VETERINARY MICROBIOLOGY
Identification of Clostridium chauvoei in clinical samples cultures from blackleg cases by means of PCR
Identificação de Clostridium chauvoei em cultivos de materiais clínicos de casos de carbúnculo sintomático utilizando-se PCR
S. MiyashiroI,*; A.F.C. NassarI; M.C.A.M. SouzaI; J.B. CarvalhoI; J.E.B. AdegasII
IInstituto Biológico, São Paulo, SP, Brasil
IIMato Grosso do Sul, Brasil
RESUMO
C. chauvoei presença foi detectada por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) a partir do sobrenadante da cultura de carne cozida médio de fígado, músculo e metatarsian de medula óssea amostras de sete bezerros com blackleg sintomas. O isolamento em condições anaeróbicas de uma amostra muscular revelou Clostridium perfringens em cultura pura.
palavras-chave: Clostridium chauvoei; perna negra; bovino; PCR.
RESUMO
Foi detectada presença de Clostridium chauvoei pela reação de PCR a partir de cultivo em cooked meat medium de amostras de fígado, músculo e medula óssea metatarsiana de sete bezerros acometidos de carbúnculo sintomático. O isolamento de uma amostra de músculo sob condições anaeróbias revelou Clostridium perfringens em cultura pura.
Palavras-chave: Clostridium chauvoei, carbúnculo sintomático, bovino, PCR.
Clostridium spp é um dos géneros que compõem o grupo de bactérias anaeróbicas de considerável importância médica e económica. Clostridiose é o nome geral dado a uma variedade de doenças causadas pelas bactérias deste gênero, que podem ocorrer em qualquer parte do corpo que oferece condições para o seu desenvolvimento com consequente produção de toxinas durante a multiplicação (1). Clostridium chauvoei é o agente causador do edema negro e maligno nos bovinos, ovinos e outros ruminantes (4). Blackleg em gado é uma infecção endógena não-traumática, e uma proporção considerável de bovinos pode abrigar C. chauvoei em seu fígado. Os animais afetados são anorécticos, deprimidos, febris e coxos (um membro lateral), apresentando um inchaço quente e doloroso que se torna frio, edematoso com crepitação. A morte é vista dentro de 12 a 48 horas. Este agente parece ter uma preferência por grandes músculos (coxa, diafragma e coração), que na necropsia são escuros, vermelhos, secos e esponjosos (11). Sintomas semelhantes ao blackleg também podem ser causados por Clostridium septicum,C. novyi,C. perfringens ou C. sordellii. Em um estudo recente sobre a posição filogenética de C. chauvoei e C. septicum em seus 16S rRNA gene (rr) sequências, uma semelhança de 99,3% entre os rr genes de C. chauvoei e C. septicum, que também é refletida na fenotípica nível, foi determinada (7,8). Embora o diagnóstico presuntivo de edema negro e maligno dependa de achados clínicos e patológicos, a confirmação da doença é tipicamente encontrada através do isolamento e identificação do organismo, tais como produção de toxinas e métodos imunológicos (9,13). No entanto, estes métodos de diagnóstico são demorados e laboriosos. Além disso, os métodos imunológicos podem produzir resultados equívocos, uma vez que C. chauvoei e C. septicum têm em comum vários antigénios (4).
a amplificação do ácido nucleico de uma região alvo específica do genoma bacteriano pela reacção em cadeia da polimerase (PCR) tem sido amplamente utilizada para fins de detecção e diagnóstico (15). A capacidade de PCR para amplificar o DNA especificamente do baixo número de bactérias, bem como a sua simplicidade, rapidez e reprodutibilidade, oferece vantagens sobre os métodos convencionais de identificação, e foi realmente usado para identificar muitas espécies de Clostridium, incluindo C. chauvoei em culturas puras e em amostras clínicas (5,7,12,14). Um diagnóstico preciso de blackleg é, portanto, muitas vezes difícil. O diagnóstico padrão baseia-se num doseamento imunofluorescente e em critérios morfológicos.
neste artigo descrevemos um método baseado em PCR a partir do enriquecimento prévio em meio de carne cozida de amostras de vitelos com perna negra para identificar C. chauvoei. Foram analisadas amostras de fígado, músculo e medula óssea metatarsiana de vitelos que apresentaram sintomas de perna negra durante o outono Brasileiro. As amostras coletadas foram de seis vitelos de um rebanho do Estado de São Paulo e um vitelo do Estado de Mato Grosso do Sul (Tabela 1). Todos estes bovinos morreram subitamente, e apresentaram crepitação muscular no membro posterior.
macerado de amostras de fígado e músculo e de esfregaços de medula óssea foram inoculados em tubos com meio de Carne cozido (Difco ®) que, imediatamente antes, foi submetido a choque térmico (100ºC durante 10 minutos imediatamente arrefecido em água corrente), e depois foram incubados a 37ºC durante 48 horas. Dez microlitros de meio de carne cozida foram cultivados em 5% de ágar de sangue de ovelha e incubados a 37ºC durante 48 horas em condições anaeróbias. Colónias com forma, aspecto, cor e hemólise características foram submetidas a coloração Gram para determinação morfológica e da parede celular. Foram submetidos isolados suspeitos à catalase, lecitinase, gelatinase, glucose, lactose e testes de coagulação tumultuados do leite para identificação do género e espécie bacterianas. A técnica baseada no tiocianato de guanidina (2) foi realizada para extracção do ADN de sobrenadante de tubos com meio de Carne cozido. Centrifugou-se um mL de cada tubo a 13000 x g durante 20 minutos e ressuspendeu-se o sedimento em 200 µL de tampão Tris-EDTA antes do protocolo de extracção. A PCR Multiplex foi realizada com iniciadores projetados para o gene flagelin (fliC), descrito por SASAKI et al. (10), específico para Clostridium chauvoei e Clostridium septicum, que amplificam 535 pares de base (bp) e 294 bp, respectivamente. O forward primer FlaF é comum para ambas as espécies e FlachR e FlaseR são o inverso primers para C. chauvoei e C. septicum, respectivamente. Amplificação do DNA foi realizada em um volume total de 50 µL, com 200 µM de cada mistura de dntp, 5 µL de 10X tampão de reação, 2,5 mM de MgCl2, 30 pmol de cada primer (FlaF – 5′ AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG 3′ , FlachR – 5′ TACTAGCAGCATCAAAT t & c 3′ , e Flase R – 5′ TTTATTGAATTGTGTTTGTGAAG 3′ ), 1,25 U de Taq polimerase e 10 µL de DNA. Para a amplificação, foram utilizados trinta ciclos divididos em três fases: desnaturação a 94ºC durante 60 segundos, hibridização a 56ºC durante 60 segundos e extensão a 72ºC durante 60 segundos. C. chauvoei IB 1559 e C. septicum 10518 (estirpes do Instituto Biológico) foram utilizadas como controlos positivos de PCR, e a amostra muscular de uma vaca normal foi utilizada como controlo negativo de PCR.
a PCR foi também aplicada directamente a partir de amostras clínicas (fígado, músculo e medula óssea) utilizando os mesmos protocolos de extracção e amplificação de ADN acima referidos. As amplificações foram realizadas em um ciclador térmico Peltier-100 (Pesquisa MJ) e a análise dos produtos amplificados foi realizada por eletroforese em gel de agarose 1,3% manchada com brometo de etídio. Coloração
Gram de meio de carne cozida inoculada com as amostras suspeitas mostrou pequenas varetas gram-positivas com esporos subcterminais na maioria das amostras (fígado 1, músculos 1,2 e 7 e sulcos ósseos 3,4 e 5), Além de outras. No entanto, apenas na amostra do músculo 7 foi isolado Clostridium perfringens em cultura pura, e, não foi observado crescimento nas outras placas de amostras incubadas em condições anaeróbias. A PCR Multiplex a partir de amostras clínicas não revelou resultados positivos nem para C. chauvoei nem para C. septicum. Contudo, na reacção de sobrenadante do meio de Carne cozido inoculado com as mesmas amostras, sete delas foram positivas A C. chauvoei e negativas a C. septicum (fígado 1, músculos 1,2 e 7, sulcos ósseos 3,4 e 5), como se pode ver no quadro 1.
A estreita relação filogenética entre C. chauvoei e C. septicum molecular é um reflexo da semelhança fenotípica destes organismos. C. chauvoei é relativamente difícil de distinguir de C. septicum, e, além disso, C. septicum pode causar sintomas muito semelhantes aos sintomas blackleg (6,9).
GREGORY et al. (3) notificou a ocorrência e o tratamento de bovinos com perna negra com doses elevadas de penicilina. O diagnóstico foi realizado isolando C. chauvoei de um esfregaço da área de mionecrose, e inoculação de cobaias para sua identificação.
KUHNERT et al. (7) no entanto, um sistema de distinção entre c. chauvoei e C. septicum requer a restrição da digestão enzimática dos produtos de PCR para identificação definitiva do organismo, devido à pequena diferença no gene 16S rRNA de ambas as bactérias.
os nossos resultados mostram que a reacção PCR multiplex com base no gene fliC (10) foi eficiente para identificar C. chauvoei de amostras naturalmente infectadas cultivadas em meio de carne cozida, produzindo tiocianato de guanidina para extracção do ADN, e diferenciar esta espécie da C. septicum. No entanto, os resultados da PCR diretamente de amostras de tecidos foram negativos, provavelmente devido ao baixo número de microrganismos clostridianos, ou protocolo ineficiente de extração de DNA.
O isolamento de C. chauvoei é muito difícil, pois requer rígido condições anaeróbias, e de espécimes clínicos são frequentemente contaminadas com outras bactérias anaeróbias, incluindo clostridia no solo, que crescem mais rápido do que o C. chauvoei em um meio de cultura (9). A cultura microbiológica do músculo 7 revelou Clostridium perfringens isolado em cultura pura em condições anaeróbias. Esta espécie também pode ser envolvida em casos blackleg, e, no presente estudo, pode ser associado com C. chauvoei. De qualquer forma, se apenas métodos microbiológicos tivessem sido aplicados neste caso, o diagnóstico blackleg seria errado ou incompleto. As vacinas clostridianas proporcionam um elevado grau de imunidade contra as doenças clostridianas, e quando o diagnóstico é correto, a doença pode ser facilmente controlada. Para o efeito, as amostras clínicas devem ser devidamente colhidas e submetidas a exames laboratoriais. Uma vez que todas as doenças devidas à clostridia podem ser prevenidas através da vacinação, se o problema continuar apesar da vacinação, o diagnóstico deve estar errado. Além disso, uma descrição de caso é de importância fundamental para realizar a análise laboratorial (1).
as infecções causadas por microrganismos de clostrídia causam perdas consideráveis na produção, uma vez que o tratamento geralmente é impraticável. O controlo e a prevenção devem incluir medidas adequadas de manipulação e vacinação sistemática do bando, uma vez que os animais estão em contacto permanente com os agentes e com os factores que poderão desencadear as doenças.
detecção de ácido nucleico de C. chauvoei a partir do enriquecimento prévio de amostras naturalmente infectadas em meio de carne cozida elucidou o diagnóstico nestes dois surtos brasileiros de blackleg, que geralmente permanece inconclusivo por causa da limitação da cultura microbiológica. Além disso, devido à elevada especificidade da técnica de PCR, evitou-se o emprego de cobaias na identificação do agente.
1. Baldassi, L. (2005). Toxinas clostridiosas venenos potentes, medicamentos potentes. J. Venom. Anim. Toxicologia. Trop. S., 11(4), 391-411.
2. Boom, R.; Sol, C. J. A.; Salimans, M. M. M.; Jansen, C. L.; Werthein-Van-Dilen, P. M. E.; Noordaa Van Der J. (1990). Método rápido e simples para a purificação de ácidos nucleicos. J. Clin. Microb., 28, 495-503.
3. Gregory, L.; Della Libera, A. M. M.; Birgel Junior, E. H.; Pogliani, F. C.; Birgel, D. B.; Benesi, F. J.; Miyashiro, S.; Baldassi, L. (2006). Carbúnculo sintomático: ocorrência, evolução clínica e acompanhamento da recuperação de bovino acometido de “manqueira”. Arq. Inst. Biol., 73(2), 243-246.
4. Hamaoka, T.; Terakado, N. (1994). Demonstration of common antigens on cell surface of Clostridium chauvoei and Clostridium septicum by indirect immunofluorescence assay. J. Vet. Med. Sci., 56, 371-373.
5. Kojima, A.; Uchida, I.; Sekiaki, T.; Sasaki, Y.; Ogikubo, Y.; Tamura, Y. (2001). Detecção rápida e identificação de Clostridium chauvoei por PCR com base na sequência genética de flagellin. Veterinario. Microb., 78, 363-371.
6. Kuhnert, P.; Capaul, S. E.; Nicolet, J.; Frey, J. (1996). Posições filogenéticas de Clostridium chauvoei e Clostridium septicum baseadas em sequências de genes rRNA 16S. T. J. Syst. Bact., 46(4), 1174-1176.
7. Kuhnert, P.; Krampe, M.; Capaul, S. E.; Frey, J.; Nicolet, J. (1997). Identificação de Clostridium chauvoei em culturas e material clínico de blackleg utilizando PCR. Veterinario. Microb., 51, 291-298.
8. Moussa, J. (1959). Fórmulas antigénicas para Clostridium septicum e Clostridium chauvoei.J. Path. Alcoolemia., 7, 341-350.
9. Sasaki, Y.; Kojima, A.; Aoki, Hiroshi; Ogikubo, Y.; Takikawa, N.; Tamura, Y. (2002). Análise filogenética e detecção por PCR de Clostridium chauvoei,Clostridium hemolyticum, Clostridium novyi tipos A E B, e Clostridium septicum com base no gene flagellin. Veterinario. Microb., 86, 257-267.
10. Sasaki, Y.; Yamamoto, K.; Kojima, A.; Norimatsu, M.; Tamura, Y. (2000). Identificação rápida e diferenciação da clostrídia patogénica no gangreno gasoso por reacção em cadeia da polimerase com base na região espaçadora 16s-23S rDNA. Res. Vet. Ciência., 69, 289-294.
11. Sippel, W. L. (1982). Diagnóstico de doenças Clostridianas. J. Am. Veterinario. Med. Assoc., 161, 1299-1305.
12. Uzal, F. A.; Prumo, J. J.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1997). Detecção por PCR de Clostridium perfringens que produzam toxinas diferentes nas fezes de caprinos. Lett. Aplicacao. Microb., 25, 339-344.
13. Vanelli, S. A.; Uzal, F. A. (1996). Detecção de Clostridium septicum pela técnica da peroxidase-antiperoxidase( PAP), em tecidos de ovinos fixos à formalina, com parafina incorporada. Arco. Med. Veterinario., 28, 125-127.
14. Warren, A. L.; Uzal, F. L.; Blackall, L. L.; Kelly, W. R. (1998). Detecção por PCR de Clostridium perfringens Tipo D em tecidos fixos em formalina, parafínicos de caprinos e ovinos. Lett. Aplicacao. Microb., 29, 15-19.
15. Whelen, a. C.; persing, D. H. (1996). The role of nucleic acid amplification and detection in the clinical microbiology laboratory. Anao. Rev. Microb., 50, 349-373.