CLARITY

a CLARITY technikával készített 3 dimenziós kép, amely 1 mm-es egér hippocampus szeletet mutat. A különböző színek fluoreszcens antitestekkel festett fehérjéket képviselnek. A gerjesztő idegsejteket zöld, a gátló idegsejteket piros, az asztrocitákat pedig Kék jelöli.

a CLARITY képalkotás alkalmazásának folyamata postmortem szövetmintával kezdődik. Ezután kémiai kezelések sorozatát kell alkalmazni az átlátszóság elérése érdekében, amelynek során a minta lipidtartalmát eltávolítják, miközben az eredeti fehérjék és nukleinsavak szinte mindegyike a helyén marad. Ennek célja, hogy a szövetet átlátszóvá tegye, és így alkalmas legyen az alkotó funkcionális részeinek (amelyek elsősorban fehérjék és nukleinsavak) részletes mikroszkópos vizsgálatára. Ennek megvalósításához a már létező fehérjeszerkezetet átlátszó állványzatba kell helyezni, amely megőrzi, miközben a lipid komponenseket eltávolítják. Ez az állványzat hidrogél monomerekből, például akrilamidból áll. Az olyan molekulák hozzáadása, mint a formaldehid, a paraformaldehid vagy a glutáraldehid megkönnyítheti az állványzat rögzítését a megőrzendő fehérjékhez és nukleinsavakhoz, és a hő hozzáadása szükséges a sejtkomponensek és az akrilamid közötti tényleges kapcsolatok megállapításához.

miután ez a lépés befejeződött, a célszövet sejtjeinek fehérje-és nukleinsavkomponensei szilárdan a helyükön maradnak, míg a lipidkomponensek leválasztva maradnak. A lipideket ezután 1-2 hét passzív diffúzió alatt eltávolítják detergensben,vagy elektroforetikus módszerekkel csak órákra vagy napokra gyorsítják. Ahogy áthaladnak, a mosószer lipofil tulajdonságai lehetővé teszik az út során tapasztalt lipidek felvételét és kivágását. A lipofil színezékeket DiI-ként eltávolítják, azonban vannak olyan egyértelműséggel kompatibilis lipofil színezékek, amelyek rögzíthetők a szomszédos fehérjékhez. A nem lipid molekulák, például a fehérjék és a DNS nagy többsége nem befolyásolja ezt az eljárást, köszönhetően az akrilamid gélnek és az érintett molekulák kémiai tulajdonságainak.

amint arról a kezdeti papír beszámolt, a szövet e folyamat során kitágul, de szükség szerint visszaállítható kezdeti méreteire a törésmutató-illesztési oldatban történő inkubálás utolsó lépésével.

a folyamat ezen szakaszára a mintát teljesen előkészítették a képalkotáshoz. A képalkotás kontrasztja származhat endogén fluoreszcens molekulákból, nukleinsav (DNS vagy RNS) címkékből vagy immunfestésből, amelynek során olyan antitesteket használnak, amelyek specifikusan kötődnek egy bizonyos célanyaghoz. Ezenkívül ezeket az antitesteket fluoreszcens címkékkel jelölik, amelyek a végső képalkotó eredmény kulcsa. A standard konfokális, kétfoton vagy fénylapos képalkotó módszerek mind alkalmasak a fehérje lokalizációjának skálájáig kibocsátott fluoreszcencia kimutatására, így a végső, rendkívül részletes és háromdimenziós képeket eredményezik, amelyeket a CLARITY hoz létre.

miután a mintát immunszinkronizálták egy képhez, lehetséges az antitestek eltávolítása és újak újbóli alkalmazása, ezáltal lehetővé téve a minta többszörös leképezését és több fehérjetípus megcélzását.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.