resultat och diskussion
under vår studie av DNA-skadasignalering (32, 33) observerade vi två framstående band i chk1-immunblottar: Chk1-bandet vid 56 kDa och ett snabbare migrerande band på 43 kDa. Det snabbare migrerande bandet detekterades av Chk1-antikroppar som var reaktiva mot den inre kinasdomänen eller C-terminalsekvensen, men inte av Chk1-antikroppar som känner igen N-terminalen (Fig. 1A). Detta band erkändes inte av G4 monoklonal antikropp från Santa Cruz Biotechnology som vanligtvis används för immunoblot-analys av Chk1 (24, 29). Knockdown av Chk1 via siRNA ledde till att både Chk1 och 43-kDa-bandet försvann, vilket ytterligare bekräftade deras relevans (Fig. 1B). 43-kDa-proteinet påverkades inte av proteasom och proteashämmare (si-bilaga, Fig. 1), vilket ökar möjligheten att det kan vara en alternativ skarvvariant av Chk1. National Center for Biotechnology Information database listar för närvarande tre alternativt skarvade humana Chk1-mRNA som har varierande oöversatta regioner men kodar för samma fullängds Chk1-protein med 476 aminosyror (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). Vår analys med hjälp av en EST-baserad alternativ splicing predictive database (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) föreslog dock möjligheten till en unik skarvvariant av Chk1 där exon 3 alternativt splitsas eller raderas. För att direkt testa denna möjlighet utförde vi RT-PCR med primers inom chk1-kodningssekvensen (Fig. 1C). RT-PCR med användning av primeruppsättningen P1, i vilken den främre primern designades inom exon 3, genererade en enda amplicon av den förväntade storleken, medan RT-PCR med P2-eller P3-primeruppsättningen (båda baserade på sekvenser som flankerar exon 3) genererade två amplikoner, en med den förväntade storleken på Chk1 och den andra 200 BP-förkortningen (Fig. 1C). Sekvensering bekräftade att den längre amplicon verkligen var Chk1 och, i synnerhet, den kortare amplicon var en alternativ skarvvariant av Chk1 som saknade exon 3 (Fig. 1D och Si bilaga, Fig. 2A). Denna skarvvariant förutspåddes att översättas till en n-terminalt stympad form av Chk1 bestående av 382 aminosyror som vi kallade Chk1-kort eller Chk1-s (Fig. 1D och Si bilaga, Fig. 2). I gelelektrofores migrerade in vitro översatt Chk1-S på samma sätt som 43-kDa-proteinet från HEK293-celler (Fig. 1E). Vi immunoprecipiterade vidare 43-kDa-proteinet från HEK293 – celllysat för masspektrometri och bekräftade dess identitet som Chk1-S. N-terminal trunkering i Chk1-S överensstämmer med immunoblot-resultaten som visar att det inte känns igen av antikropparna som är reaktiva mot den N-terminala sekvensen av Chk1 (Fig. 1A). Realtids-och RT-PCR-analys detekterade Chk1-s mRNA-uttryck i flera mänskliga vävnader, och uttrycket är i allmänhet högre i fostervävnader (SI Appendix, Fig. 3 A och D). Immunoblot-analys detekterade vidare chk1-s-proteinuttryck i humana, mus-och råttcellinjer, och även i humana fostervävnader (si-bilaga, Fig. 3b) och mus primära renala tubulära celler (si Appendix, Fig. 3C). CDNA i Full längd av Chk1-S klonades också från tre normala mänskliga vävnader (tymus, kolon, fosterlever) och sekvenserades för att bekräfta att den kodar för en n-terminalt stympad skarvvariant av Chk1. Tillsammans har dessa experiment identifierat en unik skarvvariant av Chk1 som är N-terminalt trunkerad och allmänt uttryckt i däggdjursceller och vävnader.
identifiering av Chk1-S som en unik, n-terminalt stympad skarvvariant av Chk1. (A) HEK293-celllysat analyserades genom immunoblotting med användning av antikroppar som specifikt känner igen N-terminalen (Bisexuell-Chk1-NT), kinasdomänen (Bisexuell-Chk1-KD) eller C-terminalen för Chk1 (Bisexuell-Chk1-CT). Förutom Chk1 avslöjades ett 43-kDa-protein av Bisexuell-Chk1 – KD och bisexuell-Chk1-CT, men inte Bisexuell-Chk1-NT. (B) HEK293-celler transfekterades med Chk1 siRNA (siChk1) eller en krypterad sekvens (siCon) i 48 timmar för att samla helcellslysat för immunoblot-analys med användning av Bisexuell-Chk1-KD. siChk1 minskade uttrycket av både Chk1 och 43-kDa-proteinet. (C) RNA isolerades från HEK293-celler för RT-PCR med användning av tre olika uppsättningar primers för Chk1: P1, P2 och P3 (relativa sekvensplatser visas i diagrammet). Två amplikoner detekterades med RT-PCR med användning av primeruppsättningarna som flankerade exon 3 (P2 och P3), medan endast en amplicon förstärktes med användning av primeruppsättningen P1, varav den främre primern var inom exon 3 av Chk1. (D) Schematisk representation av alternativ skarvning av Chk1 vilket resulterar i ett n-terminalt stympat protein, Chk1-S. (E) Chk1-s klonades för in vitro-översättning, och det översatta proteinet tillsammans med HEK293-celllysat analyserades genom immunoblot-analys. In vitro översatt Chk1 migrerade på samma sätt som 43-kDa-bandet i HEK293-celler.
Vad är funktionen för Chk1-S? Reglerar det cellcykelkontrollpunkter som Chk1? Med dessa frågor bestämde vi först de tidsmässiga och rumsliga uttrycksmönstren för Chk1-S i cellcykeln. HEK293-celler synkroniserades vid G1 -, G1/S-eller G2/M-faser genom serumsvält, dubbeltymidinblock respektive nocodazol. Chk1-S var låg i G1-fasceller och högre i G1/S och G2/M-celler (si-bilaga, Fig. 4 A och B). Dessutom, när celler synkroniserades vid G1/S-fas med dubbeltymidinblock och sedan släpptes, ökade både Chk1-och Chk1-s-uttrycket efter att ha gått in i S-fasen (Fig. 2A). En distinkt skillnad mellan Chk1 och Chk1-s-uttryck var att medan Chk1-uttrycket toppade i mitten av S-fasen fortsatte chk1-s-uttrycket att öka från S till m-fasen (Fig. 2A). Intressant nog observerades höga nivåer av Chk1 – s-uttryck vid 7 h efter cellcykelfrisättning från dubbeltymidinblock, en tidpunkt då celler ännu inte var mitotiska (SI-bilaga, Fig. 4C). Vi kvantifierade vidare chk1-S:Chk1-förhållandet i asynkrona och S-eller G2/M-synkroniserade celler. Trots variationerna av Chk1 – s-uttryck i HEK293, U2OS och primära renala rörformiga celler var chk1-S:Chk1-förhållandet över 1 i alla celler vid G2/M-fas (si-bilaga, Fig. 5). I asynkrona celler lokaliserades Chk1-S och Chk1 huvudsakligen i kärnan (si Appendix, Fig. 6A). I G2 / M-fasceller ackumulerades emellertid vissa Chk1-S och Chk1 i centrosomer (si-bilaga, Fig. 6 B och C). Lokaliseringen av Chk1 i centrosomer är kritisk för dess G2 / M-kontrollpunktsfunktion, där den förhindrar för tidig aktivering av Cdk1 och mitotisk inträde (34, 35). Våra resultat indikerar att Chk1-S också kan lokalisera till centrosomer, vilket ger en rumslig och tidsmässig reglering av Chk1 för att initiera mitotisk inträde. Därefter bestämde vi effekterna av Chk1-eller Chk1-S-överuttryck i HEK293-och U2OS-celler. Jämfört med GFP-Chk1 inducerade GFP-Chk1-s en framstående kärnfenotyp som kännetecknades av kärnkondensation och bildning av mikrokärnor och multipla eller multiloberade kärnor (Fig. 2B). Vid tidigare tidpunkter visade de transfekterade cellerna kärn – / kromatinkondensation markerad av svag och punktlig Histon-H3-fosforylering (Fig. 2B), som indikerar för tidig mitotisk inträde. Senare utvecklade dessa celler mikrokärnor eller multiloberade kärnor, egenskaper hos mitotisk katastrof (Fig. 2B). Cellräkning visade att GFP-Chk1-s inducerade kärnfenotypen i 20% av u2os-cellerna (Fig. 2C). Liknande effekter visades av YFP-Chk1-S och Chk1-s-Myc (Fig. 2C), vilket indikerar att den observerade kärnfenotypen inducerades av Chk1-S och inte av fusionsproteintaggarna. Däremot inducerades inte för tidig mitotisk inträde av Chk1 eller dess kinasdöd mutant Chk1-KD (Fig. 2C). Chk1-s inducerade också den slående kärnfenotypen i andra celltyper (si-bilaga, Fig. 7). I synnerhet rapporterades en liknande nukleär fenotyp i celler och murina modeller som saknade en eller båda Chk1-alleler (7, 36, 37), vilket tyder på att Chk1-s kan fungera som en endogen hämmare av Chk1. För att ytterligare testa denna möjlighet genererade vi Tet-on U2OS-cellinjer som kan induceras för att uttrycka Chk1, Chk1-KD eller Chk1-S. cellerna synkroniserades vid G1/S-fas av dubbeltymidinblock, inducerad av doxycyklin och släpptes sedan in i nocodazolinnehållande medium. Cirka 80% av chk1-s-Uttryckande celler gick in i mitos, medan 60% av chk1 – eller Chk1-KD-Uttryckande celler gjorde (Fig. 2D). Viktigt, medan de flesta mitotiska celler i Chk1 – och Chk1-KD-Uttryckande grupper hade 4N DNA, hade 25% av mitotiska celler från chk1-s-Uttryckande gruppen mindre än 4N DNA-innehåll (Fig. 2D), vilket indikerar avvikande mitotisk inträde i dessa celler utan slutförande av DNA-replikation. Dessutom resulterade Chk1-S överuttryck i tidigare inträde i mitos, vilket indikeras av utseendet av pH3-positiva celler (si-bilaga, Fig. 8). Chk1 är en nyckelregulator för mitotisk inträde eller S-till-G2/M-övergången i cellcykeln. Genom att fosforylera CDC25A (inducera dess nedbrytning) och Wee1 förhindrar Chk1 CDK1-aktivering och mitotisk inträde (5, 15-20). Vi visade att induktion av Chk1 – s av doxycyklin i Tet-on U2OS-cellerna resulterade i högre nivåer av CDC25A och lägre nivåer av fosfo-CDK1, vilket tyder på att Chk1-s antagoniserade Chk1 för att inducera mitotisk inträde (Fig. 2E). Specifik knockdown av Chk1-s via RNAi lyckades inte eftersom Chk1-s-sekvensen finns i Chk1 mRNA. En antisensoligonukleotid som kompletterar den unika exon2-exon4-korsningen i Chk1-s kan emellertid specifikt minska chk1-s-uttrycket (si-bilaga, Fig. 9A). Chk1 – s nedreglering markant minskad cellproliferation (si bilaga, Fig. 9B). Intressant förändrade Chk1 – s nedreglering inte signifikant cellcykelprofilen (si-bilaga, Fig. 9C). Eftersom Chk1 fungerar vid flera cellcykelkontrollpunkter (t.ex. G2/M, spindel, intra-s) kan Chk1-s motverka Chk1 för att underlätta cellcykelprogression på flera ställen. Som ett resultat kan hämning av Chk1 – s sakta ner cellcykeln i olika faser och resultera i undertryckande av proliferation utan större förändringar av cellcykelfördelning.
reglering av cellcykeln med Chk1-S. (A) HEK293-celler synkroniserades med dubbelt tymidinblock och släpptes sedan in i nocodazolinnehållande medium. (Vänster) Cellcykelprofil analyserad med propidiumjodid (PI) färgning och FACS-analys. (Höger) Immunoblot-analys av Chk1 och Chk1-S i celllysatet uppsamlat vid angivna tidpunkter efter frisättningen från tymidinblocket. AS, asynkrona celler (B) u2os-celler transfekterades med GFP-Chk1 eller GFP-Chk1-s (grön) och fixerades sedan för immunofluorescens av fosfohiston H3 (röd) och kärnfärgning med Hoechst33342 (blå). (Övre) Chk1-s, men inte Chk1, inducerade för tidig kromatinkondensation och svag pH3-färgning (pilar). (Lägre) vid sent stadium visade Chk1-s-transfekterade celler egenskaperna hos mitotisk katastrof inklusive mikrokärnor och multiloberade kärnor (pilar). (C) U2OS-celler transfekterades med de angivna generna, och celler med kärnfenotypen av för tidig kromatinkondensation och mitotisk katastrof räknades. Data indikerar medelvärde för SD i genomsnitt; * P < 0,05 kontra vektorgrupp. Resultaten visar att Chk1-S överuttryck specifikt ledde till kärnfenotypen. (D) U2OS-celler transfekterades med de angivna generna, synkroniserades med dubbelt tymidinblock och släpptes i 7 timmar. cellerna fixerades sedan för pH3-immunofluorescens och PI-färgning och analyserades med FACS. Data indikerar medelvärde för SD i genomsnitt; * P < 0,05 kontra vektorgrupp. Resultaten visar att Chk1 – s specifikt inducerade för tidig mitotisk inträde utan slutförande av DNA-replikation (celler med <4N DNA). (E) Tet-on U2OS-celler inducerades med eller utan doxycyklin. Cellerna synkroniserades sedan vid S-fas genom dubbel tymidinblock och släpptes för 7 h. Helcellslysat samlades in för immunoblot-analys av de angivna proteinerna. Resultaten visar att inducerat Chk1 – s-uttryck ledde till en ökning av CDC25A och minskning av fosfo-CDK1, vilket bidrog till för tidig mitotisk inträde.
hur motverkar Chk1-S Chk1? Vi antog att Chk1 – s kan interagera med Chk1 för att blockera dess kinasaktivitet. Konsekvent, FLAG-Chk1-s uttryckt i HEK293 celler coimmunoprecipitated med endogen Chk1 (Fig. 3A). Dessutom översatt in vitro Myc-Chk1 och Chk1 – s coimmunoprecipitated (Fig. 3B), vilket tyder på en direkt chk1–Chk1-s-interaktion. Vi demonstrerade vidare coimmunoprecipitationen av Chk1 med N-terminaldomänen, men inte C-terminaldomänen, av Chk1-s (Fig. 3C), vilket tyder på kravet på N-terminalsekvensen i Chk1-S för dess interaktion med Chk1. Funktionellt bestämde vi effekterna av Chk1-S på Chk1-kinasaktivitet. Chk1-Myc uttrycktes och immunoprecipiterades för in vitro-kinasanalys i frånvaro eller närvaro av renad Chk1-S. såsom visas i Fig. 3D, chk1-kinasaktivitet undertrycktes delvis ännu signifikant av Chk1-S, men inte av värmedenaturerad Chk1-S. däremot minskade Chk1-s inte Chk2-aktivitet, som har liknande substratpreferenser som Chk1. Jämfört med Chk1 saknar Chk1-s en del av kinasdomänen inklusive ATP-bindningsstället (Fig. 1D) och, som förväntat, visade inte signifikant proteinkinasaktivitet (Fig. 3D). Chk1 – s kan också undertrycka kinasaktiviteten hos N-terminalt märkt Chk1 (flagga-Chk1) i en in vitro-kinasanalys (si-bilaga, Fig. 10). Dessa resultat tyder på att Chk1-s kan hämma Chk1 via molekylär interaktion. En ny studie visade att tvättning av chk1 immunoprecipitates med en strängare Radio Immuno-Utfällningsanalys (RIPA) buffert kan markant öka Chk1-kinasaktiviteten, vilket tyder på att Chk1 normalt hämmas av undertryckande faktorer (29); emellertid är identiteten hos de undertryckande faktorerna okänd. Vi bekräftade effekten av RIPA-bufferttvätt och framför allt visade vi vidare att tillsats av exogena Chk1-S kunde vända effekten av RIPA-bufferttvätt på Chk1-kinasaktivitet (si-bilaga, Fig. 11), vilket tyder på att Chk1-s kan vara en av de viktigaste endogena undertryckande faktorerna för Chk1.
Chk1-s interagerar med Chk1 för att undertrycka dess kinasaktivitet. (A) hek293-celler transfekterades med FLAG-Chk1-S eller tom vektor för att samla lysat för immunutfällning (IP) med användning av Anti-FLAG-antikroppar. Immunprecipitaterna analyserades för Chk1 och FLAG-Chk1-s genom immunoblotting med användning av anti-flagga och anti-N terminus Chk1 antikroppar, respektive. Resultaten visar co-IP för FLAG-Chk1-s med endogen Chk1. (B) Chk1-Myc och Chk1-s framställdes med användning av TNT in vitro transkription/translation kit (Promega). (Vänster) in vitro producerade Chk1-Myc och Chk1-S visas genom immunoblotting. (Höger) Chk1-Myc immunoprecipiterades med användning av anti-Myc-antikroppar efter inkubation med eller utan Chk1-S. immunoprecipitaterna analyserades för Chk1-S och Chk1-Myc genom immunoblotting. Resultaten indikerar en direkt interaktion mellan Chk1 och Chk1-S. (C) HEK293-celler transfekterades med Myc-märkta Chk1 – S eller dess C-eller N-terminala deletionsmutanter för att samla lysat för immunutfällning med anti-Myc-antikroppar. Immunoprecipitaterna undersöktes med avseende på närvaron av Chk1. Resultaten visar coimmunoprecipitation av Chk1 med Chk1-S och dess C-terminal deletion mutant, men inte med dess N-terminal deletion mutant. (D) HEK293-celler transfekterades med Myc-märkta Chk1-S, Chk1 eller Chk2 för att samla lysat för immunutfällning med anti-Myc-antikroppar. Immunprecipitaterna, innehållande Chk1-s-Myc, Chk1-Myc eller Chk2-Myc, inkuberades med eller utan Chk1-S under 1 h och tillsattes sedan till kinasaktivitetsanalysen med användning av Chktide som substrat. Denaturerad Chk1-s bereddes genom kokning. Data indikerar medelvärde för SD i genomsnitt; * P < 0,05 jämfört med Chk1-Myc-gruppen. Resultaten visar att infödda Chk1-S specifikt kan hämma Chk1. (E) HEK293-celler transfekterades med chk1-Myc eller Chk1-Myc (S317A/S345A) mutant. Cellerna obehandlades sedan eller behandlades med 100 nM camptotecin i 2 timmar för att samla lysat för immunutfällning med anti-Myc-antikroppar. Immunprecipitaterna analyserades för Myc-Chk1, fosforylerad (serin 345) Chk1 och Chk1-s genom immunoblotting. Chk1-ingången verifierades också i proverna. Resultaten visar att Chk1 – s coimmunoprecipitated eller associerad med Chk1 i normala celler och att föreningen minskade under camptotecininducerad DNA-skada. Sambandet mellan Chk1-S och chk1 (S345A/S317A) mutanten stördes emellertid inte under DNA-skada, vilket tyder på att fosforylering av Chk1 vid S345 och S317 kan krävas för dissociation av Chk1-s från Chk1. (F) hek293-celler kotransfekterades med antingen Chk1-Myc + Tom vektor eller Chk1-Myc + dn-ATR, följt av behandling med 100 nM camptothecin i 2 timmar. Det cellulära lysatet uppsamlades för immunutfällning med anti-Myc-antikroppar, följt av immunoblot-analys av de angivna proteinerna. Resultaten visar att camptotecininducerad störning av Chk1-Chk1 – s-dissociation beror på ATR och Chk1-fosforylering.
i DNA damage response (DDR) aktiveras Chk1 markant via fosforylering vid s345-och S317-rester (7, 13, 38, 39). Trots erkännande av betydelsen av s345/s317 fosforylering är det fortfarande oklart hur denna fosforylering aktiverar Chk1 (28-30). Vi visade att Chk1 – s-uttrycket inte förändrades märkbart i DDR (si Appendix, Fig. 12). Emellertid dämpades chk1-Chk1-s-interaktionen i DDR inducerad av camptotecin, en DNA-topoisomeras i-hämmare och DNA-skadligt medel (Fig. 3E). I synnerhet verkade dissociationen av Chk1 från Chk1-S i DDR beroende av chk1-fosforylering vid S345/S317, eftersom chk1(S345A / S317A) mutant inte dissocierade från Chk1-s under camptotecinbehandling (Fig. 3E). I DDR beror chk1-aktivering på ATR-medierad fosforylering (7, 13, 14). Vi visade att hämning av ATR via en dominerande negativ mutant (dn-ATR) inte bara undertryckte camptotecininducerad Chk1-s-fosforylering utan också förhindrade Chk1–Chk1-s-dissociation (Fig. 3F). På liknande sätt dissocierades Chk1 från Chk1-S under cisplatininducerad DDR, och dissociationen förhindrades av dn-ATR (si-bilaga, Fig. 13). Tillsammans tyder resultaten på att fosforylering av Chk1 kan störa dess interaktion med den endogena hämmaren Chk1-S, vilket leder till chk1-aktivering i DDR.
identifieringen av Chk1-S som en unik regulator för cellcykelprogression och cellulär proliferation fick oss att undersöka dess uttryck i cancervävnader. På mRNA-nivå uttryckte de flesta cancervävnader högre nivåer av Chk1 och Chk1-S än normala vävnader (SI Appendix, Fig. 14). Intressant visade testikelkarcinom en markant uppreglering av Chk1 – s men inte Chk1 (Fig. 4A). Specifik uppreglering av Chk1-S bekräftades ytterligare genom immunoblot-analys i testikelkarcinomvävnader, särskilt i cancerprover i sent stadium (Fig. 4B). Som tidigare rapporterats (5) hade både normala och maligna testikelvävnader höga nivåer av Chk1-uttryck. Ökat uttryck av Chk1-S detekterades också under progressionen av äggstockscancer (Fig. 4B). Den relativt höga nivån av Chk1-och Chk1-s-uttryck i både foster (SI-bilaga, Fig. 3) och cancer (Fig. 4) vävnader antyder att Chk1-s kan påskynda cellcykelprogression, främja cellproliferation under dessa förhållanden.
chk1-s-reglering vid cancer. (A) realtids PCR-analys av chk1 och Chk1-s mRNA-uttryck i normala testikelvävnader och testikelkarcinomprover, som visar upp reglering av Chk1-s i testikelkarcinom. (B) Immunoblot-analys av Chk1 och Chk1-S i humana normala testikel-och testikelcancervävnader, vilket visar ökat chk1-s-uttryck i cancervävnader i sent stadium. (C) nakna möss injicerades med 10 106 106 Tet-on mda-MB-231-celler som var doxycyklininducerbara för att uttrycka Chk1, Chk1-KD respektive Chk1-S. Efter tumör etablering till 100 mm3, hölls mössen på dricksvatten med eller utan doxycyklin. Tumörvolymen mättes varje vecka (visas för fjärde veckors värden, n = 8). Data indikerar medelvärde för SD. Resultaten visar att inducerat uttryck av Chk1-S, men inte Chk1 eller Chk-KD, hämmade tumörtillväxt. (D) densitometri av immunoblot-resultat av doxycyklininducerad Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc och Chk1-s-Myc-uttryck i utskurna tumörer (n = 3 för varje grupp). Signalerna normaliserades med Chk1-Myc (godtyckligt inställd som 100). Data indikerar medelvärde för SD. Resultaten visar att doxycyklin inducerade liknande nivåer av uttryck av Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc och Chk1-s-Myc i tumörerna. (E) nakna möss injicerades med Chk1-s-inducerbara celler för att etablera tumörer och hölls sedan på dricksvatten med eller utan doxycyklin i 4 veckor. Tumörvävnader samlades in för immunoblot-analys. Resultaten visar högre CDC25A-uttryck i tumör xenografts med doxycyklininducerad Chk1-s-uttryck.
vi undersökte vidare effekten av ektopisk Chk1-s-uttryck på xenograft-tumörtillväxt hos möss. Tumör xenografter etablerades i nakna möss med Tet-on mda-MB-231 bröstcancercellinjer som kan induceras av doxycyklin för att uttrycka Chk1, Chk1-S eller Chk1-KD. Induktion av Chk1 eller Chk1-KD genom doxycyklin påverkade inte tumörtillväxten; emellertid resulterade induktion av Chk1-S i en 40% minskning av tumörvolymen (Fig. 4C). Chk1-s-inducerade tumörvävnader visade också cdc25A-ackumulering, vilket indikerar inhiberingen av Chk1 (Fig. 4E). Även om resultaten kan innebära en unik anticancerstrategi, är den fysiologiska relevansen av tvingat överuttryck av ektopisk Chk1-s fortfarande oklart. Dessa resultat ger emellertid ett principiellt bevis på att lutning av chk1–Chk1-s-balansen kan leda till mitotisk katastrof och minskning av cellproliferation.
observationen att Chk1-S överuttryck minskade xenograft tumörtillväxt (Fig. 4 C-E) verkade motsägelsefullt för observationen att tumörproverna från humana patienter uttryckte relativt höga nivåer av Chk1-S för cellproliferation (Fig. 4 A och B och SI bilaga, Fig. 14). För att förena dessa data är det viktigt att känna igen skillnaderna mellan de experimentella förhållandena. Relativt högt Chk1 – s-uttryck i humana tumörer kan hänföras till närvaron av proliferativa celler i dessa vävnader. Konsekvent är Chk1-S också hög i fostervävnader som är mycket proliferativa (SI Appendix, Fig. 3A). Viktigt är att Chk1 – s-uttryck i dessa proliferativa vävnader är temporärt begränsat till den sena s till m-fasen (Fig. 2 och Si bilaga, Fig. 4). Denna tidsmässiga reglering kan säkerställa att Chk1-aktivitet hämmas efter (och först efter) slutförandet av DNA-replikation i S-fas för cellcykelprogression till G2/M-fas. Men när ektopisk Chk1-S tvingas överuttrycka i odlade celler eller xenograftumörer störs den tidsmässiga begränsningen av Chk1-s-uttryck; med andra ord är Chk1-s hög under hela cellcykeln inklusive S-fas, vilket resulterar i konstant blockad av Chk-1 och för tidig mitotisk inträde, vilket leder till mitotisk katastrof och minskad cellproliferation.
Sammanfattningsvis har denna studie identifierat en skarvvariant av Chk1, Chk1-S, som är en nyckelregulator för Chk1 i den normala cellcykeln och under DDR (SI Appendix, Fig. 15). I den ostörda cellcykeln ökar chk1-uttrycket vid S-fas och vissa Chk1-molekyler kan fosforyleras genom ATR som förhindrar chk1-s-bindning, vilket resulterar i hög Chk1-aktivitet och s-fasunderhåll tills slutförandet av DNA-replikation. I G2-fas ökar chk1-s-uttrycket och, som rapporterats (29), minskar chk1–fosforylering, vilket främjar en chk1-Chk1-s-interaktion för att undertrycka Chk1-aktivitet. Minskningen i Chk1-aktivitet vid G2 / M-fas är kritisk för mitotisk inträde. Under förhållanden med chk1-s induktion eller överuttryck, överdrivna mängder Chk1-S sekvestrerar Chk1 och minskar dess kinasaktivitet under S-fasen, vilket resulterar i för tidig mitotisk inträde utan slutförande av DNA-replikation, vilket leder till mitotisk katastrof. Under DNA-skada fosforyleras Chk1, vilket resulterar i minskad chk1-s-bindning, ökad Chk1-aktivitet och G2/M-arrestering (si-bilaga, Fig. 11). Våra resultat stöder” de-repression ” – mekanismen för chk1-aktivering (29). Viktigt är att Chk1-s verkar vara en av de viktigaste undertryckande faktorerna för Chk1-aktivitet. Genom att motverka Chk1 kan Chk1-s påskynda cellcykeln, vilket leder till ökad proliferation i foster-och cancervävnader. Höga nivåer av Chk1 i prolifererande celler koordinerar S-fas och mitos, medan höga nivåer av Chk1-s kan ge en kraftfull omkopplare för S-till-G2/M-fasövergången. Däremot inducerar Tvingad överuttryck av Chk1-S vid överdrivna nivåer, obalanserade av Chk1, för tidig mitotisk inträde och celldöd (Fig. 2) och undertrycker tumörtillväxt i tumör xenograftmodeller (Fig. 4). Chk1 har föreslagits vara ett effektivt terapeutiskt mål i cancerterapi, och Chk1-hämmare utvärderas i kliniska prövningar (40-43). Identifieringen av Chk1-S som en endogen hämmare av Chk1 kan öppna nya forskningsområden inom cellcykelreglering, DNA-skadesvar och cancerterapi.