VETERINÄRMEDIZINISCHE MIKROBIOLOGIE
Identifizierung von Clostridium chauvoei in klinischen Proben von Kulturen aus Blackleg-Fällen mittels der PCR –
Identifizierung von Clostridium chauvoei in den Bereichen Materialien und klinische Fälle bis heute ist es symptomatisch für die Verwendung der PCR
St MiyashiroI,* A. F. C. NassarI; M. C. A., M. SouzaI, J. B. CarvalhoI; J. E. B. AdegasII
IInstituto Biológico, São Paulo, SP, Brasil
IIMato Grosso do Sul, Brasil
ABSTRACT
Das Vorhandensein von C. chauvoei wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus Kulturüberstand in gekochtem Fleischmedium von Leber-, Muskel- und Mittelfußknochenmarkproben von sieben Kälbern mit Blackleg-Symptomen nachgewiesen. Die Isolierung unter anaeroben Bedingungen einer Muskelprobe ergab Clostridium perfringens in Reinkultur.
Schlüsselwörter: Clostridium chauvoei; blackleg; Rinder; PCR.
abstract
das Vorhandensein von Clostridium chauvoei wurde durch PCR-Reaktion von gekochtem Fleisch Medium Kultur von Leber, Muskel und Mittelfußknochenmark Proben von sieben Kälbern von symptomatischen Karbunkel betroffen nachgewiesen. Die Isolierung einer Muskelprobe unter anaeroben Bedingungen ergab Clostridium perfringens in Reinkultur.
Schlüsselwörter: Clostridium chauvoei, symptomatischer Karbunkel, Rinder, PCR.
Clostridium spp. gehört zu den Gattungen der anaeroben Bakterien von erheblicher medizinischer und wirtschaftlicher Bedeutung. Clostridiose ist die allgemeine Bezeichnung für eine Vielzahl von Krankheiten, die durch Bakterien dieser Gattung verursacht werden und in jedem Körperteil auftreten können, der Bedingungen für ihre Entwicklung mit anschließender Toxinproduktion während der Vermehrung bietet (1).
Clostridium chauvoei ist der Erreger von Schwarzbein- und bösartigen Ödemen bei Rindern, Schafen und anderen Wiederkäuern (4). Blackleg bei Rindern ist eine nichttraumatische endogene Infektion, und ein beträchtlicher Teil der Rinder kann C. chauvoei in ihrer Leber beherbergen. Betroffene Tiere sind anorektisch, depressiv, fieberhaft und lahm (einseitiges Glied) und zeigen eine heiße, schmerzhafte Schwellung, die kalt wird, ödematös mit Krepitation. Der Tod wird innerhalb von 12 bis 48 Stunden gesehen. Dieses Mittel scheint eine Vorliebe für große Muskeln (Oberschenkel, Zwerchfell und Herz) zu haben, die bei Nekropsie dunkel, rot, trocken und schwammig sind (11). Symptome, die blackleg ähneln, können auch durch Clostridium septicum,C. novyi,C. perfringens oder C. sordellii verursacht werden. In einer kürzlich durchgeführten Studie zur phylogenetischen Position von C. chauvoei und C. septicum auf ihren 16S-rRNA-Gensequenzen (rrs) wurde eine Ähnlichkeit von 99,3% zwischen den rrs-Genen von C. chauvoei und C. septicum festgestellt, die sich auch auf phänotypischer Ebene widerspiegelt (7,8).
Während die präuntive Diagnose von Blackleg und malignen Ödemen von klinischen und pathologischen Befunden abhängt, wird die Bestätigung der Krankheit typischerweise durch Isolierung und Identifizierung des Organismus wie Toxinproduktion und immunologische Methoden gefunden (9,13). Diese diagnostischen Methoden sind jedoch zeitaufwendig und mühsam. Darüber hinaus können immunologische Methoden zu zweideutigen Ergebnissen führen, da C. chauvoei und C. septicum verschiedene Antigene gemeinsam haben (4).
Die Nukleinsäureamplifikation einer spezifischen Zielregion des bakteriellen Genoms durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde in großem Umfang für Nachweis- und Diagnosezwecke verwendet (15). Die Fähigkeit der PCR, DNA spezifisch aus einer geringen Anzahl von Bakterien zu amplifizieren, sowie ihre Einfachheit, Schnelligkeit und Reproduzierbarkeit bieten Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden zur Identifizierung und wurden tatsächlich zur Identifizierung vieler Clostridium-Arten verwendet, einschließlich C. chauvoei in Reinkulturen und in klinischen Proben (5,7,12,14). Eine genaue Diagnose von Blackleg ist daher oft schwierig. Die Standarddiagnose basiert auf einem Immunfluoreszenztest und morphologischen Kriterien.
In diesem Artikel beschreiben wir eine PCR-basierte Methode aus der vorherigen Anreicherung von Kälberproben mit blackleg in gekochtem Fleischmedium, um C. chauvoei zu identifizieren. Leber-, Muskel- und Mittelfußknochenmarkproben von Kälbern, die im brasilianischen Herbst Blackleg-Symptome zeigten, wurden analysiert. Die gesammelten Proben stammten von sechs Kälbern einer Herde aus dem Bundesstaat São Paulo und einem Kalb aus dem Bundesstaat Mato Grosso do Sul (Tabelle 1). Alle diese Rinder starben plötzlich und zeigten Muskelkrepitation in der hinteren Extremität.
Mazerierte Leber- und Muskelproben sowie Knochenmarkabstriche wurden in Röhrchen mit gekochtem Fleischmedium (Difco ®) inokuliert, das unmittelbar zuvor einem Thermoschock ausgesetzt wurde (100ºC für 10 Minuten, sofort in fließendem Wasser abgekühlt) und dann 48 Stunden bei 37ºC inkubiert. Zehn Mikroliter gekochtes Fleischmedium wurden in 5% Schafsblutagar kultiviert und 48 Stunden bei 37ºC unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Kolonien mit charakteristischer Form, Aussehen, Farbe und Hämolyse wurden zur morphologischen und Zellwandbestimmung einer Gramfärbung unterzogen. Verdächtige Isolate wurden Katalase-, Lecitinase-, Gelatinase-, Glucose-, Lactose- und Tumultmilchkoagulationstests zur Identifizierung des bakteriellen Geschlechts und der bakteriellen Spezies unterzogen.
Guanidinthyocianat-basierte Technik (2) wurde für die DNA-Extraktion aus Überstand von Röhrchen mit gekochtem Fleischmedium durchgeführt. Ein ml jedes Röhrchens wurde 20 Minuten bei 13000 x g zentrifugiert und das Pellet vor dem Extraktionsprotokoll in 200 µL Tris-EDTA-Puffer resuspendiert. Die Multiplex-PCR wurde mit Primern durchgeführt, die für das Flagelingen (fliC) entwickelt wurden, beschrieben von SASAKI et al. (10), spezifisch für Clostridium chauvoei und Clostridium septicum, die 535 Basenpaare (bp) bzw. 294 bp amplifizieren. Der Vorwärtsprimer FlaF ist für beide Arten üblich und FlachR und FlaseR sind die Rückprimer für C.chauvoei bzw. Die Amplifikation der DNA wurde in einem Gesamtvolumen von 50 µL durchgeführt, mit 200 µM von jedem dNTP, 5 µL 10X Reaktionspuffer, 2,5 mM MgCl2, 30 pmol von jedem Primer (FlaF- 5′ AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG 3′, FlachR- 5′ TACTAGCAGCATCAAAT GTACC 3′ und Flase R- 5′ TTTATTGAATTGTGTTTGTGAAG 3′), 1,25 U Taq-Polymerase und 10 µL DNA. Zur Amplifikation verwendeten wir dreißig Zyklen, die wie folgt in drei Phasen unterteilt waren: Denaturierung bei 94ºC für 60 Sekunden, Hybridisierung bei 56ºC für 60 Sekunden und Verlängerung bei 72ºC für 60 Sekunden. C. chauvoei IB 1559 und C. septicum 10518 (Stämme des Instituto Biológico) wurden als PCR-Positivkontrollen und Muskelprobe einer normalen Kuh als PCR-Negativkontrolle verwendet.
Die PCR wurde auch direkt aus klinischen Proben (Leber, Muskel und Knochenmark) unter Verwendung derselben DNA-Extraktions- und Amplifikationsprotokolle angewendet, die oben zitiert wurden. Amplifikationen wurden in einem Peltier-Thermocycler-100 (MJ Research) durchgeführt und die Analyse der amplifizierten Produkte wurde durch Elektrophorese in Agarosegel 1,3% mit Ethidiumbromid gefärbt durchgeführt.
Die Grammfärbung von gekochtem Fleischmedium, das mit den verdächtigen Proben inokuliert wurde, zeigte in den meisten Proben (Leber 1, Muskeln 1,2 und 7 und Knochenmark 3,4 und 5) kleine grampositive Stäbchen mit subterminalen Sporen andere. Allerdings wurde nur in Muskel 7 Probe isoliert Clostridium perfringens in Reinkultur, und, kein Wachstum wurde in den anderen Proben beobachtet Platten unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Multiplex-PCR aus klinischen Proben zeigte weder für C. chauvoei noch für C. septicum ein positives Ergebnis. In der Reaktion aus Überstand von gekochtem Fleischmedium, das mit denselben Proben inokuliert wurde, waren jedoch sieben von ihnen positiv gegenüber C. chauvoei und negativ gegenüber C. septicum (Leber 1, Muskeln 1,2 und 7, Knochenmark 3,4 und 5), wie in Tabelle 1 gezeigt.
Die enge phylogenetische Beziehung zwischen C. chauvoei und C. septicum ist ein molekulares Spiegelbild der phänotypischen Ähnlichkeit dieser Organismen. C. chauvoei ist relativ schwer von C. septicum zu unterscheiden, und außerdem kann C. septicum Symptome verursachen, die den Blackleg-Symptomen sehr ähnlich sind (6,9).
GREGORY et al. (3) berichtete über das Auftreten und die Behandlung eines Rinders mit Blackleg mit hohen Dosen von Penicilin. Die Diagnose wurde durch Isolierung von C. chauvoei aus einem Abstrich des Myonekrosebereichs und Impfung von Meerschweinchen zur Identifizierung gestellt.
KUHNERT et al. (7) berichtete über ein System zur Unterscheidung von C. chauvoei und C. septicum, das jedoch aufgrund des geringen Unterschieds im 16S-rRNA-Gen beider Bakterien eine Einschränkung des Enzymverdaus der PCR-Produkte zur endgültigen Identifizierung des Organismus erfordert.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Multiplex-PCR-Reaktion basierend auf dem fliC-Gen (10) effizient war, um C. chauvoei aus natürlich infizierten Proben zu identifizieren, die in gekochtem Fleischmedium kultiviert wurden und Guanidinthiocyanat für die DNA-Extraktion erreichten, und diese Spezies von C. septicum zu unterscheiden. Die PCR-Ergebnisse direkt aus Gewebeproben waren jedoch negativ, wahrscheinlich aufgrund der geringen Anzahl clostridialer Mikroorganismen oder eines ineffizienten DNA-Extraktionsprotokolls.
Die Isolierung von C. chauvoei ist sehr schwierig, da sie harte anaerobe Bedingungen erfordert und klinische Proben häufig mit anderen anaeroben Bakterien einschließlich Clostridien im Boden kontaminiert sind, die in einem Kulturmedium schneller wachsen als C. chauvoei (9). Mikrobiologische Kultur von Muskel 7 ergab Clostridium perfringens isoliert in Reinkultur unter anaeroben Bedingungen. Diese Art kann auch an Blackleg-Fällen beteiligt sein und könnte in der vorliegenden Studie mit C. chauvoei assoziiert sein. Wenn in diesem Fall nur mikrobiologische Methoden angewendet worden wären, wäre die Blackleg-Diagnose falsch oder unvollständig. Clostridien-Impfstoffe bieten ein hohes Maß an Immunität gegen Clostridien-Erkrankungen, und wenn die Diagnose richtig ist, kann die Krankheit leicht kontrolliert werden. Dazu müssen klinische Proben ordnungsgemäß gesammelt und einer Laboruntersuchung unterzogen werden. Sobald alle Krankheiten aufgrund von Clostridien durch Impfung verhindert werden können, muss die Diagnose falsch sein, wenn das Problem trotz Impfung anhält. Darüber hinaus ist eine Fallbeschreibung für die Durchführung der Laboranalyse von grundlegender Bedeutung (1).
Infektionen durch Clostridien-Mikroorganismen verursachen erhebliche Verluste in der Produktion, wenn die Behandlung im Allgemeinen nicht praktikabel ist. Die Bekämpfung und Verhütung muss angemessene Maßnahmen zur Handhabung und systematischen Impfung der Herde umfassen, da die Tiere in ständigem Kontakt mit den Erregern und den Faktoren stehen, die die Krankheiten lösen können.
Der Nachweis der Nukleinsäure von C. chauvoei durch vorherige Anreicherung natürlich infizierter Proben in gekochtem Fleischmedium verdeutlichte die Diagnose bei diesen beiden brasilianischen Ausbrüchen von Blackleg, die aufgrund mikrobiologischer Kulturbeschränkung normalerweise nicht schlüssig bleibt. Außerdem wurde aufgrund der hohen Spezifität der PCR-Technik der Einsatz von Meerschweinchen zur Identifizierung des Mittels vermieden.
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