結果と議論
DNA損傷シグナリング（32、33）の研究中に、我々はChk1イムノブロットにおける二つの顕著なバンドを観察した：Chk1バンド56kDaと43kDaの高速移行バンド。 より速い移動バンドは、内部キナーゼドメインまたはC末端配列に反応性であったChk1抗体によって検出されたが、N末端を認識するChk1抗体によっ 1A）。 このバンドは、Chk1のイムノブロット分析に一般的に使用されているSanta Cruz BiotechnologyからのG4モノクローナル抗体によって認識されなかった（24、29）。 ＳｉＲＮＡを介したＣｈｋ１のノックダウンは、Ｃｈｋ１および４ ３−ｋＤａバンドの両方の消失をもたらし、それらの関連性をさらに確認した（図１ ０Ａ）。 1B）。 43-kDaタンパク質は、プロテアソームおよびプロテアーゼ阻害剤によって影響されなかった（SI付録、図。 1)、それはChk1の代替スプライスバリアントである可能性を高めます。 National Center for Biotechnology Information databaseは現在、異なる非翻訳領域を有するが、476アミノ酸（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111）の同じ全長Chk1タンパク質をコードする3つの代替スプライシングされたヒトChk1mRNAをリストしている。 しかし、ESTベースの代替スプライシング予測データベース（http://genome.ewha.ac.kr/ECgene）を使用して我々の分析は、エクソン3が代わりにスプライスまたは削除されているChk1のユニークなスプライスバリアントの可能性を示唆した。 この可能性を直接試験するために、本発明者らは、Ｃｈｋ１コード配列内のプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した（図１）。 1C）。 プレマーセットP1を用いたRT-PCRは、予想されるサイズの単一のアンプリコンを生成し、P2またはP3プライマーセットを用いたRT-PCR（両方ともエクソン3に隣接する配列に基づく）は、Chk1の予想されるサイズと他の≤200bp短い二つのアンプリコンを生成した（図。 1C）。 配列決定により、より長いアンプリコンが実際にChk1であり、特に、より短いアンプリコンがエクソン3を欠くChk1の代替スプライス変異体であることが確認された(図3)。 1DおよびSI付録、図。 2A）。 このスプライス変異体は、我々がChk1-shortまたはChk1-Sと命名した382個のアミノ酸からなるChk1のN末端切断型に翻訳されると予測された（図10B）。 1DおよびSI付録、図。 2). ゲル電気泳動では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたＣｈｋ１−Ｓは、ＨＥＫ２ ９ ３細胞からの４ ３−ｋＤａタンパク質と同様に遊走した（図１ ０Ａ）。 1E）。 我々はさらに、質量分析のためのHEK293細胞溶解物から43-kDaタンパク質を免疫沈降させ、Chk1-Sとしてのアイデンティティを確認した。 Chk1-SにおけるN末端切断は、Chk1のN末端配列に反応する抗体によって認識されなかったことを示すイムノブロットの結果と一致している（図。 1A）。 リアルタイムおよびＲＴ−ＰＣＲ分析により、複数のヒト組織においてＣｈｋ１−Ｓ ｍＲＮＡ発現が検出され、その発現は、一般に胎児組織においてより高い（ＳＩ付録、図１ ０Ａ）。 3AおよびD)。 免疫ブロット解析により、ヒト、マウス、およびラット細胞株およびヒト胎児組織においても、Ｃｈｋ１−Ｓタンパク質発現が検出された（ＳＩ付録、図１ ４Ａ、図１ ４Ｂ）。 3B)およびマウス一次尿細管細胞(SI付録できます。 3C）。 Chk1-Sの全長cDNAはまた、三つの正常なヒト組織（胸腺、結腸、胎児肝臓）からクローニングされ、それがChk1のN末端切断スプライス変異体をコードすることを確 一緒に、これらの実験は、n末端切断され、広く哺乳動物の細胞および組織で発現されているChk1のユニークなスプライス変異体を同定しました。
Chk1のユニークな、N末端切断スプライス変異体としてChk1-Sの同定。 (A)HEK293細胞溶解物を、Chk1のN末端(α-Chk1-NT)、キナーゼドメイン(α-Chk1-KD)、またはC末端(α-Chk1-CT)を特異的に認識する抗体を用いたイムノブロッティングにより分析した。 Chk1に加えて、43-kDaタンパク質は、α-Chk1-KDおよびα-Chk1-CTによって明らかにされたが、α-Chk1-NTは明らかにされなかった。 (B)HEK293細胞をChk1siRNA(SICHK1)またはスクランブル配列(siCon)で48時間トランスフェクトし、α-Chk1-KDを用いた免疫ブロット分析のための全細胞溶解物を収集した。 sichk1はChk1と43kDaタンパク質の両方の発現を減少させた。 （Ｃ）Ｃｈｋ１に対するプライマーの３つの異なるセット：Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３を使用して、ＲＴ−ＰＣＲのためにＨＥＫ２ ９ ３細胞からＲＮＡを単離した（相対配列位置を図に示す）。 二つのアンプリコンは、エクソン3（P2とP3）に隣接するプライマーセットを使用してRT-PCRによって検出されたが、唯一のアンプリコンは、フォワードプライマーがChk1のエクソン3内にあったプライマーセットP1を使用して増幅された。 （Ｄ）Ｎ−末端切断タンパク質、Ｃｈｋ１−Ｓを生じるＣｈｋ１の代替スプライシングの模式図。 （Ｅ）Ｃｈｋ１−Ｓをｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のためにクローニングし、翻訳されたタンパク質をｈｅｋ２ ９ ３細胞溶解物と共にｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ分析によって分析した。 In vitroで翻訳されたChk1は、HEK293細胞における43-kDaバンドと同様に移行した。
Chk1-Sの機能は何ですか？ それはChk1のような細胞周期のチェックポイントを調整しますか？ これらの質問で、我々は最初の細胞周期におけるChk1-Sの時間的および空間的発現パターンを決定しました。 HEK293細胞は、それぞれ、血清飢餓、二重チミジンブロック、またはノコダゾールによってG1、G1/S、またはG2/M相で同期した。 Ｃｈｋ１−Ｓは、Ｇ１期細胞では低く、Ｇ１／ＳおよびＧ２／Ｍ細胞では高かった（ＳＩ付録、図１ ０Ａ）。 4AおよびB)。 さらに、細胞を二重チミジンブロックによってG1/S期に同期させ、その後放出した場合、Chk1およびChk1-Sの両方の発現はS期に入った後に増加した（図 2A）。 Chk1とChk1-S発現の間の明確な違いは、Chk1発現が中間S相でピークに達したのに対し、Chk1-S発現はS相からM相に増加し続けたことであった（図10A）。 2A）。 興味深いことに、高レベルのＣｈｋ１−Ｓ発現が、二重チミジンブロックからの細胞周期放出後７時間で観察された（細胞がまだ有糸分裂していない時点）（Ｓｉ付録、 4C）。 本発明者らは、非同期およびＳまたはＧ２／Ｍ同期細胞におけるＣｈｋ１−Ｓ：Ｃｈｋ１比をさらに定量した。 ＨＥＫ２ ９ ３、Ｕ２ＯＳ、および原発性尿細管細胞におけるＣｈｋ１−Ｓ発現の変動にもかかわらず、Ｃｈｋ１−Ｓ：Ｃｈｋ１比は、Ｇ２／Ｍ期の全ての細胞において１を上回っていた（Ｓｉ付録、 5). 非同期細胞では、Chk1-SおよびChk1は主に核に局在していた（SI付録、図。 6A）。 しかし、G2/M期細胞では、いくつかのChk1-SおよびChk1が中心体に蓄積した（SI付録、Fig. 6BおよびC)。 中心体におけるChk1の局在は、Cdk1と有糸分裂エントリ（の早期活性化を防ぐそのG2/Mチェックポイント機能のために重要である34、35）。 我々の結果は、Chk1-Sはまた、有糸分裂エントリを開始するChk1の空間的および時間的調節を提供し、中心体に局在することができることを示している。 次に、ＨＥＫ２ ９ ３およびＵ２ＯＳ細胞におけるＣｈｋ１またはＣｈｋ１−Ｓ過剰発現の効果を決定した。 GFP-Chk1と比較して、GFP-Chk1-Sは、核縮合および小核および複数または多核の核の形成によって特徴付けられた顕著な核表現型を誘導した（図10A）。 2B）。 初期の時点で、トランスフェクトされた細胞は、かすかで点状のヒストン-H3リン酸化によってマークされた核/クロマチン凝縮を示した（図。 2B)、早発性有糸分裂の侵入を示す。 その後、これらの細胞は、有糸分裂の破局の特徴である小核または多核核を発達させた（図10）。 2B）。 細胞計数は、ＧＦＰ−Ｃｈｋ１−Ｓが、Ｕ２ＯＳ細胞の≧２ ０％において核表現型を誘導したことを示した（図１ ０Ａ）。 2C）。 同様の効果が、ＹＦＰ−Ｃｈｋ１−ＳおよびＣｈｋ１−Ｓ−Ｍｙｃによって示された（図１）。 これは、観察された核表現型が、融合タンパク質タグによってではなく、Ｃｈｋ１−Ｓによって誘導されたことを示す図２Ｃを参照されたい。 対照的に、時期尚早の有糸分裂進入は、Ｃｈｋ１またはそのキナーゼ死んだ変異体Ｃｈｋ１−ＫＤによって誘導されなかった（図１ ０Ｂ）。 2C）。 また、ｃｈｋ１−Ｓは、他の細胞型において顕著な核表現型を誘導した（ＳＩ付録、図１ ０Ａ）。 7). 特に、Chk1対立遺伝子の一方または両方を欠く細胞およびマウスモデルにおいて、同様の核表現型が報告され（7、36、37）、Chk1-SがChk1の内因性阻害剤とし さらにこの可能性をテストするために、我々は、Chk1、Chk1-KD、またはChk1-Sを発現するように誘導することができるTet-on U2OS細胞株を生成した。 Ｃｈｋ１−Ｓ発現細胞の約８ ０％が有糸分裂に入り、一方、Ｃｈｋ１−またはＣｈｋ１−ＫＤ発現細胞の≧６ ０％が有糸分裂に入った（図１ ０Ａ）。 2D）。 重要なことに、Ｃｈｋ１−およびＣｈｋ１−ＫＤ発現群の大部分の有糸分裂細胞は４ｎ ＤＮＡを有していたのに対し、ＣＨＫ１−Ｓ発現群の有糸分裂細胞の≧２ ５％は４ｎ ＤＮＡ含量 DNA複製の完了なしに、これらの細胞における異常な有糸分裂のエントリを示す図2D）。 加えて、Ｃｈｋ１−Ｓの過剰発現は、ＰＨ３陽性細胞の出現によって示されるように、有糸分裂への早期の侵入をもたらした（ＳＩ付録、図１ ０Ａ）。 8). Chk1は、細胞周期における有糸分裂エントリまたはS-G2/M遷移の重要な調節因子である。 CDC25A（その分解を誘導する）とWee1をリン酸化することにより、Chk1はCDK1活性化と有糸分裂エントリ（5、15-20）を防止します。 本発明者らは、Ｔｅｔ−ｏｎ Ｕ２ＯＳ細胞におけるドキシサイクリンによるＣｈｋ１−Ｓの誘導が、より高いレベルのＣＤＣ２ ５Ａおよびより低いレベルのホスホ−ＣＤＫ１を生じ 2E）。 RNAiを介したChk1-Sの特異的ノックダウンは、Chk1-S配列がChk1mRNAに含まれているため、成功しなかった。 しかし、Ｃｈｋ１−Ｓにおける独特のｅｘｏｎ２−ｅｘｏｎ４接合に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｃｈｋ１−Ｓ発現を特異的に減少させることができる（ＳＩ付録、 9A）。 Chk1-Sダウンレギュレーションは、細胞増殖を著しく減少させた（SI付録、図。 9B）。 興味深いことに、Ｃｈｋ１−Ｓ下方調節は、細胞周期プロファイルを有意に変化させなかった（ＳＩ付録、図１ ０Ａ）。 9C）。 Ｃｈｋ１は、いくつかの細胞周期チェックポイント（例えば、Ｇ２／Ｍ、紡錘体、Ｓ内）で機能するので、Ｃｈｋ１−Ｓは、複数の部位での細胞周期進行を促進するためにＣｈｋ１ その結果、Chk1-Sの阻害は、様々な段階で細胞周期を遅くし、細胞周期分布の大きな変化なしに増殖の抑制をもたらす可能性がある。
Chk1-Sによる細胞周期の調節。 （Ａ）ＨＥＫ２ ９ ３細胞を、二重チミジンブロックによって同期させ、次いで、ノコダゾール含有培地中に放出した。 （左）ヨウ化プロピジウム（PI）染色およびFACS分析によって分析された細胞周期プロファイル。 （右）チミジンブロックからの放出後に示された時点で収集された細胞溶解物中のChk1およびChk1-Sのイムノブロット分析。 非同期細胞（Ｂ）Ｕ２ＯＳ細胞をＧＦＰ−Ｃｈｋ１またはＧＦＰ−Ｃｈｋ１−Ｓ（緑色）でトランスフェクトした後、ホスホヒストンＨ３の免疫蛍光（赤色）およびＨｏｅｃｈｓｔ３ ３ ３ ４ ２（青色）による核染色のた （上）Chk1-Sではなく、Chk1は、早期クロマチン凝縮と弱いph3染色（矢印）を誘導した。 （下）後期段階では、Chk1-Sトランスフェクト細胞は、小核と多葉核（矢印）を含む有糸分裂カタストロフィーの特性を示した。 (C)U2OS細胞に指示された遺伝子をトランスフェクトし、早期クロマチン凝縮および有糸分裂カタストロフィーの核表現型を有する細胞を計数した。 データは平均±ＳＤを示す；＊ｐ＜４ １ ３ ０＞０． 結果は、Chk1-Sの過剰発現は、特に核表現型につながったことを示しています。 次いで、細胞をｐＨ３免疫蛍光およびＰＩ染色のために固定し、ＦＡＣＳによって分析した。（ｄ）ｕ２ＯＳ細胞を、示された遺伝子でトランスフェクトし、二重チミジンブロッ データは平均±ＳＤを示す；＊ｐ＜４ １ ３ ０＞０． 結果は、Chk1-SがDNA複製の完了なしに時期尚早の有糸分裂の進入を特異的に誘導したことを示している（<4n DNAを有する細胞）。 (E)Tet-ON U2OS細胞は、ドキシサイクリンの有無にかかわらず誘導された。 その後、細胞を二重チミジンブロックによってS期に同期させ、7時間放出した。 全細胞溶解物は、示されたタンパク質の免疫ブロット分析のために収集された。 結果は、誘導されたChk1-S発現は、早期有糸分裂エントリに貢献し、CDC25Aの増加とホスホCDK1の減少につながったことを示しています。
Chk1-Sはどのようにchk1に拮抗するのですか？ 我々は、Chk1-Sは、そのキナーゼ活性をブロックするためにChk1と相互作用する可能性があることを仮定した。 一貫して、ＨＥＫ２ ９ ３細胞で発現されたＦＬＡＧ−Ｃｈｋ１−Ｓは、内因性Ｃｈｋ１と共免疫沈降した（図１ ０Ｂ）。 3A）。 さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳されたＭｙｃ−Ｃｈｋ１およびＣｈｋ１−Ｓは共免疫沈降した（図１ ４Ａ）。 直接のＣｈｋ１−Ｃｈｋ１−Ｓ相互作用を示唆する。 本発明者らはさらに、Chk1-SのN末端ドメインではなく、C末端ドメインとのChk1の共免疫沈降を実証した（図10B）。 図３Ｃ）から、Ｃｈｋ１との相互作用のためのＣｈｋ１−ＳにおけるＮ末端配列の必要性を示唆している。 機能的には、我々はChk1キナーゼ活性に対するChk1-Sの効果を決定した。 Chk1-Mycを発現させ、精製Chk1-Sの非存在下または存在下でin vitroキナーゼアッセイのために免疫沈降させた。 3D、Chk1キナーゼ活性は、部分的にまだ有意にChk1-Sによって抑制されたが、熱変性Chk1-Sによってではなかった対照的に、Chk1-SはChk1と同様の基質選 Chk1と比較して、Chk1-SはATP結合部位を含むキナーゼドメインの一部を欠いている（図。 図１Ｄ）および予想されるように、有意なプロテインキナーゼ活性を示さなかった（図１Ｄ）。 3D）。 また、ｃｈｋ１−Ｓは、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにおいて、Ｎ−末端タグ化Ｃｈｋ１（ＦＬＡＧ−Ｃｈｋ１）のキナーゼ活性を抑制することができる（ＳＩ付録、図１ ０Ａ）。 10). これらの結果は、Chk1-Sは分子相互作用を介してChk1を阻害する可能性があることを示唆している。 最近の研究では、より厳格なラジオ免疫沈殿アッセイ（RIPA）バッファーとChk1免疫沈降物の洗浄が著しくChk1は、通常、因子（抑制によって阻害されることを示唆し、Chk1キナーゼ活性を増加させることができることを示した29）;しかし、抑制因子の同一性は不明である。 本発明者らは、ＲＩＰＡ緩衝液洗浄の効果を確認し、特に、本発明者らは、外因性のＣｈｋ１−Ｓの添加が、Ｃｈｋ１キナーゼ活性に対するＲＩＰＡ緩衝液洗浄の効果を逆転させ このことは、Ｃｈｋ１−Ｓが、Ｃｈｋ１のための重要な内因性抑制因子の１つであり得ることを示唆している。
Chk1-SはChk1と相互作用してキナーゼ活性を抑制する。 （Ａ）ＨＥＫ２ ９ ３細胞をＦＬＡＧ−Ｃｈｋ１−Ｓまたは空ベクターでトランスフェクトし、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して免疫沈降（ＩＰ）のための溶解物を収集した。 免疫沈降物は、それぞれ、抗FLAGおよび抗N末端Chk1抗体を用いた免疫ブロッティングによってChk1およびFLAG-Chk1-Sのために分析した。 結果は、ＦＬＡＧ−Ｃｈｋ１−Ｓと内因性Ｃｈｋ１との共ＩＰを示す。 （Ｂ）Ｔｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、Ｃｈｋ１−ＭｙｃおよびＣｈｋ１−Ｓを作製した。 （左）インビトロでは、免疫ブロッティングによって示されるChk1-MycおよびChk1-Sを産生した。 （右）Chk1-Mycは、Chk1-Sの有無にかかわらずインキュベーションした後、抗Myc抗体を用いて免疫沈降した。 結果は、Chk1とChk1-Sとの間の直接の相互作用を示している（C）HEK293細胞は、抗Myc抗体を用いて免疫沈降のためのライセートを収集するためにMycタグChk1-Sま 免疫沈降物は、Chk1の存在を調べた。 結果は、Chk1-SとそのC末端欠失変異体ではなく、そのN末端欠失変異体とChk1のcoimmunoprecipitationを示しています。 （Ｄ）ＨＥＫ２ ９ ３細胞にＭｙｃタグ付きＣｈｋ１−Ｓ、Ｃｈｋ１、またはＣｈｋ２をトランスフェクトして、抗Ｍｙｃ抗体を使用して免疫沈降のための溶解物を収集した。 Chk1-S-Myc、Chk1-Myc、またはChk2-Mycを含む免疫沈降物を、Chk1-Sの有無にかかわらず1時間インキュベートし、Chktideを基質として使用するキナーゼ活性アッセイに加 変性したChk1-Sを沸騰させることにより調製した。 データは、平均±ＳＤを示す；＊Ｐ＜４ １ ３ ０＞０． 結果は、ネイティブChk1-SはChk1を特異的に阻害することができることを示しています。 （Ｅ）ＨＥＫ２ ９ ３細胞に、Ｃｈｋ１−ＭｙｃまたはＣｈｋ１−Ｍｙｃ（Ｓ３ １ ７Ａ／Ｓ３ ４ ５Ａ）変異体をトランスフェクトした。 次いで、細胞を未処理または１ ０ ０ｎＭカンプトテシンで２時間処理して、抗Ｍｙｃ抗体による免疫沈降のための溶解物を収集した。 免疫沈降物は、免疫ブロッティングによってMyc-Chk1、リン酸化（セリン345）Chk1、およびChk1-Sのために分析した。 Chk1入力もサンプルで検証されました。 結果は、Chk1-S coimmunoprecipitatedまたは正常細胞におけるChk1に関連付けられており、関連がカンプトテシン誘導DNA損傷中に減少したことを示しています。 しかし、Chk1-SとChk1（S345A/S317A）変異体との間の関連付けは、S345とS317でChk1のリン酸化がChk1からChk1-Sの解離に必要とされ得ることを示唆し、DNA損傷 （Ｆ）ＨＥＫ２ ９ ３細胞を、Ｃｈｋ１−Ｍｙｃ＋空ベクターまたはＣｈｋ１−Ｍｙｃ＋ｄｎ−ＡＴＲのいずれかで共感染させ、続いて１ ０ ０ｎＭのカンプトテシンで２時間処理した。 細胞溶解物を、抗Ｍｙｃ抗体による免疫沈降のために収集し、続いて、示されたタンパク質の免疫ブロット分析を行った。 結果は、Chk1-Chk1–S解離のカンプトテシン誘導破壊ATRとChk1リン酸化に依存することを示しています。
DNA損傷応答（DDR）では、Chk1が著しくS345とS317残基でリン酸化を介して活性化されます(7, 13, 38, 39). S345/S317リン酸化の重要性の認識にもかかわらず、それはこのリン酸化がChk1（28-30）を活性化する方法は不明のままです。 本発明者らは、Ｃｈｋ１−Ｓ発現がＤＤＲにおいて有意に変化しなかったことを示した（ＳＩ付録、図１ ０Ａ）。 12). しかし、Ｃｈｋ１−Ｃｈｋ１−Ｓ相互作用は、ＤＮＡトポイソメラーゼｉ阻害剤およびＤＮＡ損傷剤であるカンプトテシンによって誘導されるＤＤＲにおいて弱毒化された（図１）。 3E）。 特に、ｃｈｋ１（Ｓ３ ４ ５Ａ／Ｓ３ １ ７Ａ）変異体がカンプトテシン処理中にＣｈｋ１−Ｓから解離しなかったので、ＤＤＲにおけるＣｈｋ１−Ｓからのｃｈｋ１の解離は、Ｓ３ ４ ５／Ｓ３ １ ７でのＣｈｋ１リン 3E）。 DDRでは、Chk1の活性化は、ATRを介したリン酸化（に依存する7、13、14）。 本発明者らは、ドミナントネガティブ変異体（dn-ATR）を介したATRの阻害は、カンプトテシン誘導Chk1-Sリン酸化を抑制するだけでなく、Chk1-Chk1-S解離を防 3階）。 同様に、Ｃｈｋ１は、シスプラチン誘発ＤＤＲ中にＣｈｋ１−Ｓから解離し、解離は、ｄｎ−ＡＴＲによって防止された（ＳＩ付録、図１ ０Ａ）。 13). 一緒に、結果は、Chk1のリン酸化は、DDRにおけるChk1活性化につながる、内因性阻害剤Chk1-Sとの相互作用を破壊することができることを示唆している。
Chk1-Sが細胞周期の進行と細胞増殖のユニークな調節因子として同定されたことにより、癌組織におけるChk1-Sの発現を調べることができました。 ＭＲＮＡレベルでは、ほとんどの癌組織は、正常組織よりも高いレベルのＣｈｋ１およびＣｈｋ１−Ｓを発現した（ＳＩ付録、図１ ０Ａ）。 14). 興味深いことに、精巣癌は、Ｃｈｋ１−Ｓの顕著な上方調節を示したが、Ｃｈｋ１は示さなかった（図１）。 4A）。 精巣癌組織、特に後期癌試料中の免疫ブロット分析により、Ｃｈｋ１−Ｓの特異的な上方調節がさらに確認された（図１ ０Ａ）。 4B）。 以前に報告されたように（5）、正常および悪性精巣組織の両方がChk1発現の高レベルを有していた。 卵巣癌の進行中に、Ｃｈｋ１−Ｓの発現の増加も検出された（図１ ０Ａ）。 4B）。 両方の胎児におけるChk1およびChk1-S発現の比較的高いレベル（SI付録、図。 および癌（図３）および癌（図３）。 4)組織は、Chk1-Sは、これらの条件下で細胞増殖を促進し、細胞周期の進行を加速することができることを示唆しています。
癌におけるChk1-S調節。 （Ａ）正常な精巣組織および精巣癌サンプルにおけるＣｈｋ１およびＣｈｋ１−Ｓ ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ分析、精巣癌におけるＣｈｋ１−Ｓのアップレギュレーションを示 （Ｂ）ヒト正常精巣および精巣癌組織におけるＣｈｋ１およびＣｈｋ１−Ｓの免疫ブロット解析により、後期癌組織におけるＣｈｋ１−Ｓ発現の増加が示された。 （Ｃ）ヌードマウスに、それぞれ、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ１−ＫＤ、またはＣｈｋ１−Ｓを発現するためにドキシサイクリン誘導性であったＭＤＡ−ＭＢ−２ ３ １細胞に１ ０×１ ０ ６Ｔｅｔ−を注射した。 腫瘍を≧100mm3に確立した後、マウスをドキシサイクリンの有無にかかわらず飲料水に維持した。 腫瘍体積を毎週測定した（第４週値について示され、ｎ＝８）。 データは平均±SDを示す。 結果は、Ｃｈｋ１−Ｓの誘導された発現が、Ｃｈｋ１またはＣｈｋ−ＫＤではなく、腫瘍増殖を阻害したことを示している。 （Ｄ）切除された腫瘍におけるドキシサイクリン誘発性Ｃｈｋ１−Ｍｙｃ、Ｃｈｋ１−ＫＤ−Ｍｙｃ、およびＣｈｋ１−Ｓ−Ｍｙｃ発現のｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔの濃度測定結果（各群についてｎ＝３）。 信号を、Ｃｈｋ１−Ｍｙｃ（任意に１ ０ ０として設定）で正規化した。 データは平均±SDを示す。 結果は、ドキシサイクリンが腫瘍においてChk1-Myc、Chk1-KD-Myc、およびChk1-S-Mycの同様のレベルの発現を誘導したことを示している。 （Ｅ）ヌードマウスにＣｈｋ１−ｓ誘導性細胞を注入して腫瘍を樹立し、次いでドキシサイクリンの有無にかかわらず飲料水に４週間維持した。 腫瘍組織を免疫ブロット分析のために収集した。 結果は、ドキシサイクリン誘導Chk1-S発現と腫瘍異種移植片における高いCDC25A発現を示しています。
我々はさらに、マウスにおける異種移植腫瘍増殖に対する異所性Chk1-S発現の効果を検討した。 腫瘍異種移植片は、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ１−Ｓ、またはＣｈｋ１−ＫＤを発現するためにドキシサイクリンによって誘導され得るｔｅｔ−ｏｎ ＭＤＡ−ＭＢ−２ ３ １乳癌細胞株を使用してヌードマ ドキシサイクリンによるＣｈｋ１またはＣｈｋ１−ＫＤの誘導は、腫瘍増殖に影響を及ぼさなかった；しかし、Ｃｈｋ１−Ｓの誘導は、腫瘍体積の４ ０％の減少をもたらした（図 4C）。 Ｃｈｋ１−Ｓ誘導腫瘍組織はまた、ＣＤＣ２ ５ａ蓄積を示し、Ｃｈｋ１の阻害を示した（図１ ０Ａ）。 4E）。 結果はユニークな抗癌戦略を意味するかもしれないが、異所性Chk1-Sの強制的な過剰発現の生理学的関連性は不明のままである。 しかし、これらの結果は、Ｃｈｋ１−Ｃｈｋ１−Ｓバランスを傾けることが、有糸分裂の破局および細胞増殖の減少につながる可能性があるという原理の証明を提
Chk1-S過剰発現が異種移植腫瘍の増殖を減少させたという観察（図。 ヒト患者からの腫瘍試料が細胞増殖のために比較的高いレベルのＣｈｋ１−Ｓを発現したという観察と矛盾しているように見えた（図４Ｃ−Ｅ）（図４Ｃ−Ｅ）。 図4AおよびBおよびSI付録、図。 14). これらのデータを調整するには、実験条件の違いを認識することが重要です。 ヒト腫瘍における比較的高いＣｈｋ１−Ｓ発現は、これらの組織における増殖性細胞の存在に起因する可能性がある。 一貫して、Ｃｈｋ１−Ｓは、高度に増殖性である胎児組織においても高い（ＳＩ付録、図１ ０Ａ）。 3A）。 重要なことに、これらの増殖性組織におけるＣｈｋ１−Ｓ発現は、後期Ｓ〜Ｍ期に一時的に制限される（図１ ０Ａ）。 図2およびSI付録、図。 4). この時間的調節は、細胞周期のＧ２／Ｍ期への進行のために、Ｓ期におけるＤＮＡ複製の完了後（および後にのみ）、Ｃｈｋ１活性が阻害されることを確実にし得る。 しかし、異所性Chk1-Sが培養細胞または異種移植腫瘍で過剰発現することを余儀なくされると、Chk1-S発現の時間的制限が破壊され、言い換えれば、Chk1-Sはs期を含む細胞周期全体にわたって高く、chk-1の一定の遮断および早期有糸分裂エントリをもたらし、有糸分裂の破局および細胞増殖の減少をもたらす。
結論として、本研究は、正常な細胞周期およびDDR中のChk1の重要な調節因子であるChk1、Chk1-Sのスプライス変異体を同定した（SI付録、図。 15). 摂動されていない細胞周期では、Chk1発現はS期で増加し、いくつかのChk1分子は、DNA複製が完了するまで、高いChk1活性とS期の維持で、その結果、Chk1-S結合を防止するATRによってリン酸化される可能性がある。 G2期では、chk1-S発現が増加し、報告されているように（29）、Chk1リン酸化が減少し、Chk1–Chk1-S相互作用を促進してChk1活性を抑制する。 G2/M期におけるChk1活性の減少は、有糸分裂のエントリに重要です。 Chk1-S誘導または過剰発現の条件下では、Chk1-Sの過剰量はChk1を隔離し、有糸分裂の大惨事につながる、DNA複製の完了せずに早期有糸分裂のエントリで、その結果、S期の間にそのキナーゼ活性を減少させます。 ＤＮＡ損傷の間、Ｃｈｋ１はリン酸化され、その結果、Ｃｈｋ１−Ｓ結合の減少、Ｃｈｋ１活性の増加、およびＧ２／Ｍ停止が生じる（ＳＩ付録、図１ ０Ａ）。 11). 我々の調査結果は、Chk1活性化（29）の”脱抑制”メカニズムをサポートしています。 重要なことに、Chk1-SはChk1活性の重要な抑制因子の一つであると思われる。 Chk1に拮抗することにより、Chk1-Sは、胎児および癌性組織における増殖の増加につながる、細胞周期を加速することができます。 増殖細胞における高レベルのChk1はS期および有糸分裂を調整するが、高レベルのChk1-SはS-G2/M相転移の強力なスイッチを提供する可能性がある。 対照的に、過剰なレベルでのＣｈｋ１−Ｓの強制的な過剰発現は、Ｃｈｋ１によって不均衡であり、早期の有糸分裂の侵入および細胞死を誘導する（図１ ０Ａ）。 腫瘍異種移植モデルにおける腫瘍増殖を抑制する（図２）。 4). Chk1は癌治療において有効な治療標的であることが示唆されており、Chk1阻害剤は臨床試験で評価されている（40-43）。 Chk1の内因性阻害剤としてChk1-Sの同定は、細胞周期調節、DNA損傷応答、および癌治療における研究の新しい分野を開くことができます。