VETERINARIA MICROBIOLOGIA
Identificazione di Clostridium chauvoei in campioni clinici di culture da crumiro casi, mediante PCR –
Identificazione di Clostridium chauvoei nei settori dei materiali e casi clinici al turchese, è sintomatico di utilizzare la PCR
St MiyashiroI,* A. F. C. NassarI; M. C. A., M. SouzaI, J. B. CarvalhoI; J. E. B. AdegasII
IInstituto Biológico, São Paulo, SP, Brasil
IIMato Grosso do Sul, in Brasile
ABSTRACT
C. chauvoei presenza è stata rilevata mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) da surnatante di coltura nella carne cotta medio di fegato, muscolo e metatarsian midollo osseo campioni di sette vitelli con crumiro sintomi. L’isolamento in condizioni anaerobiche di un campione muscolare ha rivelato Clostridium perfringens in coltura pura.
Parole chiave: Clostridium chauvoei; blackleg; bovine; PCR.
abstract
la presenza di Clostridium chauvoei è stata rilevata mediante reazione PCR da coltura media di carne cotta di campioni di fegato, muscoli e midollo osseo metatarsale da sette vitelli affetti da carbonchio sintomatico. L’isolamento di un campione muscolare in condizioni anaerobiche ha rivelato Clostridium perfringens in coltura pura.
parole chiave: Clostridium chauvoei, carbonchio sintomatico, bovino, PCR.
Clostridium spp è uno dei generi che compongono il gruppo di batteri anaerobici di notevole importanza medica ed economica. Clostridiosi è il nome generico dato a una varietà di malattie causate dai batteri di questo genere, che possono verificarsi in qualsiasi parte del corpo che offre condizioni per il loro sviluppo con conseguente produzione di tossine durante la moltiplicazione (1).
Clostridium chauvoei è l’agente eziologico della gamba nera e dell’edema maligno nei bovini, negli ovini e in altri ruminanti (4). La gamba nera nei bovini è un’infezione endogena non traumatica e una percentuale considerevole di bovini può ospitare C. chauvoei nel loro fegato. Gli animali colpiti sono anoressici, depressi, febbrili e zoppi (un arto laterale), presentando un gonfiore caldo e doloroso che diventa freddo, edematoso con crepitazione. La morte è osservata entro 12-48 ore. Questo agente sembra avere una preferenza per i muscoli grandi (coscia, diaframma e cuore), che alla necroscopia sono scuri, rossi, secchi e spugnosi (11). I sintomi che assomigliano alla gamba nera possono anche essere causati da Clostridium septicum,C. novyi, C. perfringens o C. sordellii. In un recente studio sulla posizione filogenetica di C. chauvoei e C. septicum sulle loro sequenze del gene rRNA 16S (rrs), è stata determinata una somiglianza del 99,3% tra i geni rrs di C. chauvoei e C. septicum che si riflette anche a livello fenotipico (7,8).
Mentre la diagnosi presuntiva della gamba nera e dell’edema maligno dipende dai risultati clinici e patologici, la conferma della malattia si trova tipicamente isolando e identificando l’organismo, come la produzione di tossine e i metodi immunologici (9,13). Tuttavia, questi metodi diagnostici richiedono tempo e tempo. Inoltre, i metodi immunologici possono produrre risultati equivoci perché C. chauvoei e C. septicum hanno vari antigeni in comune (4).
L’amplificazione dell’acido nucleico di una specifica regione bersaglio del genoma batterico mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata ampiamente utilizzata per scopi di rilevamento e diagnosi (15). La capacità della PCR di amplificare il DNA in modo specifico da un basso numero di batteri, così come la sua semplicità, rapidità e riproducibilità, offre vantaggi rispetto ai metodi convenzionali per l’identificazione ed è stata effettivamente utilizzata per identificare molte specie di clostridium, tra cui C. chauvoei in colture pure e in campioni clinici (5,7,12,14). Una diagnosi accurata di blackleg è, quindi, spesso difficile. La diagnosi standard si basa su un test immunofluorescente e su criteri morfologici.
In questo articolo descriviamo un metodo basato sulla PCR da un precedente arricchimento in mezzo di carne cotta di campioni di vitelli con gamba nera per identificare C. chauvoei. Sono stati analizzati campioni di fegato, muscoli e midollo osseo metatarsico di vitelli che presentavano sintomi di blackleg durante l’autunno brasiliano. I campioni raccolti provenivano da sei vitelli di un gregge dello Stato di San Paolo e da un vitello dello Stato del Mato Grosso do Sul (Tabella 1). Tutti questi bovini sono morti improvvisamente e hanno presentato crepitazione muscolare nell’arto posteriore.
Macerato di campioni di fegato e muscoli e tamponi di midollo osseo sono stati inoculati in provette con mezzo di carne cotta (Difco ®) che subito prima è stato sottoposto a shock termico (100ºC per 10 minuti immediatamente raffreddato in acqua corrente), e poi sono stati incubati a 37ºC per 48 ore. Dieci microlitri di carne cotta sono stati coltivati in agar di sangue di pecora al 5% e incubati a 37ºC per 48 ore in condizioni anaerobiche. Colonie con forma, aspetto, colore ed emolisi caratteristici sono state sottoposte a colorazione Gram per la determinazione morfologica e della parete cellulare. Gli isolati sospetti sono stati sottoposti a test di catalasi, lecitinasi, gelatinasi, glucosio, lattosio e coagulazione tumultuosa del latte per l’identificazione del genere e delle specie batteriche.
La tecnica a base di tiocianato di guanidina (2) è stata realizzata per l’estrazione del DNA dal surnatante di provette con mezzo di carne cotto. Un mL di ciascun tubo è stato centrifugato a 13000 x g per 20 minuti e il pellet è stato risospeso in 200 µL di tampone Tris-EDTA prima del protocollo di estrazione. La PCR multiplex è stata eseguita con primer progettati per il gene flagelin (fliC), descritto da SASAKI et al. (10), specifico per Clostridium chauvoei e Clostridium septicum, che amplificano rispettivamente 535 coppie di basi (bp) e 294 bp. Il FlaF di fondo in avanti è comune per entrambe le specie e FlachR e FlaseR sono i primer inversi per C. chauvoei e C. septicum, rispettivamente. L’amplificazione del DNA è stata effettuata in un volume totale di 50 µL, con 200 µM di ciascun dNTP, 5 µL di reazione 10X buffer, 2,5 mM MgCl2, 30 pmol di ciascun primer (FlaF – 5′ AGAATAAACAGAA GCTGGAGATG 3′ , FlachR – 5′ TACTAGCAGCATCAAAT CGT 3′ , e Flase R – 5′ TTTATTGAATTGTGTTTGTGAAG 3′ ), 1,25 U di Taq polimerasi e 10 µL di DNA. Per l’amplificazione, abbiamo usato trenta cicli suddivisi in tre fasi come segue: denaturazione a 94ºC per 60 secondi, ibridazione a 56ºC per 60 secondi ed estensione a 72ºC per 60 secondi. C. chauvoei IB 1559 e C. septicum 10518 (ceppi dell’Instituto Biológico) sono stati utilizzati come controlli positivi per PCR e il campione muscolare di una mucca normale è stato utilizzato come controllo negativo per PCR.
La PCR è stata applicata anche direttamente da campioni clinici (fegato, muscoli e midollo osseo) utilizzando gli stessi protocolli di estrazione e amplificazione del DNA sopra citati. Le amplificazioni sono state effettuate in un Thermal Cycler-100 di Peltier (Ricerca MJ) e l’analisi dei prodotti amplificati è stata eseguita mediante elettroforesi in gel di agarosio 1,3% macchiato con bromuro di etidio.
La macchia di gram di carne cotta media inoculata con i campioni sospetti ha mostrato piccole barre gram-positive con spore subterminali nella maggior parte dei campioni (fegato 1, muscoli 1,2 e 7 e midolli ossei 3,4 e 5), oltre ad altri. Tuttavia, solo nel campione di muscolo 7 è stato isolato Clostridium perfringens in coltura pura e, nessuna crescita è stata osservata nelle altre piastre di campioni incubate in condizioni anaerobiche. La PCR multiplex dei campioni clinici non ha mostrato alcun risultato positivo né per C. chauvoei né per C. septicum. Tuttavia, nella reazione da surnatante di mezzo di carne cotta inoculato con gli stessi campioni, sette di loro erano positivi a C. chauvoei e negativi a C. septicum (fegato 1, muscoli 1,2 e 7, midolli ossei 3,4 e 5), come visto nella Tabella 1.
La stretta relazione filogenetica tra C. chauvoei e C. septicum è un riflesso molecolare della somiglianza fenotipica di questi organismi. C. chauvoei è relativamente difficile da distinguere da C. septicum e, inoltre, C. septicum può causare sintomi molto simili ai sintomi della gamba nera (6,9).
GREGORY et al. (3) ha riportato l’insorgenza e il trattamento di un bovino con gamba nera con alte dosi di penicilina. La diagnosi è stata effettuata isolando C. chauvoei da un tampone dell’area della mionecrosi e l’inoculazione delle cavie per la sua identificazione.
KUHNERT et al. (7) ha riportato un sistema per distinguere C. chauvoei e C. septicum, tuttavia, richiede una restrizione della digestione enzimatica dei prodotti PCR per l’identificazione definitiva dell’organismo a causa della piccola differenza nel gene 16S rRNA di entrambi i batteri.
I nostri risultati mostrano che la reazione PCR multiplex basata sul gene fliC (10) è stata efficace per identificare C. chauvoei da campioni naturalmente infetti coltivati in mezzo di carne cotta che realizzano il tiocianato di guanidina per l’estrazione del DNA e differenziare questa specie da C. septicum. Tuttavia, i risultati della PCR direttamente dai campioni di tessuto erano negativi, probabilmente a causa del basso numero di microrganismi clostridiali o del protocollo di estrazione del DNA inefficiente.
L’isolamento di C. chauvoei è molto difficile, poiché richiede condizioni anaerobiche dure e gli esemplari clinici sono spesso contaminati da altri batteri anaerobici, tra cui i clostridi nel suolo, che crescono più velocemente di C. chauvoei in un mezzo di coltura (9). La coltura microbiologica del muscolo 7 ha rivelato Clostridium perfringens isolato in coltura pura in condizioni anaerobiche. Questa specie può anche essere coinvolta in casi di blackleg e, nel presente studio, potrebbe essere associata a C. chauvoei. Ad ogni modo, se solo i metodi microbiologici fossero stati applicati in questo caso, la diagnosi di blackleg sarebbe sbagliata o incompleta. I vaccini clostridiali forniscono un alto grado di immunità contro le malattie clostridiali e, quando la diagnosi è corretta, la malattia può essere facilmente controllata. Per questo, i campioni clinici devono essere correttamente raccolti e sottoposti ad esame di laboratorio. Una volta che tutte le malattie dovute a clostridi possono essere prevenute con la vaccinazione, se il problema continua nonostante la vaccinazione, la diagnosi deve essere sbagliata. Inoltre, una descrizione del caso è di fondamentale importanza per condurre l’analisi laboratoriale (1).
Le infezioni dovute a microrganismi clostridi causano notevoli perdite nella produzione, una volta che il trattamento è generalmente impraticabile. Il controllo e la prevenzione devono comprendere misure adeguate di manipolazione e di vaccinazione sistematica del gregge, poiché gli animali sono in contatto permanente con gli agenti e i fattori che saranno in grado di scatenare le malattie.
La rilevazione di acido nucleico di C. chauvoei da un precedente arricchimento di campioni naturalmente infetti in mezzo di carne cotta ha chiarito la diagnosi in questi due focolai brasiliani di blackleg, che di solito rimane inconcludente a causa della limitazione della coltura microbiologica. Inoltre, a causa dell’elevata specificità della tecnica PCR, è stato evitato l’impiego di cavie per l’identificazione dell’agente.
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