az 1938.évi amerikai élelmiszer -, gyógyszer-és kozmetikai törvény előírta, hogy a gyártók és a gyógyszeripari vállalatok felelősek legyenek a termékeikben található gyógyszeradalékok / segédanyagok biztonságáért, válaszul egy tragédiára, amelyben 100 gyermek halt meg egy antibakteriális termékben lévő dietilénglikol jelenléte miatt. Annak tisztázása érdekében, hogy mi szükséges egy új segédanyag létrehozásához, az FDA 2005-ben kiadott egy útmutató dokumentumot ‘nem klinikai vizsgálatok a gyógyszerészeti segédanyagok biztonsági értékeléséhez’ címmel,amely felvázolja a segédanyag jóváhagyásához szükséges biztonsági vizsgálatokat1, 2. A legújabb cikkek felhívták a figyelmet arra,hogy több alternatív segédanyagra van szükség a készítményekben való felhasználáshoz1,3, 4. A készítménykészítők általában a precedens segédanyagokat részesítik előnyben, mivel jól megalapozott biztonsági profiljuk, valamint az új segédanyag jóváhagyásával járó kockázatok és költségek miatt3. Új segédanyag minősítésekor biztonságossági vizsgálatokat kell végezni, és nemkívánatos esemény esetén kétség merül fel azzal kapcsolatban, hogy a nemkívánatos esemény a segédanyagnak vagy a terméknek köszönhető-e. Segédanyag alkalmazásakor, bár az injektálható beadási módokkal kapcsolatos korábbi tapasztalatok értékesek a használat igazolásában, érdemes megjegyezni,hogy a jelenlegi előírások szerint az alkalmazás útjának megváltoztatása vagy a koncentráció jelenlegi legmagasabb dózisán túli növelése további biztonsági adatokat igényelhet1, 2. Az új segédanyagok iránti igény jól ismert, de a kevésbé széles körben használt segédanyagok felhasználásával kapcsolatos ismereteink bővítése ugyanolyan fontos, miközben könnyebb szabályozási utat kínál előre.
a megfelelő pH és pufferrendszer meghatározása vitathatatlanul a legkritikusabb lépés a fehérje (kémiai és fizikai)oldhatóságának és stabilitásának biztosítása érdekében 3,5-7. A cikk a bioterapeutika stabilizálására összpontosít. Mind a kis molekulákban, mind a fehérje parenterális készítményekben megtalálható pufferek az FDA által jóváhagyott készítményeket hivatkozni fogják a ezen pufferek fehérjékre gyakorolt stabilizáló hatásainak feltárásának igazolására. Az 1. táblázat felsorolja az FDA által jóváhagyott termékek címkéin keresett egyedi készítmények számát. A generikus termékek összetételéből származó azonos készítményeket vagy a különböző dóziserősségeket kizárták. Amikor a puffer só formájára utalunk, a puffert nátrium-hidroxiddal vagy sósavval kell titrálni, mivel ezek a leggyakoribb titránsok.
a parenterális készítményekben leggyakrabban használt pufferek a citrát, a foszfát és az acetát voltak. Az ezekkel a segédanyagokkal kapcsolatos néhány erősséget és gyengeséget ki kell emelni. Ennek a cikknek az a célja, hogy felhívja a figyelmet más jóváhagyott, de ritkábban használt pufferszerekre, amelyek szélesebb körű felhasználást igényelnek ahhoz, hogy általánosan elfogadottá váljanak. Míg ez a cikk kizárólag a pufferekre összpontosít, ugyanez az érv vonatkozik más típusú segédanyagokra is. Ahogy a biotechnológia iparként fejlődik, és egyre több egyedi fehérje állványt fejlesztenek ki, egyre fontosabbá válik, hogy új módszereket találjunk ezeknek a fehérjéknek a stabilizálására. Néha a leggyakoribb segédanyagok nem elegendőek a megfelelő stabilitás biztosításához vagy a gyógyszeradagolási technológiák lehetővé tételéhez.
az AbbVie, a Vectura és a Bayer iparági szakértői a legújabb kerekasztalunk
keretében vitatják meg a legjobb gyakorlatokat és tapasztalataikat a digitális átalakulással kapcsolatban.tekintse meg az ‘Uncover the potential of your lab-discover how digital transformation can be annyival több, mint csupán betekintés’ című egyórás ülésünket, ahol a panel azt vizsgálja, hogy a digitális átalakulás hogyan segítheti a döntéshozatal felgyorsítását, a folyamatok optimalizálását és a működési hiányosságok megszüntetését. Meg fogja érteni, hogy az adatkezelési megoldás telepítése hogyan segített a szervezeteknek új módszertanok bevezetésében és a munkafolyamat-folyamatok átalakításában
nézze meg most
általánosan használt pufferek
nátrium-foszfát
nátrium-foszfát (pKa 2.1, 7.2 és 12.3) A parenterális készítményekben leggyakrabban használt puffer (1.táblázat). A foszfát pufferként történő felhasználásának legjelentősebb korlátozása a fagyasztás hatása a pH változásaira. a fagyasztás közbeni pH-elmozdulást alaposan tanulmányozták. A pH-eltolódást a kétbázisú só szelektív kristályosodásának tulajdonítják. A kristályosodást befolyásolhatja a fagyás sebessége, a kiindulási pH és más koszolutok jelenléte. Körülbelül két egység pH-változása meglehetősen jellemző a fagyasztás során, de a pH-érték 3,6 egységig történő eltolódásáról számoltak be8-10. A változó pH-környezet potenciálisan destabilizálhatja a fehérjét az ömlesztett hatóanyag feldolgozása vagy a gyógyszeroldatok liofilizálása során11-17. Ez leginkább olyan körülmények között vonatkozik, ahol magas foszfátkoncentrációkat alkalmaznak, vagy más kristályosító segédanyagok vannak jelen, mivel ezek a feltételek elősegítik a foszfátkristályosodás indukálását. A nagy koncentrációban fehérjét vagy nem kristályosodó oldott anyagokat (pl. szacharóz) tartalmazó oldatok gátolják a foszfát kristályosodását és minimalizálják a pH-eltolódást.
citromsav
a citromsav az egyik leggyakrabban használt puffer (1.táblázat). Ez egy háromértékű puffer, amely három karbonsavat tartalmaz, 3,1, 4,8 és 6,4 pKa-val (2.táblázat), széles pufferelési tartományt kínál5. Az FDA inaktív összetevő adatbázisa szerint a citrát több mint 100 jóváhagyott, injektálható termékben található meg, ami nagy használattörténetet biztosít és bizonyítja biztonságát.
a citrát-pufferelt készítmények szubkután injekcióit összehasonlító vizsgálatok azonban a foszfáttal vagy hisztidinnel pufferolt példabeszédekkel szemben megállapították, hogy a citrát-pufferolt oldatok több fájdalmat váltottak ki szubkután injekcióval18-20. Míg ez a fájdalom viszonylag rövid ideig tartott (kevesebb, mint két perc), aggályokat vet fel a citrátot tartalmazó önbeadó injekciók betartásával18. Citromsavval történő készítmény készítésekor fel kell jegyezni a céltermék profilját és a beadás tervezett módját. Gyakori subcutan injekciók esetén egy másik pufferelő szer megfelelőbb lehet.
ecetsav
az ecetsav pKa értéke körülbelül 4,8, pufferelési tartománya 3,7-5,6 (2.táblázat). Az ecetsav alkalmazása ideális a folyékony állapotban savas körülmények között stabil fehérjék előállítására. Az ecetsavoldatok liofilizálását a puffer Illékony savformájának szublimációja következtében a pH növekedése kíséri, a bázikus só mögött hagyva. Ez potenciálisan destabilizálja a fehérjét, és megnehezíti a liofilizált gyógyszerek pH-értékének szabályozását.
további jóváhagyott pufferek
trometamin
a trometamin (Tris) (pKa 8.1) hasonló tulajdonságokkal rendelkezik, mint a foszfát (pKa 7.2), és lehet használni, mint egy helyettesítő közelében semleges pH körülmények között. Mindkét puffer pH-változást mutat fagyasztás közben. Azonos körülmények között a trometamin (+2,1) pH-eltolódása körülbelül egyenlő volt a foszfátéval ( 1,8), de ellentétes irányban (2.táblázat)8.
az egyik puffer kiválasztása a másikkal szemben valószínűleg az egyes fehérje érzékenységétől függ a pH-eltolódás irányában és az esetleges specifikus fehérje-puffer kölcsönhatásoktól. A trometamin és a hisztidin jobb stabilizátoroknak bizonyult, mint a foszfát, amikor az eritropoetint magas hőmérsékleti stressznek vetették alá, és a kibontakozás reverzibilitásának elősegítésével megakadályozták az aggregációt.21. Kimutatták, hogy az Ure2p stabilabb a fibrillképződéssel szemben, ha trometaminban állítják elő, szemben a foszfát22-vel.
hisztidin
a hisztidin, egy esszenciális aminosav, egyre gyakoribbá válik a fehérje terápiák. 6,1-es pKa-val ideális a semleges körülmények közelében lévő fehérjekészítményekhez (2.táblázat).
kimutatták, hogy a hisztidin mind folyékony, mind liofilizált állapotban megvédi a monoklonális antitesteket a hőstressz ellen23-25. Az interferon-tau stabilitását vizsgáló vizsgálatok azt mutatták, hogy a hisztidint tartalmazó készítmények (majd Tris, majd foszfát) voltak a legstabilabbak a hő által kiváltott aggregációval szemben. Ezt a stabilizálódást a hisztidinnek a proteinhez való közvetlen kötődésének tulajdonították26. A liofilizálás során kimutatták, hogy a hisztidin és az aszparaginsav védi az antitesteket azáltal, hogy hidrogénkötéses donorként hat az intramolekulárisan tartósított (intraolecularis) 6-24-25. Ezenkívül a hisztidin antioxidáns tulajdonságokkal rendelkezik, mivel képes megkötni a vasionokat és a szingulett oxigénet24,27. A hisztidin használatának hátránya, hogy megfigyelték, hogy a hisztidin oldatok gyorsított hőmérsékleten és savas pH-érték mellett megváltoztatják a színt, valamint kivonják a vasat rozsdamentes acélból24.
Glükon -, tejsav-és borkősav
a Glükon -, tejsav-és borkősav olyan segédanyagok, amelyeket szinte kizárólag kis molekulájú készítményekben alkalmaztak. A kalcium-glükonátot engedélyezték a hidrogén-fluorid égési sérüléseinek kezelésére helyi alkalmazás útján. Súlyosabb esetekben négy százalékos kalcium-glükonát oldat infúzióját sóoldatban alkalmazták a szövetkárosodás megelőzésére28. Az FDA Inaktív összetevők adatbázisában található 23, a kereskedelemben kapható, tejsavat tartalmazó injekciós készítményből négy készítményt használnak biológiai célokra – két peptidet és két fehérjét. A borkősavat tartalmazó 12 készítmény közül csak egyet alkalmaztak fehérje képzésére. Ezek a pufferek az acetát és a citrát megfelelő helyettesítői lehetnek.
a glükonsav a glükóz oxidációjából természetesen képződő vegyület. Ez egy érdekes vegyület, mivel potenciálisan pufferként, stabilizátorként és kelátképző szerként működhet, mivel karbonsavakat és hidroxilcsoportokat tartalmazó szerkezettel rendelkezik.
kimutatták, hogy a tartarát javítja a monomer retencióját a citrát felett egy antitestkészítményben 4,0-4,5 pH-n, ha folyadékként tárolják 25 6c29-en. Feltételezték, hogy a tartarátban, citrátban, malátban, valamint a laktátban és glükonátban található hidroxilcsoportok stabilizáló hidrogénkötéseket biztosíthatnak a liofilizált torta30-31 amorf fázisában.
aszparaginsav és glutaminsav
mind az aszparaginsav, mind a glutaminsav olyan infúziókban található, amelyeket csecsemőknek és gyermekgyógyászati betegeknek adnak elégtelen aminosavkoncentrációval. A trofaminban az aszpartátot és a glutamátot 22 mM-es és 34 mM-es koncentrációban infundálják, azaz 32. Ezek a koncentrációk elég magasak ahhoz, hogy a fehérje készítmények megfelelő pufferelését biztosítsák.
a glutaminsav,ha egyenlő mennyiségű arginint tartalmaz,bizonyítottan javítja a sejten belüli proteinek23, 33 stabilitását és oldhatóságát, valamint megakadályozza az aggregációt a feloldás során23, 34-35. Az inzulinnal és a humán szérumalbuminnal végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a glutamát és az aszpartát hozzáadása gátolta az aggregátumok képződését36-38. A pegfilgrasztimmal végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a glutamátban vagy formiátban formulált pegfilgrasztim stabilitása hasonló volt az acetát39-hez.
Citromsavciklus intermedierek
citrát, fumarát, ketoglutarát, malát és szukcinát mind intermedierek a citromsavciklusban, amelyek biztonságosnak és hatásosnak bizonyultak pufferként vagy ellenionként injektálható készítményekben. A fumarátot, a ketoglutarát, a malátot és a szukcinátot korlátozott számú termékben használták (1.táblázat). Magától értetődik, hogy a Krebs-ciklus többi intermedierje is alkalmas lehet parenterális készítményekben történő alkalmazásra. Ezek közé a vegyületek közé tartozik az akonitát, az izocitrát és az oxaloacetát. Mivel kétértékű és háromértékű karbonsavak, a pKa-k 2,0-6,4 között mozognak, így ezek a vegyületek sokféle készítményre alkalmasak (2.táblázat).
ezeknek a vegyületeknek a pufferként való korlátozott használata miatt nem világos, hogy a citrát szubkután injekcióival járó injekcióknál ugyanaz a fájdalom társul-e ezekhez a vegyületekhez. Vannak azonban más előnyök is a használatukhoz. Kimutatták, hogy a citrát indukálja az antitest oldatok gélesedését, ha a fehérjekoncentráció 100 mg/mL felett volt. Ezt a puffer háromértékű jellegének tulajdonították. A csak két karbonsavval rendelkező szukcinátnak nem volt azonos hatása ugyanazon pH-N40.
következtetés
a megfelelő pH és pufferrendszer meghatározása kritikus fontosságú a bioterapeutika klinikára és piacra juttatásához. Nagyon kívánatos az új segédanyagok iránti igény, valamint a meglévő segédanyagok jobb megértése. A hisztidin, a trometamin és számos más alternatív puffer előnyös a hagyományos segédanyagokkal szemben. Ezeknek az alternatív puffereknek a használata nem tehet mást, mint segít a formulátorok eszközeinek bővítésében, és lehetővé teheti egy olyan terápia kifejlesztését, amely egyébként kudarcot vallott. A fejlesztés alatt álló fehérjeterápiák nagy számának stabilizálása érdekében minden megközelítésnek megfontolásra nyitva kell állnia.
1. Osterberg, R. E., Demerlis, C. C., Hobson, D. W., Mcgovern, T. J. (2011) A segédanyagok biztonsági értékelésének tendenciái. Int. J. Toxikológia. 30, 600-610
2. FDA (2005) útmutató az ipar számára: nem klinikai vizsgálatok a gyógyszerészeti segédanyagok biztonsági értékelésére
5. Stoll, V. S., Blanchard, J. S. (1990) Buffers: Principles and Practice. Módszerek az Enzimológiában. 182, 24-38
6. Trevino, Sr, Scholtz, J. M., Pace, C. N. (2008) a fehérje oldhatóságának mérése és növelése. J. Pharm. Sci. 97, 4155-4166
7. Wang, W., Nema, S., Teagarden, D. (2010) fehérje aggregáció-utak és befolyásoló tényezők. Int. J. Gyógyszerészet. 390, 89–99
8. Williams-Smith, D. (1977) Changes in Apparent pH on Freezing Aqueous Buffer Solutions and their Relevance to Biochemical Electron-Paramagnetic-Resonance Spectroscopy. Biochem. J. 167, 593-600.
27. Wade, A. M., Tucker, H.N. (1998) Antioxidant Characteristics of L-Histidine. J. Nutr. Biochem. 9, 308-315
32. B. Braun Medical Inc. TROPHAMINE – isoleucine, leucine, lysine acetate, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, cysteine hydrochloride, histidine, tyrosine, n-acetyl-tyrosine, alanine, arginine, proline, serine, glycine, aspartic acid, glutamic acid and taurine solution
34. Zhang M.Z., Wen J., Arakawa T., Prestrelski S.J. (1995) A New Strategy for Enhancing the Stability of Lyophilized Protein: The Effect of the Reconstitution Medium on Keratinocyte Growth Factor. Pharmacol. Res. 12, 1447–1452
36. Quinn, R., Andrade, J. D. (1983) a semleges Inzulinoldatok aggregációjának minimalizálása. J. Pharm. Sci. 72, 1472-1473
39. Piedmonte, D. M., Treuheit, M. J. (2008) a Neulasta (pegfilgrastim) megfogalmazása. ADV. Kábítószer-Szállítási Vélemények. 60, 50–58
41. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) a karbonsav—pufferek kristályosodási hajlamának előrejelzése fagyasztott rendszerekben – relevancia a fagyasztva szárításhoz. J. Pharm. Sci. 100, 1288–1293
42. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) a karboxil-és aminosav-pufferek termofizikai tulajdonságai nulla hőmérsékleten: A fagyasztott állapot stabilizálása szempontjából releváns. J. Phys. Kémia. B. 115, 7154-7164
A szerzőről
David Sek kémiai BS-jét a Bates Főiskolán, kémiai és kémiai biológiáját pedig a Northeastern Egyetemen szerezte. 10 éves formulatudós tapasztalattal rendelkezik, és az elmúlt nyolc évet a pfizernél töltötte, hogy tanulmányozza az új bioterapeutika stabilitását.