14). Por lo tanto, a menudo es difícil realizar un diagnóstico preciso de la enfermedad. El diagnóstico estándar se basa en un ensayo inmunofluorescente y en criterios morfológicos.
En este artículo describimos un método basado en PCR de enriquecimiento previo en medio de carne cocida de muestras de terneros con vara negra para identificar a C. chauvoei. Se analizaron muestras de hígado, músculo y médula ósea metatarsiana de terneros que presentaron síntomas de glóbulo negro durante el otoño brasileño. Las muestras recolectadas fueron de seis terneros de una bandada del Estado de São Paulo y un ternero del Estado de Mato Grosso do Sul (Tabla 1). Todos estos bovinos murieron repentinamente, y presentaron crepitación muscular en la extremidad posterior.
Las muestras maceradas de hígado y músculos y los hisopos de médula ósea se inocularon en tubos con medio de carne cocida (Difco ®) que justo antes se sometió a choque térmico (100 ° C durante 10 minutos se enfrió inmediatamente en agua corriente), y luego se incubaron a 37 ° C durante 48 horas. Se cultivaron diez microlitros de medio de carne cocida en agar de sangre de oveja al 5% y se incubaron a 37ºC durante 48 horas en condiciones anaeróbicas. Las colonias con forma, aspecto, color y hemólisis característicos se sometieron a tinción de Gram para la determinación morfológica y de la pared celular. Se sometieron aislados sospechosos a pruebas de catalasa, lecitinasa, gelatinasa, glucosa, lactosa y coagulación tumultuosa de la leche para identificar el género y la especie bacteriana.
Se realizó la técnica basada en tiocianato de guanidina (2) para la extracción de ADN del sobrenadante de tubos con medio de carne cocida. Un mL de cada tubo se centrifugó a 13000 x g durante 20 minutos, y el pellet se resuspendió en 200 µL de tampón Tris-EDTA antes del protocolo de extracción. La PCR múltiple se realizó con cebadores diseñados para el gen de la flagelina (fliC), descritos por SASAKI et al. (10), específico para Clostridium chauvoei y Clostridium septicum, que amplifican 535 pares de bases (pa) y 294 pa, respectivamente. El FlaF de cebador delantero es común para ambas especies y FlachR y fLASER son los cebadores inversos para C. chauvoei y C. septicum, respectivamente. La amplificación del ADN se realizó en un volumen total de 50 µL, con 200 µM de cada dNTP, 5 µL de tampón de reacción 10X, 2,5 mm MgCl2, 30 pmol de cada imprimación (FlaF – 5′ AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG 3′ , FlachR – 5′ TACTAGCAGCATCAAAT GTACC 3′ y Flase R – 5′ TTTATTGAATTGTGTTTGTGAAG 3′), 1,25 Polimerasa U Taq y 10 µL de ADN. Para la amplificación, se utilizaron treinta ciclos divididos en tres fases de la siguiente manera: desnaturalización a 94ºC durante 60 segundos, hibridación a 56ºC durante 60 segundos y extensión a 72ºC durante 60 segundos. Se utilizaron C. chauvoei IB 1559 y C. septicum 10518 (cepas del Instituto Biológico) como controles PCR positivos, y se utilizó una muestra muscular de una vaca normal como control PCR negativo.
También se aplicó PCR directamente a partir de muestras clínicas (hígado, músculo y médula ósea) utilizando los mismos protocolos de amplificación y extracción de ADN citados anteriormente. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un Termociclador Peltier-100 (MJ Research) y el análisis de los productos amplificados se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,3% teñido con bromuro de etidio.
La tinción de gram de medio de carne cocida inoculada con las muestras sospechosas mostró pequeñas varillas gram positivas con esporas subterminales en la mayoría de las muestras (hígado 1, músculos 1,2 y 7 y calabacines 3,4 y 5), además de otras. Sin embargo, solo en la muestra músculo 7 se aisló Clostridium perfringens en cultivo puro, y no se observó crecimiento en las otras placas de muestras incubadas en condiciones anaeróbicas. La PCR múltiple de muestras clínicas no mostró resultado positivo ni para C. chauvoei ni para C. septicum. Sin embargo, en la reacción del sobrenadante de medio de carne cocida inoculado con las mismas muestras, siete de ellos fueron positivos a C. chauvoei y negativos a C. septicum (hígado 1, músculos 1,2 y 7, calabacines 3,4 y 5), como se ve en la Tabla 1.
La estrecha relación filogenética entre C. chauvoei y C. septicum es un reflejo molecular de la similitud fenotípica de estos organismos. C. chauvoei es relativamente difícil de distinguir de C. septicum, y, además, C. septicum puede causar síntomas muy similares a los síntomas de glóbulo negro (6,9).
GREGORY et al. (3) informaron de la aparición y el tratamiento de un bovino con blackleg con altas dosis de penicilina. El diagnóstico se realizó aislando a C. chauvoei de un hisopo de la zona de mionecrosis e inoculación de cobayas para su identificación.
KUHNERT et al. (7) informaron de un sistema para distinguir C. chauvoei y C. septicum, sin embargo, requiere la restricción de la digestión enzimática de los productos de PCR para la identificación definitiva del organismo debido a la pequeña diferencia en el gen 16S rRNA de ambas bacterias.
Nuestros resultados muestran que la reacción de PCR múltiple basada en el gen fliC (10) fue eficiente para identificar a C. chauvoei a partir de muestras infectadas naturalmente cultivadas en medio de carne cocida, logrando tiocianato de guanidina para la extracción de ADN, y diferenciar esta especie de C. septicum. Sin embargo, los resultados de PCR directamente de muestras de tejido fueron negativos, probablemente debido al bajo número de microrganismos clostridiales o al protocolo de extracción de ADN ineficiente.
El aislamiento de C. chauvoei es muy difícil, ya que requiere condiciones anaeróbicas duras, y las muestras clínicas a menudo están contaminadas con otras bacterias anaeróbicas, incluidos los clostridios en el suelo, que crecen más rápido que C. chauvoei en un medio de cultivo (9). El cultivo microbiológico del músculo 7 reveló Clostridium perfringens aislado en cultivo puro en condiciones anaeróbicas. Esta especie también puede estar implicada en casos de lagarto negro y, en el presente estudio, podría estar asociada con C. chauvoei. De todos modos, si solo se hubieran aplicado métodos microbiológicos en este caso, el diagnóstico de glóbulo negro sería incorrecto o incompleto. Las vacunas clostridiales proporcionan un alto grado de inmunidad contra las enfermedades clostridiales, y cuando el diagnóstico es correcto, la enfermedad se puede controlar fácilmente. Para ello, las muestras clínicas deben recogerse adecuadamente y someterse a un examen de laboratorio. Una vez que todas las enfermedades debidas a clostridia se pueden prevenir mediante vacunación, si el problema continúa a pesar de la vacunación, el diagnóstico debe ser incorrecto. Además, la descripción de un caso es de fundamental importancia para realizar un análisis laboratorial (1).
Las infecciones debidas a microorganismos de clostridia causan pérdidas considerables en la producción, una vez que el tratamiento generalmente es impracticable. El control y la prevención deben incluir medidas adecuadas de manipulación y vacunación sistemática de la manada, ya que los animales están en contacto permanente con los agentes y los factores que podrán desencadenar las enfermedades.
La detección de ácido nucleico de C. chauvoei a partir de enriquecimiento previo de muestras infectadas naturalmente en medio de carne cocida dilucidó el diagnóstico en estos dos brotes brasileños de mosca negra, que generalmente no es concluyente debido a la limitación del cultivo microbiológico. Además, debido a la alta especificidad de la técnica de PCR, se evitó el empleo de cobayas para la identificación del agente.
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