Yleiskatsaus Kemogenetiikkaan

sponsoroi sisältöä neurotieteen tekniikoiden merkittävästä kehityksestä johtuen tutkijat pystyvät nyt selektiivisesti hyödyntämään neurojärjestelmiä tietoisissa eläimissä kehittyvien menetelmien avulla, joita kutsutaan kemogenetiikaksi ja optogenetiikaksi. Nämä menetelmät auttavat tutkimaan hermoston piiri taustalla monimutkainen käyttäytymistä sairauksien ja terveyden.

Kemogenetiikka ja optogenetiikka osoittavat yhtäläisyyksiä niiden suhtautumisessa neuronien toimintaan; esimerkiksi molemmissa tekniikoissa ionikanavia tai muokattuja reseptoreita on tuotava tietyille aivoalueille plasmidiekspression tai virusvektorijärjestelmien kautta. Optogenetiikassa bakteerien valolle herkät ionikanavat on ilmaistava ja kuituoptiikkaa on myös myöhemmin käytettävä estämään tai aktivoimaan neuronien toimintaa In vivo tai in vitro (Boyden et al., 2005; Zhang et al., 2007).

vaikka tämä menetelmä tarjoaa ylivertaisen ajallisen kontrollin in vivo-neuronaaliaktiivisuudelle, sen tiedetään olevan luonnostaan invasiivinen ja vaativan kuituoptiikan istuttamista aivoihin. Kemogenetiikka taas ei tarvitse kroonista implanttia, vaan ylläpitää mahdollisuutta hallita hermosolujen toimintaa. Tämä saadaan aikaan antamalla ligandeja, jotka ovat selektiivisiä ionikanaville tai muokatuille reseptoreille, jotka ovat muuten inerttejä (Armbruster et al., 2007; Campbell & Marchant, 2018). Taulukossa 1 esitetään kemogenetiikan ja optogenetiikan pääpiirteet.

Taulukko 1. Kemogenetiikka vs. optogenetiikka

historia ja kehitys

RASSLs

Kemogenetiikalla tarkoitetaan ionikanavien tai geneettisesti muunnettujen reseptorien ja näitä reseptoreita aktivoivien selektiivisten ligandien käyttöä neuronien toiminnan manipuloinnin helpottamiseksi. Tässä yhteydessä g-proteiinikytketyt reseptorit (gpcrs) ovat johtaneet kemogenetiikan kehitystä, ja alkuperäinen paperi, jossa määritellään gpcrs: t, jotka reagoivat vain synteettisiin ligandeihin, julkaistiin vuonna 1998.

näitä reseptoreita – jotka tunnetaan pelkästään synteettisen ligandin (Rassl) Aktivoimina reseptoreina — sovellettiin tehokkaasti in vivo esimerkiksi sydämen toiminnan etäohjaamiseen. Tästä huolimatta Rassl: n käyttöä neurotieteessä on rajoittanut reseptorien endogeeninen aktiivisuus niiden erityisen ligandin puuttuessa ja ligandien farmakologinen vaikutus In vivo (Coward et al., 1998; Sternson & Roth, 2014).

Dreadd

viime vuosina on kehittynyt Designer-reseptoreita, jotka aktivoituvat yksinomaan Muuntohuumeilla (DREADD). Mutatoituneet ihmisen muskariinireseptorit, joita stimuloivat vain inertit ligandit, olivat ensimmäisiä kehitettyjä DREADDEJA (Armbruster ym., 2007). Useiden mutageneesikierrosten ja biologisesti inertin ligandin klotsapiini-n-oksidin (CNO) seulonnan avulla tunnistettiin muskariinireseptorit, jotka olivat kytkettyinä Gaq: n solunsisäiseen signalointireittiin.

tähän reittiin kytketyt reseptorit kykenevät aktivoimaan neuronien toimintaa vasteena CNO: lle. Pienet CNO-pitoisuudet aktivoivat kaikki kolme Gaq-Dreaddia-hM1Dq, hM3Dq ja Hm5dq (Roth, 2016). Lisäksi samassa tutkimuksessa kävi ilmi, että hM4Di ja hM2Di voivat estää hermosolujen toimintaa kytkemällä ne GAI: n solunsisäisiin signalointireitteihin. Nämä inhiboivat Dreaddit reagoivat myös CNO: Hon (Armbruster et al., 2007; kuva 1).

Kuva 1. DREADD ligandien vaikutusmekanismi. DREADD-ligandien sitoutuminen Gaq-Dreaddeihin aiheuttaa hermosolujen ampumista, kun taas sitoutuminen Gai-Dreaddeihin johtaa neuronien toiminnan estymiseen. Klotsapiini-N-oksididihydrokloridi ja DREADD-agonisti 21 ovat epäselektiivisiä MUSKARIINISIA DREADD-agonisteja, joten ne voivat aktivoida tai estää hermosolujen toimintaa riippuen ilmaistavasta reseptorista. Salvinoriini B on selektiivinen kord-reseptorille, joka on kytketty GaI-signalointiin, joten sitoutuminen johtaa hermojen toiminnan estymiseen. Kuvahyvitys: Tocris Bioscience

gaq-Dreaddien ja CNO: n välinen sitoutuminen aiheuttaa fosfolipaasi C: n (PLC) stimulaation, joka katalysoi fosfatidyyli-inositoli-4,5-bisfosfaatin (PIP2) muuntumista 1,2-diasyyliglyseroliksi (DAG) ja inositoli-1,4,5-trisfosfaatiksi (IP3). Sekä dag: lla että IP3: lla on toinen viestintätoiminto: jälkimmäinen sitoutuu reseptoreihinsa laukaisemaan Ca2+: n vapautumisen solunsisäisistä varastoista, kun taas edellinen stimuloi erilaisia proteiinikinaasi C: n (PKC) muotoja.

Gai-Dreaddien ja CNO: n välinen sitoutuminen estää adenylyylisyklaasin (AC) toimintaa, mikä johtaa solunsisäisten cAMP-pitoisuuksien pienenemiseen. Koska cAMP aktivoi sekä EPAC: n että proteiinikinaasi A: n (PKA), CNO: n vaikutus Gai-Dreaddeissa estää EPAC: n ja PKA: n signaloinnin alavirtaan (KS.Kuva 1).

CNO on klotsapiinin metaboliitti, tutkimusten mukaan kyseessä on kaksisuuntainen konversio ja CNO voi metaboloitua käänteisesti klotsapiiniksi. Kun CNO: ta annetaan DREADDs: n aktivoimiseen tarvittavina pitoisuuksina, klotsapiini pystyy tämän jälkeen aktivoimaan endogeenisia reseptoreita (Gomez et al., 2017). Klotsapiini-epätyypillinen psykoosilääke-vaikuttaa monenlaisiin kohteisiin ja johtaa moniin erilaisiin käyttäytymisvaikutuksiin.

rotilla, hiirillä,ihmisillä, kädellisillä ja marsuilla ilmenee kaikissa CNO: n palautuva metabolia klotsapiiniksi (Gomez et al., 2017; Manvich et al., 2018). CNO: n mahdollisen käänteisen metabolian seurauksena rakenne-aktiivisuussuhdetutkimuksissa on kehittynyt stabiileja, vaihtoehtoisia ligandeja.

voimakas DREADD ligandi-DREADD agonist 21 – analysoitiin aluksi hm3dq: ta vastaan. Hyväksytty lääke perlapiini tunnistettiin samassa tutkimuksessa voimakkaaksi hM3Dq-agonistiksi. Japanissa tämä lääke on hyväksytty sedatiiviseksi ja hypnoottiseksi (Chen et al., 2015). Sekä perlapine että DREADD agonist 21 on sittemmin osoitettu hm4di: n, hM3Dq: n ja hM1Dq: n voimakkaiksi agonisteiksi, joilla on vain vähän tai ei lainkaan off-target-aktiivisuutta. Lisäksi DREADD agonist 21 on testattu in vivo, jossa on osoitettu aktivoivan hM3Dq-ilmentäviä neuroneja ja estävän hm4di-ilmentävien neuronien toimintaa (Thompson et al., 2018).

muskariinireseptorin kehittymisen jälkeen κ-opioidireseptorista (KORD) on syntynyt inhiboiva DREADD. Tämän inhiboivan DREADD: n aktivoituminen tapahtuu ligandi salvinoriini B: n sitoutumisen kautta, jolloin neuronien toiminta estyy Gai-signaloinnin kautta. Jotta kaksisuuntainen ohjaus neuronien toimintaa, KORD voidaan käyttää rinnalla, aktivoimalla DREADDs kuten hM3Dq (Vardy et al., 2015).

jotkin yhteiset piirteet kaikissa Dreadeissa tekevät niistä soveltuvia sovellettavaksi neurotieteellisissä kokeissa. Ensinnäkin Dreadd ei reagoi endogeenisiin ligandeihin, koska niiden ligandeja sitovissa paikoissa on geneettisiä mutaatioita, jotka poistavat sidonnan, mikä merkitsee sitä, että DREADD: n toiminta johtuu ainoastaan tietyn DREADD-ligandin sovelluksista. Toiseksi Dreadd: n ilmentymisellä in vitro tai In vivo ei ole mitään vaikutusta lähtötilanteen käyttäytymiseen, neuronien toimintaan tai solujen toimintaan ennen DREADD-ligandin lisäämistä (Sternson & Roth, 2014).

PSAMs / PSEMs

Dreadd: t ja Rassl: t perustuvat GPCRs: ään, mutta neuronien toiminnan modulointiin on käytetty myös muunnettuja ionikanavia, jotka on nimetty farmakologisesti selektiivisiksi Aktuaattorimoduuleiksi (PSAM). PSAM: t perustuvat tutkimuksiin, joiden mukaan α7-nikotiinireseptorin (nachr) solunulkoinen ligandisitova domeeni on mahdollista siirtää muiden ligandisoituneiden ionikanavien ionihuokodomeen. Kun α7 nAChR-ligandisitova domeeni liitetään 5-HT3-reseptorin ionihuokodomeen, syntyy ionikanava, jolla on α7 NACHR-farmakologia, mutta jolla on 5-HT3-kationinjohtumisominaisuudet (Eiselé et al., 1993).

samoin α7 nAChR-ligandeja sitovan domeenin liittäminen kloridiselektiivisen glysiinireseptorin (GlyR) ionihuokodomeenin kanssa tuottaa ACh-reagoivan kloridikanavan (Grutter et al., 2005). Α7 nAChR-ligandisitova domeenin selektiivinen mutaatio tuottaa näin ollen PSAM-ionikanavia, joissa ei ole ACh-sidontaa, mutta jotka kuitenkin sitoutuvat selektiivisesti farmakologisesti selektiivisiksi Efektorimolekyyleiksi (PSEMs) kutsuttuihin yhdisteisiin.

PSAM-eli kimeeriset ionikanavat, jotka mahdollistavat anioni-tai kationinjohtavuuden säätelyn, on tuotettu yhdistämällä mutatoitunut α7 nAChR-ligandisitova domeeni (johon sisältyy kaksi tai yksi mutaatio) useiden erilaisten ligandisoituneiden ionikanavien ionihuokosdomeeni. Tällaisia PSAM-kimeerejä nimetään niiden mutaatioiden perusteella sekä linkitettyjen ionien pore domain — PSAML141F,Y115F-GlyR, PSAML141F-GlyR, PSAML141F,Y115F-GABAC ja PSAML141F, Y115F-5-HT3. 5-HT3: a sisältävät kimairat mahdollistavat neuronaalisen aktivaation, kun taas GABAC: ia ja GlyR: iä sisältävät kimairat ovat estäviä (KS.kuva 2) (Magnus et al., 2011; Sternson & Roth, 2014).

kuva 2. PSEMs: n vaikutusmekanismi. Aktivoivat PSAM: t koostuvat kationiselektiivisen kanavan ionihuokosdomeenin, kuten 5-HT3: n, kanssa liitetystä mutatoituneesta α7 nAChR-ligandisidosdomaanista. Psem: ien sitoutuminen aktivoiviin PSAM: iin johtaa kationien tulvaan ja neuronien aktivoitumiseen. Inhiboivat PSAM: t koostuvat mutatoituneesta α7 nAChR-ligandisitovasta domeenista, joka on liitetty anioniselektiivisen kanavan, kuten Glyrin, ioniporodomiiniin. Psem: ien sitoutuminen inhiboiviin PSAM: iin johtaa anionien tulvaan ja neuronien toiminnan estymiseen. Image credit: Tocris Bioscience

Scientific reviews for further reading

• Campbell & Marchant (2018) the use of chemogenetics in behavioral neuroscience: receptor variants, targeting approaches and caveats. Br J Pharmacol. 175, 994.
• Roth (2016) rasteja Neurotieteilijöille. Neuroni. 89, 683.
• Magnus ym. (2011) Chemical and genetic engineering of selective ligand-ion channel interactions. Tiede. 333, 1292.
• Sternson & Roth (2014) Kemogeneettisiä työkaluja aivotoimintojen tutkimiseen. Annu Rev Neurol. 37, 387.

1. Armbruster ym. (2007) kehittämällä Lukko sopivaksi avaimeen luodakseen perheen g-proteiineihin kytketyistä reseptoreista, jotka inertti ligandi aktivoi voimakkaasti. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5163.
2. Atasoy ym. (2012) nälän hermopiirin dekonstruktio. Luonto. 488, 172.
3. Boyden ym. (2005) Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, 1263.
4. Bradley & Tobin (2016) Design of next-generation g protein-coupled receptor drugs: linking novel pharmacology and in vivo animal models. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 56, 535.
5. Bradley ym. (2018) kemogenetiikan käyttö tutkii muskariinisten asetyylikoliinireseptorien fysiologisia rooleja keskushermostossa. Neurofarmakologia. 136, 421.
6. Chen ym. (2015) ensimmäiset rakenne-aktiivisuussuhdetutkimukset suunnittelureseptoreille, jotka aktivoituvat yksinomaan muuntohuumeilla. ACS Chem Neuroscience. 6, 476.
7. Coward ym. (1998) signaloinnin ohjaaminen erityisesti suunnitellulla Gi-kytketyllä reseptorilla. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 352.
8. Eiselé ym. (1993) Chimaeric nikotinic-serotonergic receptor yhdistää ligandisitoutumis-ja kanavaspesifisyydet. Luonto. 366, 479.
9. Ge et al. (2017) Glutamaterginen ennusteet entorhinal cortex dorsal dentate gyrus välittynyt yhteydessä aiheuttama uudelleen heroiinin etsivät. Neuropsykofarmakologia. 42, 1860.
10. Gomez ym. (2017) Kemogenetiikka paljasti: DREADD miehitys ja aktivointi kautta muunnettu klotsapiini. Tiede. 357, 503.
11. Grutter ym. (2005) molecular tuning of fast gating in pentameric ligand-gated ion channels. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 18207.
12. Jiang et al. (2018) kolinergiset hermosolut mediaalisessa septumissa ylläpitävät kroonisen tulehduksellisen kivun aiheuttamaa ahdistuksen kaltaista käyttäytymistä. Neurotutkija Lett. 671, 7.
13. Manvich ym. (2018) DREADD-agonisti klotsapiini N-oksidi (CNO) metaboloituu käänteisesti klotsapiiniksi ja tuottaa klotsapiinin kaltaisia interoseptiivisiä ärsykevaikutuksia rotilla ja hiirillä. Sci Rep. 8, 3840.
14. Rapanelli ym. (2017) histamiini modulaatio tyvitumakepiirien kehittämisessä patologinen grooming. Proc Natl Acad Sci USA. 114, 6599.
15. Sasaki ym. (2011) Oreksiinineuronien Farmakogeneettinen modulaatio muuttaa hiirillä Uni/herätystiloja. PLoS Yksi. 6, e20360.
16. Schwartz ym. (2017) Cortico-accumbens asetus lähestymistapa-välttäminen käyttäytyminen on muutettu kokemus ja krooninen kipu. Cell Rep. 19, 1522.
17. Thompson ym. (2018) DREADD agonist 21 (C21) on tehokas agonisti muskariinipohjaisille Dreaddeille in vitro ja In vivo. ACS Pharmacol Transl Sci. Epub edellä tulosta.
18. Vardy ym. (2016) uusi DREADD helpottaa Multiplex kemogenetic kuulustelu käyttäytymistä. Neuroni. 86, 936.
19. Varela ym. (2016) hippokampuksen aikariippuvaisen roolin seuraaminen muistissa rastaiden avulla. PLoS Yksi. 11, e0154374.
20. Zhang ym. (2007) multimodaalinen nopea optinen kuulustelu neuropiirien. Luonto. 446, 633.

tietoja Tocris Bioscience

Tocris Bioscience on luotettava korkean suorituskyvyn biotieteen reagenssien toimittaja, mukaan lukien reseptoriagonistit & antagonistit, entsyymin estäjät, ionikanavamodulaattorit, fluoresoivat anturit & väriaineet ja yhdistelmäkirjastot. Luettelomme koostuu yli 4500 tutkimusvälineestä, jotka kattavat yli 400 proteiinikohdetta, joiden avulla voit tutkia ja moduloida lukuisten signalointireittien ja fysiologisten prosessien toimintaa.

olemme työskennelleet tutkijoiden kanssa yli 30 vuotta tarjotaksemme life science-yhteisölle tutkimusstandardeja sekä uusia ja innovatiivisia tutkimusvälineitä. Ymmärrämme, että tutkijoiden on luotettava tutkimusreagensseihinsa, minkä vuoksi olemme sitoutuneet toimittamaan asiakkaillemme korkealaatuisia tuotteita, joten voit julkaista luottavaisin mielin.

Tocris kuuluu Bio-Technen proteiinitieteiden osastoon, johon kuuluvat myös luokkansa parhaat tuotemerkit R&D Systems, Novus Biologicals, ProteinSimple ja Advanced Cell Diagnostics. Bio-Techne on yhdistänyt nämä tuotemerkit tarjotakseen tutkijoille täyden valikoiman tutkimusreagensseja, määrityksiä ja proteiinialustoja. Lisätietoja Bio-Technesta ja sen tuotemerkeistä on osoitteessa bio-techne.com.

sponsoroidun sisällön politiikka: News-Medical.net julkaisee artikkeleita ja niihin liittyvää sisältöä, joka voi olla peräisin lähteistä, joissa meillä on olemassa kaupallisia suhteita, edellyttäen, että tällainen sisältö tuo lisäarvoa pääkirjoituksellisen eetoksen News-Medical.Net joka on kouluttaa ja tiedottaa sivuston kävijöitä kiinnostunut lääketieteellisestä tutkimuksesta, tiede, lääkinnällisiä laitteita ja hoitoja.

lainaukset