獣医微生物学
Clostridium chauvoeiの同定blackleg症例からの培養の臨床サンプルにおけるPCR-
Clostridium chauvoeiの同定材料
st miyashiroi,*a.f.c.nassari;m.C.A.,M.SOUZAI,J.B.CARVALHOI;J.e.b. AdegasII
IInstituto Biológico,São Paulo,SP,Brasil
IIMato Grosso do Sul,Brasil
ABSTRACT
c.chauvoeiの存在は、肝臓、筋肉および中足骨骨髄サンプルの調理された肉培地中の培養上清からポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって検出された。 一つの筋肉試料の嫌気性条件下での単離は、純粋な培養中のClostridium perfringensを明らかにした。
キーワード:Clostridium chauvoei;blackleg;bovine;PCR.
概要
クロストリジウム-ショーボエの存在は、症候性炭水化物の影響を受けた七頭の子牛からの肝臓、筋肉および中足骨骨髄試料の調理された肉培地培養からPCR反応によって検出された。 嫌気性条件下での筋肉試料の単離は，純粋培養中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを明らかにした。
キーワード：クロストリジウム-ショーボエイ、シモンズ-カーバンクル、ウシ、PCR。
Clostridium sppは、かなりの医学的および経済的重要性を有する嫌気性細菌のグループを構成する属の一つである。 クロストリジウム症は、この属の細菌によって引き起こされる様々な疾患に与えられた一般的な名前であり、これは、増殖中に結果的に毒素産生を伴う
Clostridium chauvoeiは、牛、羊および他の反芻動物における黒色腫および悪性浮腫の原因物質である（4）。 牛のBlacklegは非外傷性内因性感染症であり、ウシのかなりの割合は、彼らの肝臓にC.chauvoeiを抱くことができます。 影響を受けた動物は、食欲不振、うつ病、熱性、およびラメ（片側の四肢）であり、寒くなり、crepitationで浮腫性になる熱く、痛みを伴う腫脹を提示する。 死は12から48時間以内に見られます。 この薬剤は、剖検時に、暗い赤、乾燥、および海綿状である大きな筋肉（太もも、横隔膜および心臓）、のための好みを持っているようです（11）。 Blacklegに似た症状は、Clostridium septicum、C.novyi、C.perfringensまたはC.sordelliiによっても引き起こされる可能性があります。 彼らの16S rRNA遺伝子（rrs）配列上のC.chauvoeiとC.septicumの系統発生位置に関する最近の研究では、表現型レベルでも反映されているC.chauvoeiとC.septicumのrrs遺伝子間の99,3％の相
blacklegおよび悪性浮腫の事前診断は臨床的および病理学的所見に依存するが、疾患の確認は、典型的には毒素産生および免疫学的方法（9,13）などの生物を単 しかし、これらの診断方法は時間がかかり、面倒です。 さらに、C.chauvoeiおよびC.septicumにはさまざまな抗原が共通しているため、免疫学的方法はあいまいな結果をもたらす可能性があります（4）。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による細菌ゲノムの特定の標的領域の核酸増幅は、検出および診断の目的で広く使用されている（15）。 PCRの能力は、細菌の少ない数から特異的にDNAを増幅するだけでなく、その単純さ、迅速性と再現性は、同定のための従来の方法よりも利点を提供し、実際に純粋な培養物や臨床サンプル（5,7,12,14）でC.chauvoeiを含む多くのクロストリジウム種を同定するために使用されている。 したがって、blacklegの正確な診断はしばしば困難である。 標準的な診断は、免疫蛍光アッセイおよび形態学的基準に基づいている。
本稿では、c.chauvoeiを識別するためにblacklegと子牛からのサンプルの調理された肉培地中の事前濃縮からPCRベースの方法について説明します。 ブラジルの秋にブラックレッグ症状を示した子牛からの肝臓、筋肉および中足骨骨髄サンプルを分析した。 収集されたサンプルは、サンパウロ州からの群れの六つの子牛とマトグロッソドスル州からの一つの子牛からであった（表1）。 これらのウシはすべて突然死亡し，後肢に筋crepitationを示した。
肝臓および筋肉の浸軟サンプルおよび骨髄スワブを、直前に熱ショックを受けた調理肉培地（Difco®）をチューブに接種し（100℃で10分間直ちに現在の水で冷却）、37℃で48時間インキュベートした。 調理された肉培地の十マイクロリットルは、5％ヒツジの血液寒天中で培養し、嫌気性条件下で37℃で48時間インキュベートした。 特徴的な形態、側面、色および溶血を有するコロニーは、形態学的および細胞壁の決定のためのグラム染色に供された。 疑わしい分離株は、細菌の性別と種の同定のためにカタラーゼ、レシチナーゼ、ゼラチナーゼ、グルコース、乳糖と激動のミルク凝固試験に提出されました。
グアニジンチオシアン酸ベースの技術（2）は、調理された肉培地でチューブの上澄みからDNA抽出のために達成されました。 各チューブ１ｍｌを１ ３ ０ ０ ０ｘｇで２ ０分間遠心分離し、ペレットを抽出プロトコルの前に２ ０ ０μ ｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中に再懸濁した。 Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲは、ＳＡＳＡＫＩらによって記載されたｆｌａｇｅｌｉｎ遺伝子（ＦＬＩＣ）のために設計されたプライマーを用いて実施した。 (10)、Clostridium chauvoeiおよびClostridium septicumに特異的で、それぞれ535塩基対（bp）および294bpを増幅する。 前方プライマー Ｆｌａｆは両種に共通であり，ＦｌａｃｈｒとＦｌａｓｅｒはそれぞれＣ．ｃｈａｕｖｏｅｉとＣ．ｓｅｐｔｉｃｕｍの逆プライマーである。 ＤＮＡの増幅は、全容積５ ０μ Ｌ中で、各ｄＮＴＰ２ ０ ０μ Ｍ、５μ Ｌの１ ０Ｘ反応緩衝液、２，５ｍ Ｍ Ｍｇｃｌ２、各プライマー３ ０ｐｍｏｌ（Ｆｌａｆ−５’ＡＧＡＡＴＡＡＡＣＡＧＡ ＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧ３’、Ｆｌａｃｈｒ−５’ＴＡＣＴＡＧＣＡＴＣＡＡＡＴ ＧＴＡＣＣ３’、およびＦｌａｓｅ Ｒ−５’ＴＴＴＡＴＴＧＡＡＴＴＧＴＧＴＴＴＧＴＧＡＡＧ３’）、１，２ ５Ｕ Ｔａｑポリメラーゼおよ10Μ lのdna。 増幅のために、我々は次のように三つの相に分割された三十サイクルを使用しました：94º Cで60秒間変性、56º Cで60秒間ハイブリダイゼーションと72º Cで60 C.chauvoei IB1559およびc.septicum10518(Instituto Biológico株)をPCR陽性対照として使用し、正常牛由来の筋肉試料をPCR陰性対照として使用した。
PCRは、上記で引用したのと同じDNA抽出および増幅プロトコルを使用して、臨床サンプル（肝臓、筋肉および骨髄）から直接適用されました。 増幅はペルチェ熱Cycler-100（MJ研究）で行われ、増幅された生成物の分析は、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル1.3％中の電気泳動によって行われた。
疑わしいサンプルを接種した調理された肉培地のグラム染色は、ほとんどのサンプル（肝臓1、筋肉1,2および7および骨marrows3,4および5）で、他のものを しかし、筋肉7サンプルでのみ純粋な培養でClostridium perfringensを単離し、嫌気性条件下でインキュベートした他のサンプルプレートでは成長は観察されなかった。 臨床試料からの多重ＰＣＲは，Ｃ．ｃｈａｕｖｏｅｉまたはｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍに対しても陽性ではなかった。 しかし、同じサンプルを接種した調理された肉培地の上清からの反応では、それらのうちの七つはC.chauvoeiに陽性であり、C.septicum（肝臓1、筋肉1,2および7、骨marrows3,4および5）に陰性であった（表1に見られるように）。
C.chauvoeiとC.septicumの間の密接な系統発生関係は、これらの生物の表現型の類似性の分子反射である。 C.chauvoeiはc.septicumと区別することが比較的困難であり、また、C.septicumはblackleg症状と非常によく似た症状を引き起こす可能性があります（6,9）。
(3)高用量のペニシリンを用いたblacklegによるウシの発生および治療を報告した。 診断は、筋壊死領域の綿棒からC.chauvoeiを単離し、その同定のためのモルモット接種によって達成された。
KUHNERT et al. (7)C.chauvoeiとC.septicumを区別するためのシステムを報告したが、両細菌の16S rRNA遺伝子の差が小さいため、生物の決定的な同定のためにPCR産物の酵素消化の制限
我々の結果は、fliC遺伝子（10）に基づくマルチプレックスPCR反応は、DNA抽出のためのグアニジンチオシアネートを達成調理された肉培地で培養された自然に感染した試料からC.chauvoeiを同定し、C.septicumからこの種を区別するために効率的であったことを示している。 しかし、組織サンプルからの直接PCR結果は、おそらくクロストリジウム微生物の数が少ない、または非効率的なDNA抽出プロトコルのために、陰性であった。
C.chauvoeiの単離は難しい嫌気性条件を必要とするため非常に困難であり、臨床標本は土壌中のclostridiaを含む他の嫌気性細菌で汚染されていることが多く、培地中のC.chauvoeiよりも速く成長する(9)。 筋肉7の微生物学的培養は、嫌気性条件下で純粋な培養で単離されたClostridium perfringensを明らかにした。 本種はブラックレッグの症例にも関与しており，本研究ではＣ．ｃｈａｕｖｏｅｉと関連している可能性がある。 とにかく、この場合に微生物学的方法のみが適用されていた場合、blackleg診断は間違っているか不完全であろう。 クロストリジウムワクチンは、クロストリジウム疾患に対する高度の免疫を提供し、診断が正しい場合には、疾患を容易に制御することができる。 このためには、臨床サンプルを適切に収集し、検査室検査を受ける必要があります。 予防接種によってクロストリジウム症によるすべての病気を予防することができれば、予防接種にもかかわらず問題が続く場合、診断は間違っていな また、労働分析（1）を行うためには、ケース記述が基本的に重要である。
クロストリジウム属微生物による感染は、一旦治療が一般的に実行不可能になると、生産においてかなりの損失を引き起こす。 動物が薬剤および病気をunchainできる要因と永久的に接触しているので制御および防止は群の処理そしてsistematicワクチン接種の十分な手段を構成しなけ
調理された肉培地中の自然感染サンプルの事前濃縮からC.chauvoeiの核酸の検出は、通常、微生物学的培養の制限のために決定的ではないblacklegのこれら二つのブラジルアウトブレイクにおける診断を明らかにした。 さらに，ＰＣＲ法の特異性が高いため，モルモットの薬剤同定のための雇用は回避された。
1. バルダッシ,L.(2005). クロストリジウム毒素強力な毒、強力な薬。 J.ヴェノム アニム トックス トロップ Dis。, 11(4), 391-411.
2. Boom,R.;Sol,C.J.A.;Salimans,M.M.M.;Jansen,C.L.;Werthein-Van-Dilen,P.M.E.;Noordaa Van Der J.(1990). 核酸の精製のための迅速かつ簡単な方法。 J.Clin. ミクロブ…, 28, 495-503.
3. グレゴリー,L.;Della Libera,A.M.M.;Birgel Junior,E.H.;Pogliani,F.C.;Birgel,D.B.;Benesi,F.J.; Miyashiro,S.;Baldassi,L.(2006). 症状のある炭水化物：”manqueira”の影響を受けたウシの回復の発生、臨床的進化およびフォローアップ。 アルク インスト バイオル, 73(2), 243-246.
4. 1994年、浜岡T.;寺門N.(1994)。 間接免疫蛍光アッセイによるClostridium chauvoeiおよびClostridium septicumの細胞表面上の共通抗原の実証。 J.Vet. メッド サイ…, 56, 371-373.
5. (2001).小島A.;上田I.;関明T.;佐々木Y.;荻窪Y.;田村Y.(2001). フラジェリン遺伝子配列に基づくPCRによるClostridium chauvoeiの迅速な検出と同定。 獣医さん ミクロブ…, 78, 363-371.
6. (1996年)。 16S rRNA遺伝子配列に基づくClostridium chauvoeiおよびClostridium septicumの系統発生位置。 Int. J.シスト バクト, 46(4), 1174-1176.
7. Kuhnert,P.;Krampe,M.;Capaul,S.E.;Frey,J.;Nicolet,J.(1997). PCRを用いたblacklegからの培養物および臨床材料中のClostridium chauvoeiの同定。 獣医さん ミクロブ…, 51, 291-298.
8. Moussa,J.(1959). Clostridium septicumおよびClostridium chauvoeiのための抗原の方式。J.パス。 バク, 7, 341-350.
9. (2002)佐々木洋;小島A.;青木宏;荻窪Y.;滝川N.;田村Y.(2002). フラジェリン遺伝子に基づくClostridium chauvoei、Clostridium haemolyticum、Clostridium novyiタイプAおよびB、およびClostridium septicumの系統発生分析およびPCR検出。 獣医さん ミクロブ…, 86, 257-267.
10. (2000).佐々木Y.;山本K.;小島A.;則松M.;田村Y.(2000). 16S-23S rDNAスペーサー領域に基づくポリメラーゼ連鎖反応によるガス壊疽における病原性クロストリジウムの迅速な同定と分化。 レゾナント-ヴェット サイ…, 69, 289-294.
11. シッペル,W.L.(1982). クロストリジウム疾患の診断。 J.Am. 獣医さん メッド アソック, 161, 1299-1305.
12. Uzal,F.A.;Plumb,J.J.;Blackall,L.L.;Kelly,W.R.(1997). PCRによるヤギのfaeceの異なった毒素を作り出すClostridiumのperfringensの検出。 レット アプリ。 ミクロブ…, 25, 339-344.
13. Vanelli,S.A.;Uzal,F.A.(1996). ヒツジのホルマリン固定パラフィン包埋組織におけるペルオキシダーゼ-アンチペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）法によるｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ敗血症の検出。 アーチ メッド 獣医さん, 28, 125-127.
14. Warren,A.L.;Uzal,F.L.;Blackall,L.L.;Kelly,W.R.(1998). ヤギおよびヒツジのホルマリン固定、パラフィン包埋組織におけるClostridium perfringensタイプDのPCR検出。 レット アプリ。 ミクロブ…, 29, 15-19.
15. （1996年）。 臨床微生物学の実験室における核酸の拡大そして検出の役割。 アン マイクロブ牧師, 50, 349-373.