Checkpoint chinasi 1 (Chk1)-short è una variante della giuntura e un inibitore endogeno di Chk1 che regola i checkpoint del ciclo cellulare e del danno al DNA

Risultati e discussione

Durante il nostro studio sulla segnalazione del danno al DNA (32, 33), abbiamo osservato due bande prominenti negli immunoblots Chk1: la banda Chk1 a 56 kDa e una banda di migrazione più rapida di 43 kDa. La banda di migrazione più rapida è stata rilevata dagli anticorpi Chk1 che erano reattivi al dominio interno della chinasi o alla sequenza C-terminale, ma non dagli anticorpi Chk1 che riconoscevano il terminale N (Fig. 1 BIS). Questa banda non è stata riconosciuta dall’anticorpo monoclonale G4 di Santa Cruz Biotechnology che è comunemente usato per l’analisi immunoblot di Chk1 (24, 29). L’abbattimento del Chk1 tramite siRNA ha portato alla scomparsa sia del Chk1 che della banda 43-kDa, confermando ulteriormente la loro rilevanza (Fig. 1 TER). La proteina 43-kDa non è stata influenzata dal proteasoma e dagli inibitori della proteasi (Appendice SI, Fig. 1), aumentando la possibilità che potrebbe essere una variante di giunzione alternativa di Chk1. Il National Center for Biotechnology Information database attualmente elenca tre MRNA umani Chk1 impiombati in alternativa che hanno regioni variabili non tradotte ma codificano la stessa proteina Chk1 a lunghezza intera di 476 aminoacidi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1111). Tuttavia, la nostra analisi utilizzando un database predittivo di splicing alternativo basato su EST (http://genome.ewha.ac.kr/ECgene) ha suggerito la possibilità di una variante di splicing unica di Chk1 in cui l’esone 3 viene alternativamente giuntato o eliminato. Per testare direttamente questa possibilità, abbiamo eseguito RT-PCR utilizzando primer all’interno della sequenza di codifica Chk1 (Fig. 1C). RT-PCR usando il set di primer P1, in cui il primer anteriore è stato progettato all’interno dell’esone 3, ha generato un singolo amplicone della dimensione prevista, mentre RT-PCR con il set di primer P2 o P3 (entrambi basati su sequenze che fiancheggiano l’esone 3) ha generato due ampliconi, uno con la dimensione prevista di Chk1 e l’altro shorter 200 bp 1C). Il sequenziamento ha confermato che l’amplicone più lungo era effettivamente Chk1 e, in particolare, l’amplicone più corto era una variante di giunzione alternativa di Chk1 priva dell’esone 3 (Fig. 1D e SI Appendice, Fig. 2 BIS). Questa variante della giuntura è stata prevista per tradursi in una forma troncata N-terminale di Chk1 composta da 382 aminoacidi che abbiamo chiamato Chk1-short o Chk1-S (Fig. 1D e SI Appendice, Fig. 2). In elettroforesi su gel, in vitro tradotto Chk1-S migrato in modo simile come la proteina 43-kDa da cellule HEK293 (Fig. 1E). Abbiamo ulteriormente immunoprecipitato la proteina 43-kDa dal lisato cellulare HEK293 per la spettrometria di massa e confermato la sua identità come Chk1-S. Il troncamento N-terminale in Chk1 – S è coerente con i risultati di immunoblot che mostrano che non è stato riconosciuto dagli anticorpi reattivi alla sequenza N-terminale di Chk1 (Fig. 1 BIS). L’analisi in tempo reale e RT-PCR ha rilevato l’espressione di mRNA Chk1-S in più tessuti umani e l’espressione è generalmente più alta nei tessuti fetali (appendice SI, Fig. 3 Lettere A e D). L’analisi Immunoblot ha ulteriormente rilevato l’espressione della proteina Chk1 – S nelle linee cellulari umane, del topo e del ratto e anche nei tessuti fetali umani (Appendice SI, Fig. 3B) e cellule tubulari renali primarie di topo (Appendice SI, Fig. 3 QUATER). Il cDNA integrale di Chk1 – S è stato anche clonato da tre tessuti umani normali (timo, colon, fegato fetale) e sequenziato per confermare che codifica una variante di giunzione troncata N-terminale di Chk1. Insieme, questi esperimenti hanno identificato una variante unica della giuntura di Chk1 che è N-terminale troncata ed ampiamente espressa in cellule e tessuti di mammifero.

Qual è la funzione di Chk1-S? Regola i checkpoint del ciclo cellulare come Chk1? Con queste domande, abbiamo prima determinato i modelli di espressione temporale e spaziale di Chk1-S nel ciclo cellulare. Le cellule HEK293 sono state sincronizzate alle fasi G1, G1/S o G2/M per fame di siero, doppio blocco di timidina o nocodazolo, rispettivamente. Chk1-S era basso nelle cellule di fase G1 e superiore nelle cellule G1/S e G2/M (Appendice SI, Fig. 4 Lettere A e B). Inoltre, quando le cellule sono state sincronizzate alla fase G1/S da un doppio blocco di timidina e poi rilasciate, sia l’espressione Chk1 che Chk1-S è aumentata dopo aver inserito la fase S (Fig. 2 BIS). Una netta differenza tra espressione Chk1 e Chk1-S era che mentre espressione Chk1 ha raggiunto il picco a metà della fase S, espressione Chk1-S continuava ad aumentare dalla S alla fase M (Fig. 2 BIS). È interessante notare che alti livelli di espressione di Chk1-S sono stati osservati a 7 h dopo il rilascio del ciclo cellulare dal doppio blocco di timidina, un momento in cui le cellule dovevano ancora essere mitotiche (Appendice SI, Fig. 4 QUATER). Abbiamo ulteriormente quantificato il rapporto Chk1-S: Chk1 in celle sincronizzate asincrone e S o G2/M. Nonostante le variazioni dell’espressione di Chk1-S in HEK293, U2OS e cellule tubulari renali primarie, il rapporto Chk1-S: Chk1 era superiore a 1 in tutte le cellule in fase G2/M (Appendice SI, Fig. 5). Nelle cellule asincrone, Chk1-S e Chk1 erano localizzati principalmente nel nucleo (Appendice SI, Fig. 6 BIS). Tuttavia, nelle cellule di fase G2/M, alcuni Chk1-S e Chk1 si sono accumulati nei centrosomi (Appendice SI, Fig. 6 B e C). La localizzazione di Chk1 nei centrosomi è fondamentale per la sua funzione di checkpoint G2 / M, dove impedisce l’attivazione prematura di Cdk1 e l’ingresso mitotico (34, 35). I nostri risultati indicano che Chk1-S può anche localizzarsi ai centrosomi, fornendo una regolazione spaziale e temporale di Chk1 per avviare l’ingresso mitotico. Successivamente, abbiamo determinato gli effetti della sovraespressione Chk1 o Chk1-S nelle cellule HEK293 e U2OS. Rispetto a GFP-Chk1, GFP-Chk1-S ha indotto un distinto fenotipo nucleare caratterizzato da condensazione nucleare e formazione di micronuclei e nuclei multipli o multilobati (Fig. 2 TER). In punti temporali precedenti, le cellule trasfettate hanno mostrato condensazione nucleare / cromatina contrassegnata da fosforilazione istone-H3 debole e puntata (Fig. 2B), indicativo di ingresso mitotico prematuro. Successivamente, queste cellule hanno sviluppato micronuclei o nuclei multilobati, caratteristiche della catastrofe mitotica (Fig. 2 TER). Il conteggio delle cellule ha mostrato che GFP-Chk1-S ha indotto il fenotipo nucleare in ∼20% delle cellule U2OS (Fig. 2 QUATER). Effetti simili sono stati mostrati da YFP-Chk1-S e Chk1-S-Myc (Fig. 2C), indicando che il fenotipo nucleare osservato è stato indotto da Chk1-S e non dai tag della proteina di fusione. Al contrario, l’ingresso mitotico prematuro non è stato indotto da Chk1 o dal suo mutante chinasi-morto Chk1-KD (Fig. 2 QUATER). Chk1-S ha anche indotto il fenotipo nucleare sorprendente in altri tipi di cellule (Appendice SI, Fig. 7). In particolare, un fenotipo nucleare simile è stato riportato in cellule e modelli murini privi di uno o entrambi gli alleli Chk1 (7, 36, 37), suggerendo che Chk1-S può agire come un inibitore endogeno di Chk1. Per testare ulteriormente questa possibilità, abbiamo generato linee cellulari Tet-on U2OS che possono essere indotte ad esprimere Chk1, Chk1-KD o Chk1-S. Le cellule sono state sincronizzate in fase G1/S mediante doppio blocco di timidina, indotto dalla doxiciclina, e quindi rilasciato in mezzo contenente nocodazolo. Circa l ‘ 80% delle cellule che esprimono Chk1-S è entrato nella mitosi , mentre did il 60% delle cellule che esprimono Chk1 o Chk1-KD ha fatto (Fig. 2D). È importante sottolineare che, mentre la maggior parte delle cellule mitotiche nei gruppi che esprimono Chk1 e Chk1-KD aveva DNA 4n ,2 il 25% delle cellule mitotiche del gruppo che esprime Chk1-S aveva meno del contenuto di DNA 4n (Fig. 2D), indicativo di ingresso mitotico aberrante in queste cellule senza completamento della replicazione del DNA. Inoltre, la sovraespressione di Chk1-S ha comportato un ingresso precedente nella mitosi, come indicato dalla comparsa di cellule ph3-positive (Appendice SI, Fig. 8). Chk1 è un regolatore chiave dell’entrata mitotica o della transizione da S a G2 / M nel ciclo cellulare. Fosforilando CDC25A (inducendo la sua degradazione) e Wee1, Chk1 impedisce l’attivazione di CDK1 e l’ingresso mitotico (5, 15-20). Abbiamo dimostrato che l’induzione di Chk1-S da parte della doxiciclina nelle cellule Tet-on U2OS ha portato a livelli più elevati di CDC25A e livelli più bassi di fosfo-CDK1, suggerendo che Chk1-S antagonizzato Chk1 per indurre l’ingresso mitotico (Fig. 2E). L’abbattimento specifico di Chk1-S tramite RNAi non ha avuto successo perché la sequenza Chk1-S è contenuta nell’mRNA Chk1. Tuttavia, un oligonucleotide antisenso complementare all’unica giunzione eson2-eson4 in Chk1-S potrebbe ridurre specificamente l’espressione di Chk1-S (Appendice SI, Fig. 9 BIS). La down-regulation di Chk1-S ha notevolmente ridotto la proliferazione cellulare (Appendice SI, Fig. 9 TER). È interessante notare che la down-regulation di Chk1-S non ha modificato significativamente il profilo del ciclo cellulare (Appendice SI, Fig. 9 QUATER). Poiché Chk1 funziona a diversi punti di controllo del ciclo cellulare (ad esempio, G2/M, mandrino, intra-S), Chk1-S può antagonizzare Chk1 per facilitare la progressione del ciclo cellulare in più siti. Di conseguenza, l’inibizione di Chk1-S può rallentare il ciclo cellulare alle varie fasi e provocare la soppressione di proliferazione senza i cambiamenti importanti della distribuzione del ciclo cellulare.

In che modo Chk1-S antagonizza Chk1? Abbiamo ipotizzato che Chk1-S potrebbe interagire con Chk1 per bloccare la sua attività chinasica. Coerentemente, FLAG-Chk1-S espresso in cellule HEK293 coimmunoprecipitato con Chk1 endogeno (Fig. 3 BIS). Inoltre, in vitro tradotto Myc-Chk1 e Chk1-S coimmunoprecipitato (Fig. 3B), suggerendo un’interazione diretta Chk1-Chk1-S. Abbiamo inoltre dimostrato la coimmunoprecipitazione di Chk1 con il dominio N-terminale, ma non il dominio C-terminale, di Chk1-S (Fig. 3C), suggerendo il requisito della sequenza N-terminale in Chk1-S per la sua interazione con Chk1. Funzionalmente, abbiamo determinato gli effetti di Chk1-S sull’attività della chinasi Chk1. Chk1-Myc è stato espresso e immunoprecipitato per il test della chinasi in vitro in assenza o presenza di Chk1-S purificato. Come mostrato in Fig. 3D, l’attività della chinasi Chk1 è stata parzialmente ma significativamente soppressa da Chk1-S, ma non da Chk1-S denaturato dal calore.Al contrario, Chk1-S non ha diminuito l’attività di Chk2, che ha preferenze di substrato simili a Chk1. Rispetto a Chk1, Chk1-S manca di parte del dominio della chinasi incluso il sito di legame ATP (Fig. 1D) e, come previsto, non ha mostrato una significativa attività della protein chinasi (Fig. 3D). Chk1-S può anche sopprimere l’attività chinasica di N-terminale etichettato Chk1 (FLAG-Chk1) in un test di chinasi in vitro (SI Appendice, Fig. 10). Questi risultati suggeriscono che Chk1-S può inibire Chk1 tramite interazione molecolare. Uno studio recente ha dimostrato che il lavaggio degli immunoprecipitati Chk1 con un tampone più rigoroso Radio Immuno-Precipitation Assay (RIPA) può aumentare notevolmente l’attività della chinasi Chk1, suggerendo che Chk1 è normalmente inibito dai fattori di repressione (29); tuttavia, l’identità dei fattori di repressione è sconosciuta. Abbiamo confermato l’effetto del lavaggio tampone RIPA e, in particolare, abbiamo ulteriormente dimostrato che l’aggiunta di Chk1-S esogeni potrebbe invertire l’effetto del lavaggio tampone RIPA sull’attività della chinasi Chk1 (Appendice SI, Fig. 11), suggerendo che Chk1-S può essere uno dei fattori di repressione endogeni chiave per Chk1.

Nella risposta al danno del DNA (DDR), Chk1 è marcatamente attivato tramite fosforilazione ai residui S345 e S317 (7, 13, 38, 39). Nonostante il riconoscimento dell’importanza della fosforilazione S345/S317, non è chiaro come questa fosforilazione attivi Chk1 (28-30). Abbiamo dimostrato che l’espressione di Chk1-S non è cambiata sensibilmente in DDR (Appendice SI, Fig. 12). Tuttavia, l’interazione Chk1–Chk1-S è stata attenuata nella DDR indotta da camptotecina, un inibitore della DNA topoisomerasi I e un agente dannoso per il DNA (Fig. 3 E). In particolare, la dissociazione di Chk1 da Chk1-S nella DDR è apparsa dipendente dalla fosforilazione di Chk1 a S345 / S317, perché il mutante Chk1(S345A/S317A) non si è dissociato da Chk1-S durante il trattamento con camptothecin (Fig. 3 E). Nella DDR, l’attivazione di Chk1 dipende dalla fosforilazione mediata da ATR (7, 13, 14). Abbiamo dimostrato che l’inibizione dell’ATR tramite un mutante dominante-negativo (dn-ATR) non solo sopprimeva la fosforilazione di Chk1-S indotta da camptotecina, ma impediva anche la dissociazione di Chk1-Chk1–S (Fig. 3 SEPTIES). Allo stesso modo, Chk1 si è dissociato da Chk1-S durante la DDR indotta dal cisplatino e la dissociazione è stata prevenuta da dn-ATR (Appendice SI, Fig. 13). Insieme, i risultati suggeriscono che la fosforilazione di Chk1 può interrompere la sua interazione con l’inibitore endogeno Chk1-S, portando all’attivazione di Chk1 nella DDR.

L’identificazione di Chk1-S come regolatore unico della progressione del ciclo cellulare e della proliferazione cellulare ci ha spinto a esaminare la sua espressione nei tessuti tumorali. A livello di mRNA, la maggior parte dei tessuti tumorali ha espresso livelli più elevati di Chk1 e Chk1-S rispetto ai tessuti normali (Appendice SI, Fig. 14). È interessante notare che i carcinomi testicolari hanno mostrato una marcata up-regulation di Chk1-S ma non di Chk1 (Fig. 4 BIS). L’up-regolazione specifica di Chk1 – S è stata ulteriormente confermata dall’analisi immunoblot nei tessuti del carcinoma testicolare, specialmente nei campioni di cancro in stadio avanzato (Fig. 4 TER). Come riportato in precedenza (5), sia i tessuti testicolari normali che quelli maligni presentavano alti livelli di espressione di Chk1. È stata rilevata anche una maggiore espressione di Chk1-S durante la progressione del cancro ovarico (Fig. 4 TER). Il livello relativamente alto di espressione Chk1 e Chk1 – S in entrambi fetale (Appendice SI, Fig. 3) e cancro (Fig. 4) tessuti suggerisce che Chk1-S può accelerare la progressione del ciclo cellulare, promuovendo la proliferazione cellulare in queste condizioni.

Abbiamo ulteriormente esaminato l’effetto dell’espressione ectopica di Chk1-S sulla crescita del tumore dello xenotrapianto nei topi. Xenotrapianti tumorali sono stati stabiliti in topi nudi utilizzando linee cellulari di cancro al seno Tet-on MDA-MB-231 che possono essere indotte dalla doxiciclina per esprimere Chk1, Chk1-S o Chk1-KD. L’induzione di Chk1 o Chk1-KD da parte della doxiciclina non ha influenzato la crescita del tumore; tuttavia, l’induzione di Chk1-S ha comportato una riduzione del 40% del volume del tumore (Fig. 4 QUATER). I tessuti tumorali indotti da Chk1-S hanno anche mostrato l’accumulo di cdc25A, indicando l’inibizione di Chk1 (Fig. 4 E). Sebbene i risultati possano implicare una strategia antitumorale unica, la rilevanza fisiologica della sovraespressione forzata di Chk1-S ectopica rimane poco chiara. Questi risultati, tuttavia, forniscono una prova di principio che inclinando l’equilibrio Chk1–Chk1-S può portare alla catastrofe mitotica e alla riduzione della proliferazione cellulare.

L’osservazione che la sovraespressione di Chk1-S ha ridotto la crescita del tumore dello xenotrapianto (Fig. 4 E-E) sembrava in contraddizione con l’osservazione che i campioni tumorali di pazienti umani esprimevano livelli relativamente elevati di Chk1-S per la proliferazione cellulare (Fig. 4 A e B e SI Appendice, Fig. 14). Per conciliare questi dati, è importante riconoscere le differenze tra le condizioni sperimentali. L’espressione relativamente alta di Chk1-S nei tumori umani può essere attribuita alla presenza di cellule proliferative in questi tessuti. Coerentemente, Chk1-S è anche alto nei tessuti fetali che sono altamente proliferativi (Appendice SI, Fig. 3 BIS). È importante sottolineare che l’espressione di Chk1-S in questi tessuti proliferativi è temporaneamente limitata alla fase tardiva da S a M (Fig. 2 e SI Appendice, Fig. 4). Questa regolazione temporale può garantire che l’attività di Chk1 sia inibita dopo (e solo dopo) il completamento della replicazione del DNA in fase S per la progressione del ciclo cellulare in fase G2/M. Tuttavia, quando ectopica Chk1 – S è costretto a sovraesprimere in cellule coltivate o tumori xenotrapianto, la restrizione temporale di espressione Chk1-S è interrotto; in altre parole, Chk1-S è alta in tutto il ciclo cellulare compresa la fase S, con conseguente blocco costante di Chk-1 e prematura ingresso mitotico, che porta alla catastrofe mitotica e ridotta proliferazione cellulare.

In conclusione, questo studio ha identificato una variante di giunzione di Chk1, Chk1-S, che è un regolatore chiave di Chk1 nel normale ciclo cellulare e durante la DDR (Appendice SI, Fig. 15). Nel ciclo cellulare imperturbabile, l’espressione di Chk1 aumenta alla fase S e alcune molecole di Chk1 potrebbero essere fosforilate da ATR impedendo il legame di Chk1-S, con conseguente elevata attività di Chk1 e mantenimento della fase S fino al completamento della replicazione del DNA. Nella fase G2, l’espressione di Chk1-S aumenta e, come riportato (29), la fosforilazione di Chk1 diminuisce, promuovendo un’interazione Chk1–Chk1-S per sopprimere l’attività di Chk1. La diminuzione dell’attività di Chk1 nella fase G2/M è fondamentale per l’ingresso mitotico. In condizioni di induzione o sovraespressione di Chk1-S, quantità eccessive di Chk1-S sequestrano Chk1 e diminuiscono la sua attività chinasica durante la fase S, con conseguente ingresso mitotico prematuro senza completamento della replicazione del DNA, portando alla catastrofe mitotica. Durante il danno al DNA, Chk1 è fosforilato, con conseguente diminuzione del legame Chk1-S, aumento dell’attività Chk1 e arresto G2 / M (appendice SI, Fig. 11). I nostri risultati supportano il meccanismo di “de-repressione” dell’attivazione di Chk1 (29). È importante sottolineare che Chk1-S sembra essere uno dei fattori chiave di repressione dell’attività di Chk1. Antagonizzando Chk1, Chk1-S può accelerare il ciclo cellulare, piombo alla proliferazione aumentata nei tessuti fetali e cancerosi. Alti livelli di Chk1 nelle cellule proliferanti coordinano la fase S e la mitosi, mentre alti livelli di Chk1-S possono fornire un potente interruttore per la transizione di fase da S a G2 / M. Al contrario, la sovraespressione forzata di Chk1-S a livelli eccessivi, sbilanciata da Chk1, induce l’ingresso mitotico prematuro e la morte cellulare (Fig. 2) e sopprime la crescita tumorale nei modelli di xenotrapianto tumorale (Fig. 4). Chk1 è stato suggerito di essere un bersaglio terapeutico efficace nella terapia del cancro, e inibitori Chk1 sono in fase di valutazione in studi clinici (40-43). L’identificazione di Chk1-S come inibitore endogeno di Chk1 può aprire nuove aree di ricerca nella regolazione del ciclo cellulare, nella risposta al danno al DNA e nella terapia del cancro.