- 要約
- 1. はじめに
- 2. 材料および方法
- 2.1. Chemicals<1 8 5 5><7 4 3 0>Ifnyは、EMD Millpore Chemicals(BILLERICA,M A,USA)から購入した。 Louis,MO,MO,Mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,アメリカ)。 RPMI1 6 4 0およびトリプシン−EDTAは、Life Technologies(Grand Island,NY,USA)から購入した。 ウシ胎児血清(FBS)をHyclone Thermo Fisher Scientific(Waltham,M A,USA)から購入した。 2.2. 中国のハーブの70%エタノール抽出物の調製
- 2.3. 亜硝酸塩産生の測定
- 2.4. 細胞生存率の分析
- 2.5. 統計分析
- 3. 結果
- 3.1. NO生産と細胞増殖に及ぼすハーブ抽出物の影響
- 3.2. ハーブの抗炎症効力とTCM特性との相関
- 3.3. ハーブの細胞保護効果とTCM特性との相関
- 4. ディスカッション
- 利益相反
- 謝辞
要約
誘導性窒素酸化物シンターゼ(iNOS)は、酸化窒素の過剰産生の主な原因であり、その阻害剤は有効な抗炎症剤として積極的に求められている。 本研究では、70%のエタノール抽出物を81中国のハーブから調製した。 これらの抽出物は、その後、Griess反応およびMTTアッセイによってlps/IFN-共刺激および非刺激マウスマクロファージRAW264.7細胞における窒素酸化物(NO)産生および ダフネ-ゲンクワの抽出物Sieb.et Zucc、Caesalpinia sappan L.、Iles pubescens Hook.et Arn,Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl、Zingiber officinale Rosc、Inula japonica Thunb。 およびLigusticum chuanxiong HortはNO産生を著しく阻害した(阻害<2389>90%で100g/mL)。 活性抽出物(阻害>50%で100g/mL)の中で、Rubia cordifolia L.、Glycyrrhiza glabra L.、アイレス-パブスケンスHook.et Arn,Nigella glandulifera Freyn et Sint,Pueraria lobata(Willd. Donは、LPS/IFN−共刺激細胞の増殖を増加させながら、非刺激RAW2 4 6. 彼らの活動と伝統的な中国医学(TCM)の特性との相関を分析することによって、刺激性の風味を持つハーブは強力な抗炎症能力を示した。 私たちの研究は、潜在的な抗炎症ハーブのシリーズを提供し、刺激性の風味を持つハーブが効果的な抗炎症剤の候補であることを示唆しています。
1. はじめに
炎症は、損傷した細胞、刺激物、病原体などの有害な刺激を除去し、創傷修復プロセスを開始することを目的とした自己防御機構です。 しかし、炎症はさらに炎症を誘発し、重度の細胞傷害および組織損傷を引き起こす可能性のある慢性炎症を自己永続させることがある。 慢性炎症は、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、糖尿病、および発癌などの多種多様な疾患に関連している。
主に炎症条件下で誘導性一酸化窒素シンターゼ(iNOS)によって生成される一酸化窒素(NO)は、炎症中の病理学的プロセスの各段階において重要な役割を果 INOSの選択的阻害剤は、様々な炎症性動物モデルにおいて抗炎症性および組織保護性の両方であることが示されており、したがって、炎症性疾患を治療す 慢性炎症が腫瘍進行に積極的に関与しているという概念を支持する、ヒト腫瘍では、しばしば高発現のiNOSが検出され得る。 実際には、アスピリンとトルフェナム酸を含む非ステロイド性抗炎症薬(Nsaid)は、現在、癌の予防と治療の両方に使用されています。
様々な天然物が、実験動物モデルにおいて抗炎症作用および抗癌作用を有することが報告されている。 例えば、クルクミンはcyclooxygenase2(COX2)の表現を禁じるために示され、chemopreventionの代理店として臨床使用に実際にあります。 クルクミンの約束のために、広範な努力はまた炎症性仲介者を目標とすることができる混合物を識別するために出されました。 Liao et alによる最近の研究。 漢方薬の抗酸化能力は、その風味特性と相関することが判明した45一般的に使用される漢方薬における抗酸化能力と伝統的な漢方薬(TCM)の特性との間の潜在的な関連性を調査した。 有効な炎症抑制の代理店がTcmの特徴に基づいて中国のハーブから可能性としては識別されるかもしれないことを示すので調査結果は非常に心強い。
有効な抗炎症剤を同定するために、中国のハーブから70%エタノール抽出物を調製し、その後、LPSとIFNyで共刺激されたマウスマクロファージRAW264.7細胞でNO産生を抑制する能力を試験した。 さらに,これらのハーブ間の抗炎症能力とTCM特性との相関を解析した。 私達は刺激性の味が付いているハーブが炎症抑制の機能の最も強いことを結論します。
2. 材料および方法
2.1. Chemicals<1 8 5 5><7 4 3 0>Ifnyは、EMD Millpore Chemicals(BILLERICA,M A,USA)から購入した。 Louis,MO,MO,Mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,mo,アメリカ)。 RPMI1 6 4 0およびトリプシン−EDTAは、Life Technologies(Grand Island,NY,USA)から購入した。 ウシ胎児血清(FBS)をHyclone Thermo Fisher Scientific(Waltham,M A,USA)から購入した。
2.2. 中国のハーブの70%エタノール抽出物の調製
すべてのハーブは、YANG He TangおよびKangqiao Co(上海、中国)から得られた。 私たちの研究のために選択されたすべての81ハーブは、TCM文献または現在の薬理学的報告のいずれかによって潜在的な抗炎症活性を有することが これらのハーブの植物同定は、上海食品医薬品管理研究所(SIFDC)によって行われた。 エタノール抽出物を調製するために、各乾燥ハーブ100gをスライスし、1Lの70%エタノールでCで三回抽出した。 得られたエタノール抽出物を温度Cで減圧下蒸発させ、Cで保存した。
2.3. 亜硝酸塩産生の測定
RAW264.7細胞を96ウェルプレート(ウェルあたり5×103細胞)に一晩めっきし、FBSフリー培地を10時間補充した後、各ウェルに100μ g/mLのハーブ抽出物を添加した。 細胞を、1 0 0ng/mlのLPSおよび1 0U/mlのIfn Γで2 4時間共刺激し、次いで、培地を収集し、以前に記載されたように、Griess反応により、安定な酸化代謝産物および忠実なNO指 それを行うために、100μ lのGriess試薬(0.1%のナフチル-エチレンジアミンおよび1%のスルファニルアミド、5%のリン酸中)を、100μ lの収集培地と96ウェル板中で混合した。 混合物を室温で1 0分間インキュベートした後、5 4 0nmで読み取った。 亜硝酸塩の量は、亜硝酸塩ナトリウムで生成された標準曲線に基づいて計算した。 NO産生における阻害率は、式{/(ハーブ抽出物を含まない亜硝酸塩)}×100で計算した。
2.4. 細胞生存率の分析
細胞生存率は、前述のようにMTTアッセイによって決定した。 形成されたMTTホルマザンを、1 0%SDSおよび5%イソブタノールを含有する5 0μ lの0. 細胞増殖は、microplate readerで570nmでプレートを読み取ることによって決定した。 対照群の細胞生存率は100%と考えられている。
2.5. 統計分析
変数間の相関の方向と大きさは、t検定の分析を使用して行われました。 0.05未満の値は統計的に有意であると考えられた()。
3. 結果
3.1. NO生産と細胞増殖に及ぼすハーブ抽出物の影響
Griessアッセイの助けを借りて、我々は彼らの抗炎症活性のための81ハーブのエタノール抽出物を分析しました。 これらの抽出物では、NO産生における広範囲の阻害が観察された(表1)。 7つのハーブのエキスは90%にlps/IFNy刺激されたRAW264の生産を妨げなかった。7セル(表1)。 NO産生において50%以上の阻害を誘発した抽出物の中で、Rubia cordifolia L.、Glycyrrhiza glabra L.、Iles pubescens Hook.et Arn,Nigella glandulifera Freyn et Sint,Pueraria lobata(Willd. 7細胞に対して細胞毒性を示さなかったが、LPS/Ifn Γ刺激細胞の生存率を有意に増加させた(表1)。 しかし、ダフネ-ゲンクワSieb.et NO産生に対して最も強い阻害効果を有するZuccは、RAW264.7細胞に対して適度に毒性であった(表1)。
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HR: herb; RT:根;ST:茎;LF:葉;TW:小枝;FL:花;FR:フルーツ;SD:種;SC:sclerotium;HW:心材;SR:茎および根;PE:果皮。 NO産生のbPercent阻害:Griess反応は、100g/mLのハーブ抽出物の非存在下または存在下でLPS/IFNy刺激RAW264.7細胞における亜硝酸塩の産生を測定するために行われました。<7 0 9 5>CCELL増殖:MTTを実施して細胞増殖を測定した。 対照(ハーブ抽出物処理なし)の成長率は100%と考えられた。 dNO生産:Griess反応は、非刺激RAW264中の亜硝酸塩の量を測定するために使用されました。100g/mLのハーブ抽出物の非存在下および存在下で7細胞。 eCell細胞毒性:MTTアッセイは、ハーブ抽出物で処理された刺激されていないRAW264.7細胞の細胞毒性を決定するために行われました。 未処理群は100%と考えられた。 各100gの乾燥ハーブの70%エタノール抽出から得られた抽出物のfPercent収率。 50Mの試験濃度でのiNOS活性のgPercent阻害。 |
3.2. ハーブの抗炎症効力とTCM特性との相関
LPS/IFNy刺激RAW264.7細胞におけるNO産生に対する最も強い阻害効果を示す10ハーブのTCM特性を分析すると、それらのほ これらのハーブの抗炎症効果にTCM特性を相関させるために、我々はLPS/IFNy刺激RAW264.7細胞におけるNO産生の50%を廃止することができたこれらのハーブのTCM特性 表3は、より高い抗炎症効果を有するハーブは、苦味/辛味味、暖かい性質、および肝臓/肺子午線分布として特徴付けられるもので有意に高い割合で分布していたことを示した。 これらの結果は,抗炎症ハーブが辛味/苦い風味,暖かい性質,および肺/肝臓経絡の共通の特徴を有することを示唆している。
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中国薬局方(2010年)に基づく。 bBased on Chinese Materia Medica(1998). |
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3.3. ハーブの細胞保護効果とTCM特性との相関
慢性炎症はしばしば細胞損傷を引き起こすため、このプロセスを抑止できる薬剤が積極的に求められています。 刺激性の味のTCMの特徴が付いている21のハーブを検査して、私達はLPSおよびIFNyのcostimulationの下で、RAW264ことを観察しました。これらのハーブ抽出物で処理された7細胞は、細胞生存率の90%の増加を示した(表4)。 さらに、刺激性の風味を有するハーブは、他の風味を有するハーブと比較して、LPS/IFNy刺激細胞においても最高レベルの細胞保護を与えた(図1)。
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刺激されたRAW264.7細胞の90%の細胞の保護機能上のハーブ。 休止中のRAW264.7細胞において90%以上の細胞増殖を増加させる能力を有するbHerbs。 |
異なる味の細胞生存率とハーブの比較。 異なる風味に属するハーブで処理されたLPS/IFNy刺激RAW264.7細胞の細胞生存率の平均。 .
4. ディスカッション
iNOS発現の上昇によるNOの過剰産生は、慢性炎症および癌の病因に説得力のあるリンクされています。 したがって、iNOS産生NO産生を選択的に抑制することができる薬剤は、慢性炎症の治療および癌の予防に有効であるはずである。 実際、最近の研究では、選択的iNOS阻害剤L-NILおよび1400Wが抗炎症薬および抗癌剤として治療的に有効であることが示されている。
マクロファージは炎症を調節する上で重要な役割を果たしている。 マクロファージは外部刺激によって活性化され、活性化されたマクロファージはNOや活性酸素種などの様々な炎症メディエーターを産生する。 中国のハーブは炎症抑制の代理店のための豊富な源であり、努力はこれらのハーブの有効な部品を識別するためになされました。 確立されたRAW264.7細胞モデルを利用して、我々はLPS/IFNy誘導NO生産に対する阻害効果のための81ハーブ抽出物を評価しました。 その中で、Daphne genkwaの抽出物Sieb.et ZuccはNO産生に対して最も強い阻害効果を示した。 ダフネ-ゲンクワから単離された成分Sieb.et Zuccは、以前に様々な腫瘍細胞株に細胞毒性効果を誘発し、マウスにおける移植マウス肉腫S180の増殖を抑制することが報告されていた。 ダフネ-ゲンクワの抗がん効果はSieb.et Zuccは、その抗炎症能力と機能的に関連している可能性があります。 我々の研究では、我々はRubia cordifolia L.といくつかの他の人がRAW264.7細胞に有意な細胞毒性を引き起こすことなく、LPS/IFNy誘導NO産生を減少させることがわかった。 したがって、これらのハーブは、炎症および癌を制御するための有効な薬剤として有望な候補であり得る。 これらの抽出物がRAW264.7細胞におけるLPS/IFN誘導性NO産生をどのようにブロックするかは現在不明であるが、MolluginがJanusキナーゼ-シグナル伝達体および転写シグナリング経路の活性化因子をブロックすることによって炎症応答を抑制するという発見は、ハーブがLPS/IFN誘導性NO産生を仲介するシグナリングカスケードの異なるステップを標的にして抗炎症役割を発揮する可能性があることを示唆している。
TCMの理論に基づいて、これらの81のハーブを、異なる味(辛味、甘い、酸っぱい、苦い、収斂性、塩味、または軽度)、性質(冷たい、涼しい、中moderate、暖かい、または熱い)、および子午線分布(肝臓、腎臓、心臓、脾臓など)に応じて分類した。). 私たちの研究では、味のTCM特性は、no生産を阻害する効力と非常によく相関していることを示しました—辛味風味が最も強く、苦味が辛味よりもわずかに弱 天然および子午線分布のTCM特性はまた、NO産生を阻害する効力と関連している。 例えば、生産を妨げる機能のハーブのより高いパーセントに暖かい性質の特徴がありません。 肝臓および肺の子午線の特徴は、その抽出物がNO産生の50%をブロックすることができるハーブに見られる主要な子午線分布である。 一緒に取られて、私達はTcmの特徴が可能性としては中国のハーブの有効な炎症抑制の代理店の調査を導いて非常に有用である場合もあることを理
TCM特性は、ヒトにおけるMateria Medicaによって誘発される明確な特性の体系的な発現である。 TCMの味の理論は中国のハーブの使用法の指導の中心の文脈を構成します。 TCMでは、味の特徴は実質の好みおよび治療効果がある効果両方の組合せです。 Shen Nong Ben Cao Jing(Shennong’S Classic of Material Medica)によると、まず中国のハーブの味と特性理論について書かれた重要なTCMの本によると、肺の子午線に関連する辛味の味は、気と血液の循環を促進するsudorificsで内部の熱を分散させることができる。 刺激性の味のハーブは中国で千年の間実際に血の循環を強め、チーのブロックを壊すのに使用されていました。 炎症関連疾患が気や血液の閉塞の症状と関連しているという事実は、炎症を抑制するための刺激性のある風味のハーブの有効性を説明するかもしれ
我々の研究は、マクロファージRAW264.7細胞におけるLPS/IFNy誘発性NO産生および細胞増殖に対するそれらの効果に関する81ハーブ抽出物の調査に限定されてい それにもかかわらず、この研究から得られた結果は、現代の薬理学/生物医学科学とTCM理論との間の密接な関連を支持する。 TCM理論は、臨床経験の千年に基づいて開発され、tcmの材料および薬理学的基礎は、現代の生物医学科学によって説明されることが残っています。 私たちは、この研究がこの目標に貢献したと信じています。
利益相反
著者らは、この論文の出版に関して利益相反はないと宣言している。
謝辞
この作業は、中国科学技術部の国家科学技術主要プロジェクト(2009ZX09311-003)、中国国家自然科学財団の若手科学者基金(81001666)、上海市教育委員会のイノベー…..