wyniki i dyskusja
podczas naszych badań sygnalizacji uszkodzenia DNA (32, 33), zaobserwowaliśmy dwa znaczące pasma w immunoblotach Chk1: pasmo Chk1 przy 56 kDa i pasmo szybszej migracji 43 kDa. Szybciej migrujące pasmo zostało wykryte przez przeciwciała Chk1, które były reaktywne wobec wewnętrznej domeny kinazy lub sekwencji C-końcowej, ale nie przez przeciwciała chk1 rozpoznające koniec N(Fig . 1a). Pasmo to nie zostało rozpoznane przez przeciwciało monoklonalne g4 z biotechnologii Santa Cruz, które jest powszechnie stosowane do analizy immunoblotowej Chk1 (24, 29). Knockdown Chk1 przez siRNA doprowadziło do zniknięcia zarówno chk1, jak i pasma 43-kDa, co potwierdziło ich znaczenie (rys. 1B). Na białko 43-kDa nie wpływały proteasomy i inhibitory proteazy (dodatek SI, Fig. 1), podnosząc możliwość, że może to być alternatywny wariant splotu Chk1. National Center for Biotechnology Information database obecnie wymienia trzy alternatywnie splecione ludzkie mRNA Chk1, które mają różne nieprzetłumaczone regiony, ale kodują to samo pełnowymiarowe białko Chk1 z 476 aminokwasów (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). Jednak nasza analiza z wykorzystaniem opartej na EST alternatywnej bazy danych przewidującej splicing (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) zasugerowała możliwość unikalnego wariantu splicingu Chk1, w którym exon 3 jest alternatywnie splicowany lub usunięty. Aby bezpośrednio przetestować tę możliwość, wykonaliśmy RT-PCR przy użyciu starterów w sekwencji kodującej Chk1 (rys. 1C). RT-PCR z użyciem zestawu starterowego P1, w którym Starter przedni został zaprojektowany w eksonie 3, wygenerował pojedynczy amplikon o oczekiwanej wielkości, podczas gdy RT-PCR z zestawem starterowym P2 lub P3 (oba oparte na sekwencjach flankujących ekson 3) wygenerował dwa amplikony, jeden o oczekiwanej wielkości Chk1, a drugi ∼200 bp krótszy (Fig. 1C). Sekwencjonowanie potwierdziło, że dłuższy amplikon był rzeczywiście Chk1 i, w szczególności, krótszy amplikon był alternatywnym wariantem splicingu Chk1 bez eksonu 3 (Fig. Dodatek 1D i SI, rys. 2A). Przewidywano, że ten wariant splicingu przełoży się na N-końcową skróconą formę Chk1 składającą się z 382 aminokwasów, które nazwaliśmy chk1-short lub Chk1-S (Fig. Dodatek 1D i SI, rys. 2). W elektroforezie żelowej, translowane in vitro Chk1 – s migrowały podobnie jak białko 43-kDa z komórek HEK293 (Fig. 1e). Następnie immunoprecypitowaliśmy białko 43-kDa z lizatu komórkowego HEK293 do spektrometrii masowej i potwierdziliśmy jego tożsamość jako Chk1-S. N-końcowe obcinanie w Chk1 – s jest zgodne z wynikami immunoblot pokazującymi, że nie zostało rozpoznane przez przeciwciała reagujące na N-końcową sekwencję Chk1 (Fig . 1a). Analiza w czasie rzeczywistym i RT-PCR wykryła ekspresję mRNA Chk1 – s w wielu tkankach ludzkich, a ekspresja jest na ogół wyższa w tkankach płodu (dodatek SI, Fig. 3 A I D). Analiza Immunoblot dalej wykryto ekspresję białka Chk1 – s w liniach komórkowych człowieka, myszy i szczura, a także w tkankach płodu ludzkiego (dodatek SI, Fig. 3B) i mysich pierwotnych komórek kanalików nerkowych (dodatek SI, Fig. 3C). CDNA o Pełnej długości chk1 – s również sklonowano z trzech normalnych tkanek ludzkich (grasicy, okrężnicy, wątroby płodu) i zsekwencjonowano w celu potwierdzenia, że koduje on n-końcowy skrócony wariant splotu Chk1. Łącznie eksperymenty te zidentyfikowały unikalny wariant splotu Chk1, który jest N-terminalnie skrócony i szeroko wyrażony w komórkach i tkankach ssaków.
Identyfikacja Chk1 – s jako unikalnego, N-terminalnie skróconego wariantu splotu Chk1. (A) lizat komórek HEK293 analizowano przez immunoblotting przy użyciu przeciwciał specyficznie rozpoznających końcówkę n (α-Chk1-NT), domenę kinazy (α-Chk1-KD) lub końcówkę C chk1 (α-Chk1-CT). Oprócz Chk1, białko 43-KDA zostało ujawnione przez α-Chk1-KD i α-Chk1-CT, ale nie α-Chk1-NT. B) komórki HEK293 transfekowano siRNA Chk1 (siChk1) lub sekwencją kodowaną (siCon) przez 48 godzin w celu zebrania lizatu pełnokomórkowego do analizy immunoblotowej przy użyciu α-Chk1-KD. siChk1 zmniejszał ekspresję zarówno Chk1, jak i białka 43-kDa. (C) RNA wyizolowano z komórek HEK293 dla RT-PCR przy użyciu trzech różnych zestawów starterów dla Chk1: P1, P2 i P3 (względne lokalizacje sekwencji przedstawiono na diagramie). Dwa amplikony zostały wykryte przez RT-PCR za pomocą zestawów starterowych flankujących ekson 3 (P2 i P3), podczas gdy tylko jeden amplikon został amplifikowany za pomocą zestawu starterowego P1, z którego Starter przedni znajdował się w eksonie 3 Chk1. D) Schematyczne przedstawienie alternatywnego splicingu Chk1, w wyniku którego powstaje N-terminalnie ścięte białko, Chk1-S. E) chk1-s sklonowano do translacji in vitro, a przetłumaczone białko wraz z lizatem komórkowym HEK293 analizowano za pomocą analizy immunoblotowej. Przetłumaczony in vitro Chk1 migrował podobnie do pasma 43-kDa w komórkach HEK293.
Jaka jest funkcja Chk1-s? Czy reguluje punkty kontrolne cyklu komórkowego, takie jak Chk1? Na podstawie tych pytań najpierw określiliśmy temporalne i przestrzenne wzorce ekspresji Chk1-S w cyklu komórkowym. Komórki HEK293 synchronizowano w fazach G1, G1/s lub G2/M odpowiednio przez głód w surowicy, podwójny blok tymidyny lub nocodazol. Chk1 – s był niski w komórkach fazy G1 i wyższy w komórkach G1/s i G2/M (dodatek SI, Fig. 4 A i B). Ponadto, gdy komórki zsynchronizowano w fazie G1 / s za pomocą podwójnego bloku tymidyny, a następnie uwolniono, ekspresja Chk1 i Chk1 – s wzrosła po wejściu w fazę s (Fig. 2A). Wyraźną różnicą między wyrażeniem Chk1 a wyrażeniem Chk1-s było to, że podczas gdy wyrażenie chk1 osiągało szczyt w fazie mid-s, wyrażenie Chk1-s wzrastało z fazy s Do m (Fig. 2A). Co ciekawe, wysokie poziomy ekspresji Chk1-s obserwowano po 7 godzinach od uwolnienia cyklu komórkowego z podwójnego bloku tymidyny, w momencie, gdy komórki nie były jeszcze mitotyczne (dodatek SI, Fig. 4C). Następnie obliczyliśmy stosunek Chk1-s: chk1 w komórkach zsynchronizowanych asynchronicznych i S lub G2/M. Pomimo zmian ekspresji Chk1-s W komórkach HEK293, U2OS i pierwotnych kanalikach nerkowych, stosunek Chk1-s:Chk1 był powyżej 1 we wszystkich komórkach w fazie G2/M (dodatek SI, Fig. 5). W komórkach asynchronicznych chk1-s i Chk1 zlokalizowane były głównie w jądrze (dodatek SI, Fig. 6a). Jednak w komórkach fazy G2/M niektóre Chk1 – s i Chk1 nagromadziły się w centrosomach (dodatek SI, Fig. 6 B I C). Lokalizacja Chk1 w centrosomach ma kluczowe znaczenie dla funkcji punktu kontrolnego G2 / M, gdzie zapobiega przedwczesnej aktywacji Cdk1 i wejścia mitotycznego (34, 35). Nasze wyniki wskazują, że Chk1 – s może również lokalizować się w centrosomach, zapewniając przestrzenną i czasową regulację Chk1 w celu zainicjowania wejścia mitotycznego. Następnie określaliśmy efekty nadekspresji Chk1 lub Chk1 – s w komórkach HEK293 i u2os. W porównaniu z GFP-Chk1, GFP-Chk1-s wywołał wyróżniony fenotyp jądrowy, który charakteryzował się kondensacją jądrową i tworzeniem mikrojąder i wielu lub wielowarstwowych jąder (Fig. 2b). We wcześniejszych punktach czasowych transfekowane komórki wykazywały kondensację jądrową / chromatynową, charakteryzującą się słabym i punktowym fosforylowaniem histonu-H3 (Fig. 2B), wskazujące na przedwczesne wejście mitotyczne. Później komórki te rozwinęły mikrojądra lub wielowarstwowe jądra, cechy katastrofy mitotycznej (Fig. 2b). Zliczanie komórek wykazało, że GFP-Chk1-s indukuje fenotyp jądrowy w ∼20% komórek U2OS (Fig. 2C). Podobne efekty wykazały YFP-Chk1-s i Chk1-s-Myc (rys. 2C), co wskazuje, że obserwowany fenotyp jądrowy był indukowany przez Chk1-s, a nie przez znaczniki białek fuzyjnych. Natomiast przedwczesne wejście mitotyczne nie było indukowane przez chk1 lub jego martwego mutanta Chk1-KD (Fig. 2C). Chk1 – s wywołał również uderzający fenotyp jądrowy w innych typach komórek (dodatek SI, Fig. 7). W szczególności, podobny fenotyp jądrowy został zgłoszony w komórkach i modelach mysich bez jednego lub obu alleli Chk1 (7, 36, 37), co sugeruje, że Chk1-s może działać jako endogenny inhibitor Chk1. Aby dalej przetestować tę możliwość, wygenerowaliśmy linie komórkowe TET-on U2OS, które mogą być indukowane do ekspresji Chk1, Chk1-KD lub Chk1 – S. komórki zsynchronizowano w fazie G1/s za pomocą podwójnego bloku tymidyny, indukowanego przez doksycyklinę, a następnie uwolniono do pożywki zawierającej nocodazol. Około 80% komórek wyrażających Chk1-s weszło w mitozę , podczas gdy ∼60% komórek wyrażających chk1-lub Chk1 – KD weszło w mitozę (Fig. 2D). Co ważne, podczas gdy większość komórek mitotycznych w grupach wyrażających Chk1 i Chk1-KD miała 4n DNA, ∼25% komórek mitotycznych z grupy wyrażającej chk1-s miało mniej niż 4N DNA (Fig. 2D), wskazujące na nieprawidłowy mitotyczny wstęp do tych komórek bez zakończenia replikacji DNA. Ponadto nadekspresja Chk1-s doprowadziła do wcześniejszego wejścia w mitozę, na co wskazuje pojawienie się komórek PH3-dodatnich (dodatek SI, Fig. 8). Chk1 jest kluczowym regulatorem wejścia mitotycznego lub przejścia S-Do-G2 / M w cyklu komórkowym. Fosforylując CDC25A (indukując jego degradację) i Wee1, Chk1 zapobiega aktywacji CDK1 i wejściu mitotycznemu (5, 15-20). Wykazaliśmy, że indukcja chk1-s przez doksycyklinę w komórkach Tet-on u2os powoduje wyższe poziomy CDC25A i niższe poziomy fosfo-CDK1, co sugeruje, że chk1-s antagonizuje Chk1 w celu indukcji wejścia mitotycznego (Fig. 2E). Specyficzne knockdown Chk1-s przez RNAi nie powiodło się, ponieważ Sekwencja Chk1-S jest zawarta w Chk1 mRNA. Jednakże antysensowny oligonukleotyd komplementarny do unikalnego złącza exon2-exon4 w Chk1 – s może specyficznie zmniejszyć ekspresję Chk1-s (dodatek SI, Fig. 9a). Chk1-s regulacja w dół znacznie zmniejsza proliferację komórek (dodatek SI, rys. 9b). Co ciekawe, regulacja w dół Chk1 – s nie zmieniła znacząco profilu cyklu komórkowego (dodatek SI, Fig. 9C). Ponieważ chk1 działa w kilku punktach kontrolnych cyklu komórkowego (np. G2/M, wrzeciono, intra-s), Chk1-s może antagonizować Chk1 w celu ułatwienia progresji cyklu komórkowego w wielu miejscach. W rezultacie hamowanie Chk1 – s może spowolnić cykl komórkowy w różnych fazach i spowodować zahamowanie proliferacji bez większych zmian rozkładu cyklu komórkowego.
regulacja cyklu komórkowego za pomocą Chk1-S. A) komórki HEK293 zsynchronizowano podwójnym blokiem tymidyny, a następnie uwolniono do pożywki zawierającej nocodazol. (Lewy) profil cyklu komórkowego analizowany przez barwienie jodkiem propidium (PI) i analizę FACS. (Po prawej) Analiza Immunoblotowa Chk1 i Chk1 – s W lizacie komórkowym zebranym we wskazanych punktach czasowych po uwolnieniu z bloku tymidyny. AS, komórki asynchroniczne (B) komórki U2OS transfekowano GFP-Chk1 lub GFP-Chk1-s (zielony), a następnie utrwalono dla immunofluorescencji fosfo-histonu H3 (czerwony) i barwienia jądrowego Hoechst33342 (niebieski). (Górny) Chk1-S, ale nie Chk1, wywołał przedwczesną kondensację chromatyny i słabe zabarwienie pH3 (strzałki). W późnym stadium komórki transfekowane Chk1-s wykazywały cechy katastrofy mitotycznej, w tym mikrojąder i jąder wielowarstwowych (strzałki). C) transfekowano komórki U2OS ze wskazanymi genami oraz policzono komórki o fenotypie jądrowym przedwczesnej kondensacji chromatyny i katastrofie mitotycznej. Dane wskazują średnią ± SD; * P < 0, 05 w porównaniu z grupą wektorów. Wyniki pokazują, że nadekspresja Chk1-S wyraźnie doprowadziła do fenotypu jądrowego. (D) komórki U2OS transfekowano wskazanymi genami, zsynchronizowano przez podwójny blok tymidyny i uwalniano przez 7 godzin. następnie komórki Naprawiono do immunofluorescencji pH3 i barwienia PI i przeanalizowano przez FACS. Dane wskazują średnią ± SD; * P < 0, 05 w porównaniu z grupą wektorów. Wyniki pokazują, że chk1-s specyficznie indukuje przedwczesne wejście mitotyczne bez zakończenia replikacji DNA (komórki o < 4N DNA). E) komórki Tet-on U2OS indukowano z doksycykliną lub bez niej. Następnie komórki zsynchronizowano w fazie s za pomocą podwójnego bloku tymidyny i zwolniono na 7 godzin. Do analizy immunoblotowej wskazanych białek zebrano lizat pełnokomórkowy. Wyniki pokazują, że indukowana ekspresja Chk1-s doprowadziła do wzrostu CDC25A i zmniejszenia fosfo-CDK1, przyczyniając się do przedwczesnego wejścia mitotycznego.
jak chk1-s antagonizuje Chk1? Postawiliśmy hipotezę, że Chk1 – s może wchodzić w interakcje z Chk1, aby zablokować aktywność kinazy. Konsekwentnie, FLAG-Chk1-s wyrażone w komórkach hek293 koimmunoprecypitowanych z endogennym Chk1 (Fig . 3A). Ponadto in vitro przetłumaczone Myc-Chk1 i chk1-s coimmunoprecipitated (Fig. 3B), co sugeruje bezpośrednią interakcję Chk1-Chk1 – S. Ponadto wykazaliśmy koimmunoprecypitację Chk1 z domeną N-końcową, ale nie domeną C-końcową chk1 – s (Fig. 3C), sugerując wymóg N-końcowej sekwencji w Chk1 – s dla jej interakcji z Chk1. Funkcjonalnie określiliśmy wpływ Chk1 – s na aktywność kinazy Chk1. Chk1-Myc poddano ekspresji i poddano immunoprecypitacji do testu kinazy in vitro przy braku lub w obecności oczyszczonego Chk1-S. Jak pokazano na Fig. 3D, aktywność kinazy Chk1 została częściowo jeszcze znacząco stłumiona przez Chk1-s, ale nie przez skażoną Cieplnie Chk1-S. w przeciwieństwie do tego, Chk1-s nie zmniejszyła aktywności Chk2, która ma podobne preferencje substratowe jak Chk1. W porównaniu z Chk1, Chk1 – s nie ma części domeny kinazy, w tym miejsca wiązania ATP (Fig. 1D) i, zgodnie z oczekiwaniami, nie wykazywały znaczącej aktywności kinazy białkowej (Fig. 3D). Chk1 – s może również hamować aktywność kinazy N-terminalnie oznaczonego Chk1 (FLAG-Chk1) w teście kinazy in vitro (dodatek SI, Fig. 10). Wyniki te sugerują, że Chk1-s może hamować Chk1 poprzez interakcję molekularną. Niedawne badanie wykazało, że przemywanie immunoprecypitatów Chk1 przy użyciu bardziej rygorystycznego bufora testu Immuno-strącania radiowego (RIPA) może znacznie zwiększyć aktywność kinazy Chk1, co sugeruje, że Chk1 jest zwykle hamowany przez czynniki tłumiące (29); jednakże tożsamość czynników tłumiących jest nieznana. Potwierdziliśmy wpływ płukania bufora RIPA i, w szczególności, wykazaliśmy, że dodanie egzogennego Chk1 – s może odwrócić wpływ płukania bufora RIPA na aktywność kinazy Chk1 (dodatek SI, Fig . 11), co sugeruje, że Chk1-s może być jednym z kluczowych endogennych czynników tłumiących Chk1.
Chk1 – s współdziała z Chk1, aby stłumić jego aktywność kinazy . (A) komórki HEK293 transfekowano FLAG-Chk1-s lub pustym wektorem w celu zebrania lizatu do immunoprecypitacji (IP) przy użyciu przeciwciał anty-FLAG. Immunoprecypitaty analizowano pod kątem Chk1 i FLAG-Chk1 – s, stosując immunoblotting odpowiednio przeciwciałami anty-FLAG i anty-N terminus Chk1. Wyniki pokazują Ko-IP FLAG-Chk1 – s z endogennym Chk1. B) Chk1-Myc i Chk1-S zostały wyprodukowane przy użyciu TnT in vitro transcription/translation kit (Promega). (Po lewej) in vitro uzyskano Chk1-Myc i Chk1 – s wykazane przez immunoblotting. (Po prawej) chk1-Myc poddano immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciał anty-Myc po inkubacji z lub bez Chk1-S. immunoprecypitaty analizowano pod kątem Chk1-s i Chk1-Myc metodą immunoblottingu. Wyniki wskazują na bezpośrednią interakcję między komórkami Chk1 i chk1-S. (C) hek293 transfekowano oznaczonymi Myc Chk1-s lub jego mutantami delecji C lub n w celu zebrania lizatu do immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciał anty-Myc. Immunoprecypitaty badano na obecność Chk1. Wyniki wykazują koimmunoprecypitację Chk1 z Chk1 – s i jego mutantem delecji C-terminalnej, ale nie z mutantem delecji N-terminalnej. (D) komórki HEK293 transfekowano znakowanymi myc Chk1-s, Chk1 lub Chk2 w celu zebrania lizatu do immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciał anty-Myc. Immunoprecypitaty zawierające Chk1-s-Myc, Chk1-Myc lub Chk2-Myc inkubowano z Chk1-s lub bez Chk1-s przez 1 godzinę, a następnie dodano do testu aktywności kinazy z użyciem chktide jako substratu. Denaturowany Chk1 – s przygotowywano przez gotowanie. Dane wskazują na średnią ± SD; * P < 0, 05 w porównaniu z grupą Chk1-Myc. Wyniki pokazują, że natywne Chk1 – s mogą specyficznie hamować Chk1. (E) komórki HEK293 transfekowano mutantem Chk1-Myc lub chk1-Myc(s317a/s345a). Komórki następnie nieleczono lub poddano działaniu 100 nM kamptotecyny przez 2 godziny w celu zebrania lizatu w celu immunoprecypitacji z przeciwciałami anty-Myc. Immunoprecypitaty analizowano pod kątem Myc-Chk1, fosforylowanej (seryny 345) Chk1 i Chk1-s metodą immunoblottingu. W próbkach zweryfikowano również wkład Chk1. Wyniki pokazują, że koimmunoprecypitacja Chk1-s lub związane z Chk1 w normalnych komórkach i że związek był zmniejszony podczas indukowanego kamptotecyną uszkodzenia DNA. Jednakże związek pomiędzy Chk1 – s i mutantem Chk1(S345A/s317a) nie został zakłócony podczas uszkodzenia DNA, co sugeruje, że fosforylacja Chk1 w S345 i S317 może być wymagana do dysocjacji Chk1-s z Chk1. (F) komórki HEK293 zakażono albo chk1-Myc + pustym wektorem, albo Chk1-Myc + DN-ATR, a następnie poddano działaniu 100 nM kamptotecyny przez 2 godziny. Lizat komórkowy zebrano w celu immunoprecypitacji przeciwciałami anty-Myc, a następnie przeprowadzono analizę immunoblotową wskazanych białek. Wyniki pokazują, że indukowane kamptotecyną zakłócenia dysocjacji Chk1-Chk1–s zależą od ATR i fosforylacji Chk1.
w odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR), Chk1 jest wyraźnie aktywowany poprzez fosforylację w resztach s345 i s317 (7, 13, 38, 39). Pomimo uznania znaczenia fosforylacji S345/s317, pozostaje niejasne, w jaki sposób fosforylacja ta aktywuje Chk1 (28-30). Pokazaliśmy, że wyrażenie Chk1-s nie zmieniło się znacząco w DDR (dodatek SI, rys. 12). Jednakże, interakcja Chk1–Chk1-s została atenuowana w DDR indukowanym przez kamptotecynę, inhibitor topoizomerazy i DNA i czynnik uszkadzający DNA (Fig. 3E). Warto zauważyć, że dysocjacja Chk1 z Chk1 – s W DDR była zależna od fosforylacji chk1 w s345/s317, ponieważ mutant Chk1(s345a/s317a) nie dysocjował z chk1-s podczas leczenia kamptotecyną (Fig. 3E). W DDR aktywacja Chk1 zależy od fosforylacji za pośrednictwem ATR (7, 13, 14). Wykazaliśmy, że hamowanie ATR poprzez dominujący Mutant ujemny (DN-ATR) nie tylko hamowało fosforylację chk1-s indukowaną kamptotecyną, ale także zapobiegało dysocjacji Chk1-Chk1-s (Fig. 3F). Podobnie, chk1 dysocjował z Chk1 – s podczas DDR indukowanego cisplatyną, a dysocjacji zapobiegał DN-ATR (dodatek SI, Fig. 13). Łącznie wyniki sugerują, że fosforylacja Chk1 może zakłócić jej interakcję z endogennym inhibitorem Chk1-s, prowadząc do aktywacji Chk1 w DDR.
identyfikacja Chk1-s jako unikalnego regulatora progresji cyklu komórkowego i proliferacji komórkowej skłoniła nas do zbadania jego ekspresji w tkankach nowotworowych. Na poziomie mRNA większość tkanek nowotworowych wyrażała wyższe poziomy Chk1 i Chk1-S niż normalne tkanki (dodatek SI, Fig. 14). Co ciekawe, rak jąder wykazał wyraźną regulację chk1 – s, ale nie Chk1 (rys. 4a). Swoista Regulacja up Chk1 – s została dodatkowo potwierdzona analizą immunoblotową w tkankach raka jąder, zwłaszcza w próbkach nowotworowych w późnym stadium (Fig. 4B). Jak donoszono wcześniej (5), zarówno normalne, jak i złośliwe tkanki jąder miały wysoki poziom ekspresji Chk1. Zwiększoną ekspresję Chk1-s Wykryto również podczas progresji raka jajnika (Fig. 4B). Stosunkowo wysoki poziom ekspresji Chk1 i Chk1-S u obu płodu (dodatek SI, Fig. 3) i raka (rys. 4) tkanki sugerują, że Chk1 – s może przyspieszyć postęp cyklu komórkowego, promując proliferację komórek w tych warunkach.
Regulacja Chk1-s w raku . A) analiza PCR w czasie rzeczywistym ekspresji mRNA Chk1 i chk1-s w prawidłowych tkankach jąder i próbkach raka jąder, pokazująca-Regulacja Chk1 – s w rakach jąder. B) Analiza Immunoblotowa Chk1 i Chk1 – s W Ludzkich prawidłowych tkankach nowotworowych jąder i jąder, wykazująca zwiększoną ekspresję Chk1 – s w tkankach nowotworowych w późnym stadium. (C) nagie myszy wstrzyknięto 10 × 106 Tet-na komórkach MDA-MB-231, które były indukowane doksycykliną do ekspresji Chk1, Chk1-KD lub Chk1-s, odpowiednio. Po założeniu guza do ∼100 mm3 myszy utrzymywano w wodzie pitnej z doksycykliną lub bez niej. Objętość guza mierzono raz w tygodniu (pokazano dla wartości w czwartym tygodniu, n = 8). Dane wskazują średnią ± SD. Wyniki pokazują, że indukowana ekspresja Chk1-S, ale nie Chk1 lub Chk-KD, hamowała wzrost guza. D) densytometria wyników immunoblotowych indukowanej doksycykliną ekspresji Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc i Chk1-S-Myc w nowotworach wyciętych (N = 3 dla każdej grupy). Sygnały zostały znormalizowane za pomocą Chk1-Myc (arbitralnie ustawione jako 100). Dane wskazują średnią ± SD. Wyniki pokazują, że doksycyklina indukowała podobne poziomy ekspresji Chk1-Myc, Chk1-KD-Myc i Chk1-S-Myc w guzach. (E) nagie myszy wstrzyknięto indukowalnymi komórkami chk1-s W celu utworzenia guzów, a następnie utrzymywano w wodzie pitnej z doksycykliną lub bez doksycykliny przez 4 wk. Tkanki nowotworowe zebrano do analizy immunoblot. Wyniki pokazują wyższą ekspresję CDC25A w przeszczepach nowotworowych z indukowaną doksycykliną ekspresją Chk1 – S.
następnie zbadano wpływ ektopowej ekspresji Chk1 – s na wzrost guza ksenogenicznego u myszy. Przeszczepy nowotworowe ustalono u nagich myszy przy użyciu linii komórek raka piersi Tet-on MDA-MB-231, które mogą być indukowane przez doksycyklinę do ekspresji Chk1, Chk1-S lub Chk1-KD. Indukcja chk1 lub chk1-KD przez doksycyklinę nie miała wpływu na wzrost guza; jednakże indukcja Chk1-s powodowała zmniejszenie objętości guza o 40% (Fig. 4C). Indukowane Chk1-s tkanki nowotworowe również wykazywały akumulację cdc25A, wskazując na hamowanie Chk1 (Fig . 4E). Chociaż wyniki mogą sugerować unikalną strategię przeciwnowotworową, fizjologiczne znaczenie wymuszonej nadekspresji ektopowej Chk1 – s pozostaje niejasne. Wyniki te są jednak dowodem na to, że przechylenie równowagi Chk1-Chk1 – s może prowadzić do katastrofy mitotycznej i zmniejszenia proliferacji komórek.
obserwacja, że nadekspresja Chk1-s zmniejszała wzrost guza ksenogenicznego (rys. 4 C–E) wydawało się sprzeczne z obserwacją, że próbki nowotworów od pacjentów ludzkich wyrażały stosunkowo wysoki poziom chk1-s dla proliferacji komórek (Fig. 4 A i B oraz dodatek SI, rys. 14). Aby pogodzić te dane, ważne jest, aby rozpoznać różnice między Warunkami doświadczalnymi. Stosunkowo wysoką ekspresję Chk1 – s w guzach ludzkich można przypisać obecności komórek proliferacyjnych w tych tkankach. Konsekwentnie, Chk1 – s jest również wysoki w tkankach płodu, które są silnie proliferacyjne (dodatek SI, Fig. 3A). Co ważne, ekspresja Chk1 – s w tych tkankach proliferacyjnych jest czasowo ograniczona do późnej fazy S Do m (Fig. 2 i dodatek SI, rys. 4). Ta regulacja czasowa może zapewnić hamowanie aktywności Chk1 PO (i tylko po) zakończeniu replikacji DNA w fazie s W celu progresji cyklu komórkowego do fazy G2/M. Jednakże, gdy ektopowy Chk1 – s jest zmuszony do nadmiernej ekspresji w hodowanych komórkach lub guzach ksenogenicznych, czasowe ograniczenie ekspresji Chk1-s jest zakłócone; innymi słowy, Chk1-s jest wysoki w całym cyklu komórkowym, w tym w fazie s, co powoduje stałą blokadę Chk-1 i przedwczesne wejście mitotyczne, co prowadzi do katastrofy mitotycznej i zmniejszonej proliferacji komórek.
podsumowując, badanie to zidentyfikowało wariant splicingu Chk1, Chk1-s, który jest kluczowym regulatorem Chk1 w normalnym cyklu komórkowym i podczas DDR (dodatek SI, Fig. 15). W nienapędzonym cyklu komórkowym ekspresja Chk1 wzrasta w fazie s, a niektóre cząsteczki Chk1 mogą być fosforylowane przez ATR zapobiegające wiązaniu Chk1 – s, co skutkuje wysoką aktywnością Chk1 i utrzymaniem fazy S aż do zakończenia replikacji DNA. W fazie G2 ekspresja Chk1 – s wzrasta i, jak donoszono (29), fosforylacja chk1 zmniejsza się, promując interakcję Chk1–Chk1-s W celu stłumienia aktywności Chk1. Spadek aktywności Chk1 w fazie G2/M ma kluczowe znaczenie dla wejścia mitotycznego. W Warunkach indukcji Chk1-s lub nadekspresji, nadmierne ilości Chk1-s sekwestrują Chk1 i zmniejszają jego aktywność kinazy w fazie s, powodując przedwczesne wejście mitotyczne bez zakończenia replikacji DNA, prowadząc do katastrofy mitotycznej. Podczas uszkodzenia DNA, chk1 ulega fosforylacji, co powoduje zmniejszenie wiązania Chk1 – s, zwiększenie aktywności Chk1 i zatrzymanie G2/M (dodatek SI, Fig. 11). Nasze odkrycia wspierają mechanizm „de-represji” aktywacji Chk1 (29). Co ważne, Chk1-S wydaje się być jednym z kluczowych czynników tłumiących aktywność Chk1. Antagonizując Chk1, Chk1 – s może przyspieszyć cykl komórkowy, prowadząc do zwiększonej proliferacji w tkankach płodu i nowotworowych. Wysoki poziom Chk1 w proliferujących komórkach koordynuje fazę s i mitozę, podczas gdy wysoki poziom Chk1 – s może zapewnić potężny przełącznik dla przejścia fazowego S-do-G2 / M. Natomiast wymuszona nadekspresja Chk1 – s na nadmiernych poziomach, niezrównoważona przez Chk1, indukuje przedwczesne wejście mitotyczne i śmierć komórki (Fig. 2) i hamuje wzrost guza w modelach xenograft guza (rys. 4). Sugerowano, że chk1 jest skutecznym celem terapeutycznym w terapii nowotworowej, a inhibitory Chk1 są oceniane w badaniach klinicznych (40-43). Identyfikacja Chk1 – s jako endogennego inhibitora Chk1 może otworzyć nowe obszary badań w regulacji cyklu komórkowego, odpowiedzi na uszkodzenia DNA i terapii nowotworowej.