yksittäinen mutaatio kloramfenikoliasetyylitransferaasin erittäin säilyneellä alueella mahdollistaa Isobutyyliasetaatin tuotannon suoraan selluloosasta Clostridium thermocellumin avulla korkeissa lämpötiloissa

bakteerikannat ja plasmidit

bakteerikannat ja plasmidit, joita käytetään tutkimus on lueteltu taulukossa 2. Esterin valmistuksessa korkeissa lämpötiloissa käytettiin isäntänä Clostridium thermocellum DSM1313 ∆hpt (M1354) – kantaa. On huomattava, että hypoksantiinifosforibosyylitransferaasigeenin (HPT, Clo1313_2927) poisto villissä dsm1313-tyypissä mahdollistaa geenitekniikan 8-atsahypoksantiinin (8-AZH) vastavalinnalla; tällä poistolla ei ole mitään tunnettua haitallista vaikutusta solujen kasvuun ja aineenvaihduntaan . Plasmidi pNW33N, joka sisältää Catsaa, on termostabiili ja sitä käytettiin erilaisten kissojen ilmaisemiseen C. thermocellumissa. PET-plasmideja käytettiin molekyylien kloonaukseen ja entsyymiekspressioon E. colissa.

kemikaalit ja reagenssit

kaikki kemikaalit on ostettu Sigma-Aldrichilta (Mo, USA) ja/tai Thermo Fisher Scientificiltä (MA, USA), ellei muualla ole mainittu. Molekyylikloonausta varten saatiin restriktioentsyymejä ja T4-ligaasia New England Biolabsilta (MA, USA). Phusion Hot Start II-DNA-polymeraasia käytettiin polymeraasiketjureaktiossa (PCR).

elatusaineet ja viljely

Molekyylikloonauksessa ja proteiinien ilmentymisessä E. coli-kantoja kasvatettiin lysogeny-liemessä (LB), joka sisälsi sopivia antibiootteja, ellei toisin mainittu. CATSa: n in vivo-karakterisointiin E. coli-bakteerissa käytettiin M9-hybridiväliainetta, jossa oli 20 g/L glukoosia. C. thermosellum-viljelmälle käytettiin kokeissa määriteltyä MTC minimal mediumia tai CTFuD-NY mediumia. Optinen tiheys (od) mitattiin spektrofotometrillä 600 nm: n aallonpituudella (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

Multiple sequence alignment analysis

Multiple sequence alignment (MSA) analysis suoritettiin käyttäen MEGA7: ää . Proteiinisekvenssit linjasi ClustalW ja visualisoi ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr). 3u9f: n , 4CLA: n ja 2XAT: n tärkeimmät ominaisuudet proteiinirakenteissa uutettiin vastaavasti cat_saltista , CAT3_ECOLIX: stä ja CAT4_PSEAE: sta.

Molekyylimallinnus-ja telakointisimulaatiot

kolmiulotteiset (3D) rakenteet

catsan ja kiinnostavien alkoholien 3D-rakenne luotiin ensin Sveitsiläismallilla ja Moe: n ”rakentaja” – työkaluilla (Molecular Operating Environment software, versio 2019.01). Kahden substraatin muodostaman CATSa-kompleksin (eli asetyyli-CoA-isobutanoli–CATSa) 3D–rakenne saatiin uuttamalla isobutanoli–CATSa-kompleksista ja lisäämällä se sitten asetyyli–CoA-CATSa-kompleksiin. Kaikki rakenteet valmistettiin Moe:n quickprep-työkalulla oletusparametreilla ja optimoitiin edelleen energian minimoinnilla Amber10: EHT-voimakentän avulla.

Telakointisimulaatio

telakointisimulaatioiden suorittamiseksi mahdollinen sidontatasku etsittiin MOE: n ”Site Finder” – työkalulla. Jatkotutkimuksiin valittiin parhaiten pisteytetty alue, joka oli yhdenmukainen ilmoitettujen katalyyttialueiden kanssa. Telakointisimulaatiot tehtiin edellä kuvatulla tavalla . Lyhyesti asetyyli-CoA ja jokainen alkoholi telakoitiin indusoidun fit-protokollan avulla Triangle Matcher-sijoitusmenetelmällä ja Lontoon ΔG-pisteytysfunktiolla. Telakointisimulaatioiden jälkeen valittiin parhaiten pisteytetty sitova asento, joka osoittaa jäännöksen ja substraatin ratkaisevan vuorovaikutuksen juurikeskiarvon neliöpoikkeamassa (rmsd) < 2 Å. Esimerkkinä asetyyli-CoA-telakoinnille valittiin ser-148: n hydroksyylin ja CoA: n N71: n välinen vetysidos . Alkoholitelakointiin valittiin sitova asento, joka osoittaa vetysidoksen His-189: n N3: n ja alkoholin hydroksyylin välillä .

silico-mutageenianalyysi

silico–mutageenianalyysi asetyyli–CoA-isobutanoli-CATSa-kompleksista tehtiin edellä kuvatulla tavalla . Erityisesti MOE: n alaniiniskannaus-ja jäännöskannausvälineitä käytettiin mahdollisten mutageenisten jäämäehdokkaiden tunnistamiseen.

Molekylaarinen Kloonaus

Plasmidirakenne

plasmidit rakennettiin ligaasiriippuvaisen menetelmän standardilla molekyylikloonaustekniikalla ja/tai Gibson-kokoonpanolla käyttäen lisätiedostossa 1 (taulukko S1) lueteltuja alukkeita. Rakennetut plasmidit kulkeutuivat E. coli TOP10-bakteeriin lämpöshokkimuunnoksen kautta. Selektiiviselle levylle eristetyt pesäkkeet seulottiin PCR: llä ja plasmidi puhdistettiin. Puhdistetut plasmidit varmistettiin Sanger-sekvensoinnin avulla ennen kuin ne muutettiin E. coli BL21: ksi (DE3). Site-directed mutagenesis suoritettiin käyttäen QuickChange™ site-directed mutagenesis protokolla vähentää päällekkäisyyksiä pituus tai Gibson kokoonpano menetelmä . C. thermocellum engineering, plasmidi pHS005 rakennettiin ensin ja sitten muunnettiin pHS0024. pHS0024: llä ei ole hyperparatyreoosia operonin alajuoksulla, kun taas plasmidin muut sekvenssit ovat identtisiä pHS005: n kanssa.

transformaatio

E. coli-bakteerin transformaatioon ja C. thermosellum-bakteerin transformaatioon käytettiin tavanomaisia kemiallisia transformaatio-ja elektroporaatiomenetelmiä. C: Lle. thermocellum, menetelmä, kuitenkin, oli hieman muutettu tässä kuvatulla tavalla. Ensinnäkin C. thermocellum M1354 (Taulukko 2) viljeltiin 50 mL: ssa ctfud-NY-kasvualustaa 50 °C: ssa anaerobisessa kammiossa (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., TAI, YHDYSVALLAT). Soluviljelmä, jossa OD oli välillä 0,8–1,0, jäähdytettiin huoneenlämmössä 20 minuutin ajan. Tämän jälkeen kaikki vaiheet suoritettiin istuntosalin ulkopuolella. Jäähdytetyt kennot kerättiin 6500×g: n ja 4 °C: n lämpötilaan 20 minuutin ajaksi. Solupelletit pestiin kahdesti jääkylmällä Milli-Q-vedellä ja suspendoitiin uudelleen 200 µL: aan muunnospuskuria, joka koostui 250 mM sakkaroosista ja 10% (v/v) glyserolista. Useita sähkökäyttöisten solujen 30 µL: n alikiintiöitä varastoitiin välittömästi − 80 °C: n lämpötilaan jatkokäyttöä varten. Elektroporaatiota varten sähkösolut sulatettiin jäällä ja inkuboitiin 500-1000 ng: lla metyloituja plasmideja 10 minuutin ajan. Sitten solut siirrettiin jääkylmään 1 mm: n aukon elektroporaatiokuvetteen (BTX Harvard Device, MA, USA), jota seurasi kaksi peräkkäistä eksponentiaalista hajoamispulssia 1.8 kV, 350 Ω ja 25 µF. Pulssit johtivat yleensä 7,0-8,0 ms-aikavakioon. Solut suspendoitiin välittömästi uudelleen esilämmitettyyn tuoreeseen CTFuD-NY: hen ja otettiin talteen 50 °C: n lämpötilassa anaerobisessa tilassa (90% N2, 5% H2 ja 5% CO2) kumikantaisen Paaliputken sisällä. 0-12 tunnin palautumisen jälkeen solut sekoitettiin sulaan ctfud-NY agar-väliaineeseen, johon lisättiin 15 µg/mL tiamfenikolia. Lopuksi keskisoluinen seos kaadettiin petrimaljaan ja jähmettyi anaerobikammioon. Levyä inkuboitiin 50 °C: ssa jopa 1 viikko, kunnes pesäkkeitä ilmaantui. Muunnostehokkuus oli 2-100 pesäkettä muodostavaa yksikköä µg plasmidia kohti (PMY/µg plasmidia).

Catsan ja sen muunnosten in vivo-karakterisointi E. coli-bakteerissa

Catsan ja sen muunnosten in vivo-karakterisointi E. coli-bakteerissa tehtiin aiemmin kuvatulla tavalla suurisoluisilla viljelmillä, joihin lisättiin 2 g/L erilaisia alkoholeja. Estereiden in situ-uuttamisessa jokainen putki päällystettiin 25-prosenttisella (v/v) heksadekaanilla. Catsa: n ja sen muunnosten proteiiniekspression varmistamiseksi 1% (v/v) kantasoluista kasvatettiin yön yli 37 °C: n lämpötilassa ja 200 kierrosta minuutissa 15 mL: n viljelyputkissa, jotka sisälsivät 5 mL LB-liuosta ja antibioottia. Tämän jälkeen 4% (v/v) yön yli kestäneistä viljelmistä siirrettiin 1 mL: aan antibioottia sisältävää LB-liuosta 24-kuoppaiseen mikrotiitteriin. Viljelmiä kasvatettiin 37 °C: ssa ja 350 rpm: ssä inkuboivalla mikrotiitteriraketilla (Fisher Scientific, PA, USA), kunnes OD saavutti arvon 0,4–0,6 ja indusoitui sitten arvoon 0.1 mM: n isopropyyli-β-d-1-tiogalaktopyranosidi (IPTG) 4 tunnin ajan hengittävällä, helposti Tiivistettävällä kalvolla haihtumisen ja ristikontaminaation estämiseksi (cat# 50-550-304, Research Products International Corp., IL, USA). Proteiininäytteet otettiin valmistajan ohjeiden mukaan käyttämällä täydellistä B-PER-reagenssia (cat# 89822, Thermo Scientific, MA, USA) ja analysoitiin SDS-Pagen toimesta.

entsyymin Luonnehdinta

His-tagin puhdistus

entsyymin ilmentymistä varten yön yli kestäneeseen viljelmään inokuloitiin 1:Suhde 50 tuoreessa LB-elatusaineessa, joka sisältää 1 mM IPTG: tä ja antibioottia, minkä jälkeen inkuboidaan 18 °C: ssa yön yli (enintään 20 h) ravistelevassa inkubaattorissa 200 rpm: n nopeudella. Indusoidut solut kerättiin sentrifugoimalla 4 °C: ssa ja 4700×g: ssa 10 minuutin ajan. Solupelletti pestiin sitten kerran Millipore-vedellä ja suspendoitiin uudelleen täydelliseen B-PER-reagenssiin. Kun seosta oli inkuboitu 30 minuuttia huoneenlämmössä, sitä sentrifugoitiin 17 000×g: n tarkkuudella 2 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin ja nimettiin raakauutteeksi. His-tagin puhdistusta varten raakauute inkuboitiin hispur Ni–NTA superflow-agaroosilla valmistajan suosittelemassa erässä. Sitten hartsi pestiin vähintään kolmella tilavuudella pesupuskuria, jotka koostuivat 50 mM Tris–HCl: stä (pH 8,0), 300 mM NaCl: stä, 10 mM imidatsolista ja 0,1 mM EDTA: sta. Hartsisidotut proteiinit eluoitiin 300 µL eluutiopuskurilla, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl: ää (pH 8,0), 50 mM NaCl: ää, 300 mM imidatsolia ja 0,1 mM EDTA: ta. Eluoitu näyte suolattiin ja konsentroitiin Amicon-suodatinkolonnin kautta, jonka molekyylipaino oli 10 kDa. Lopuksi proteiininäyte suspendoitiin 200 µL: aan 20 mM: n Tris–HCl-puskuria (pH 8.0). Proteiinipitoisuus mitattiin Bradford-määrityksellä, jossa vertailuproteiinina käytettiin naudan seerumialbumiinia (BSA).

terminen siirtymämääritys

proteiinin sulamislämpötilan (Tm) mittaamiseksi käytettiin sypro Orangella termofluorimääritystä . Noin 10-250 µg His-tag puhdistettua proteiinia sekoitettiin 5× SYPRO Orangen kanssa 50 µL lopulliseen tilavuuteen 96-kuoppaisella qPCR-levyllä. Levy sinetöitiin PCR-korkilla ennen määrityksen suorittamista. Määrityksessä käytettiin StepOne-reaaliaikaista PCR-laitetta (Applied Biosystems, CA, USA) seuraavien parametrien avulla: ROX reporter, 1 °C: n lisäys sykliä kohti, 1-min pito jokaisessa syklissä ja lämpötila-alue 20-98 °C. tiedot kerättiin, vietiin ja käsiteltiin TM: n laskemiseksi.

5,5 ’ -ditiobis-(2-nitrobentsoehappo) (DTNB) – määritys

kunkin kissan reaktionopeus määritettiin DTNB-määrityksellä 384-kuoppalevyllä. Reaktion kokonaistilavuus oli 50 µL reaktiopuskurin koostuessa 50 mM Tris–HCl: stä (pH 8.0). Asetyyli-CoA: n (CoALA Biosciences, TX, USA) ja alkoholien pitoisuudet vaihtelivat kunkin kokeen mukaisesti. Kloramfenikolin ja alkoholien reaktioissa käytettiin lopullisia entsyymipitoisuuksia 0, 05 µg/mL ja 10 µg/mL. Reaktiokinetiikka kerättiin mittaamalla absorbanssi 412 nm: ssä joka minuutti 1 tunnin ajan 50 °C: n lämpötilassa mikrotiitterilukijalla (Synergy HTX microplate reader, BioTek). Reaktionopeus laskettiin käyttäen ekstinktiokerrointa vapaan koentsyymi A: n (MP Biomedicals, OH, USA) standardikäyrästä samassa tilassa. On huomattava, että koska levylukijalle suositeltu enimmäiskäyttölämpötila on 50 °C, CAT: lle korkeissa lämpötiloissa tehty suurikapasiteettinen entsyymimääritys tehtiin vain entsyymin kinetiikkaparametrien määrittämiseksi.

kineettisten parametrien laskeminen reaktionopeuksille

Michaelis–Menten-nopeuslain parametrit (ekv. 1) laskettiin kullekin entsyymille seuraavasti. Ensin suoritettiin lineaarinen regressio mikrotiitterilukijalta kerätyille tiedoille, jotta voitiin tunnistaa ensireaktionopeudet \(y_{i}\) eri alustapitoisuuksilla \(s_{i}\), missä i = {1,2,…, n} on kerättyjen datapisteiden lukumäärä. Sitten nämä ensireaktionopeudet ja niihin liittyvät substraattipitoisuudet kaikille rinnakkaisnäytteille sopivat samanaikaisesti Michaelis-Menten-malliin (Eq. 1) Käyttämällä vankkaa epälineaarista regressiota (Eq. 2) pehmeä-L1-tappio estimaattori (Eq. 3) kuten toteutetaan scipy numeerinen tietojenkäsittely kirjasto v1. 2. 0 :

pienimmän neliösumman ongelma määrittää parametrit \(K_{\text{m}}\) ja \(v_{ \text{max} }\) minimoimalla mallin ennustettujen reaktionopeuksien \(v_{i}\) ja mitattujen reaktionopeuksien \(y_{i}\) (Eq. 2). Tasoitusfunktiota \(\rho \left (z \right)\) käytetään, jotta pienimmän neliösumman ongelma kestää poikkeavia (Eq. 3). Ennakkoluulottoman vastustuksen ja tavanomaisten linearisointimenetelmien aiheuttamien virheiden välttämisen vuoksi vankka epälineaarinen regressio tarjoaa Michaelis-Menten-mallin tarkimman parametriarvion .

Isobutyyliasetaatin tuotanto C. termosellum

Sellobioosikäyminen

isobutyyliasetaatin tuotanto sellobioosista C. termosellumikannoissa suoritettiin kaksivaiheinen biokonversion konfiguraatio. Soluja viljeltiin ensin MTC: n minimaalisessa väliaineessa, joka sisälsi 5 g/L sellobioosia kumikantaisessa Paaliputkessa, kunnes OD oli 0,8–1.0. Kennoja jäähdytettiin huoneenlämmössä 20 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 4700×g: n ja 4 °C: n lämpötilaan 20 minuutin ajan. Supernatantin poistamisen jälkeen solut suspendoitiin uudelleen samaan tilavuuteen tuoretta MTC-vähimmäisainetta, joka sisälsi 2 g/L isobutanolia anaerobisessa kammiossa. Tämän jälkeen solususpensio jaettiin 800 µL: aan 2,0 mL: n kierrekorkillisessa mikrosentrifugiputkessa, jossa oli 200 µL heksadekaanikerros. Soluja inkuboitiin 55 °C: ssa 24 tunnin ajan, minkä jälkeen analysoitiin kaasukromatografia yhdessä massaspektrometrin (GC/MS) kanssa tuotetun isobutyyliasetaatin määrän määrittämiseksi.

Selluloosakäyminen

selluloosakäymisessä käytettiin modifioitua MTC-alustaa (C-MTC-alustaa). 20 g/L Avicel PH-101: tä käytettiin ainoana hiililähteenä sellobioosin sijaan, ja 10 g/L MOPSIA lisättiin puskurikapasiteetin lisäämiseksi. Alkuperäinen pH säädettiin 7,5 by 5 M KOH ja autoklavoitu. Anaerobisessa kammiossa 0, 8 mL yön yli soluviljelyä inokuloitiin 15, 2 mL:aan C-MTC-väliainetta (inokulaatiosuhde 1: 20) ja 4 mL: aan päällekkäin asetettua heksadekaania. Jokaisessa putkessa oli pieni magneettisekoitinpalkki selluloosan homogenoimiseksi. Kumikantainen Paalausputki inkuboitiin vesihauteessa, joka oli liitetty 55 °C: n lämpötilansäätimeen ja magneettiseen sekoitusjärjestelmään. PH: n säätämisen jälkeen 70 µL: lla 5 M KOH–injektiota otettiin 800 µL soluviljelmää ja 200 µL heksadekaanikerrosta 12 tunnin välein. viljelmän pH pysyi 6,4-7,8: ssa käymisen aikana.

solujen kasvua seurattiin mittaamalla pellettiproteiinia. 800 µL: n näytteenottomäärästä peräisin oleva solu–selluloosaselletti pestiin kahdesti Milli-Q-vedellä ja suspendoitiin 200 µL: n lyysipuskurilla (0.2 M NaOH, 1% SDS), jota seuraa tunnin inkubaatio huoneenlämmössä. Tämän jälkeen liuos neutraloitiin 50 µL: lla 0,8 M HCl: ää ja laimennettiin 550 µL: lla vettä. Seosta sentrifugoitiin 17 000×g: n tarkkuudella 3 minuutin ajan. Supernatantin proteiinipitoisuus analysoitiin pesuaineyhteensopivalla Bradford assay-menetelmällä (Thermo Scientific, WA, USA). Jäljelle jäänyttä pellettiä keitettiin 98-asteisessa uunissa tunnin ajan ennen jäljelle jääneen selluloosan määrittämistä.

selluloosan jäännös kvantifioitiin fenoli–rikkihappo-menetelmällä tietyin muutoksin. Keitetty näyte pestiin kahdesti Milli-Q-vedellä ja suspendoitiin 800 µL: aan vettä, jotta tilavuus vastasi alkuperäistä. Näyte homogenoitiin pipetoimalla ja pyörteistämällä 10 sekunnin ajan, ja 20 µL homogenoitua näytettä siirrettiin uuteen 2,0 mL: n mikrosentrifugiputkeen tai 96-kaivolevyyn ja kuivattiin yön yli 55 °C: n uunissa. Kuivattu pelletti suspendoitiin 200 µL: aan 95-prosenttista rikkihappoa ja inkuboitiin tunnin ajan huoneenlämmössä. Kun pelletti oli liuennut kokonaan, siihen lisättiin 20 µL 5-prosenttista fenolia ja se sekoitettiin rikkihappoliuokseen. 30 minuutin huoneenlämmössä tapahtuneen inkubaation jälkeen 100 µL näytettä siirrettiin uudelle 96-kuoppalevylle ja absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä. Absorbanssi muunnettiin selluloosakonsentraatioksi samalla menetelmällä käsitellyn AVICELIN PH-101: n standardikäyrällä.

analyysimenetelmät

korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC)

solunulkoiset metaboliitit määritettiin käyttämällä korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) (Shimadzu Inc., MD, YHDYSVALLAT). 800 µL viljelmänäytteitä sentrifugoitiin lämpötilassa 17 000×g 3 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantit suodatettiin 0,2 µm: n suodattimien läpi ja ne valutettiin 10 mN H2SO4-liikkuvalla faasilla nopeudella 0,6 mL/min Aminex HPX-87H: lla (Biorad Inc., CA, USA) kolonni 50 °C: ssa.taitekerroin-detektoria (rid) ja ultravioletti-detektoria (UVD) 220 nm: ssä käytettiin sokerien, orgaanisten happojen ja alkoholien pitoisuuksien seurantaan.

kaasukromatografia yhdistettynä massaspektroskopiaan (GC/MS)

esterit mitattiin GC: llä (HP 6890, Agilent, CA, USA), joka oli varustettu MS: llä (HP 5973, Agilent, CA, USA). GC-järjestelmässä analyyttien erottamiseen käytettiin zebron ZB-5: n (Phenomenex, CA, USA) kapillaarikolonnia (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) ja kantajana heliumia, jonka virtausnopeus oli 0,5 mL/min. Uunin lämpötilaohjelma asetettiin seuraavasti: 50 °C alkulämpötila, 1 °c/min ramppi 58 °C: een asti, 25 °c/min ramppi 235 °C: een asti, 50 °C/min ramppi 300 °C: een asti ja 2-min paistojakso 300 °C: ssa. 1 µL näytettä heksadekaanikerrosta ruiskutettiin kolonniin splitless-tilassa injektorin lämpötilan ollessa 280 °C. MS-järjestelmässä estereiden havaitsemiseen ja kvantifiointiin käytettiin valittua ionimoodia (SIM) seuraavien parametrien kanssa: i) etyyliasetaatti, m/z 45.00 ja 61.00 4.2-4.6 min retentioaika (RT), ii) isopropyyliasetaatti, m/z 45 ja 102 4.7-5.0 min RT, iii) propyyliasetaatti, m/z 59 ja 73 5.2-5.8 min RT, iv) etyyli-isobutyraatti, m/z 73 ja 116 6.1-6.6 min rt, v) isobutyyliasetaatti, m/z 61 ja 101 6.6-7.6 min rt, VI) butyyliasetaatti, M/Z 61 ja 116 7.7-9.2 min rt, VII) isobutyyli-isobutyraatti, m/z 89 ja 129 10.1-12.Sisäisinä standardianalyyteinä käytettiin 5 min RT, (viii) bentsyyliasetaatti, m/z 108 ja 150 13,1-13,8 min RT ja (ix) 2-fenetyyliasetaatti, m/z 104 ja 121 13,8-15,5 min RT. Esterit tunnistettiin RT: llä ja kvantifioitiin huippualueiden ja standardikäyrien avulla. Standardikäyrät määritettiin käyttämällä heksadekaaniksi laimennettuja puhtaita estereitä pitoisuuksina 0,01 g/L, 0,05 g/L, 0,1 g / L, 0,5 g / L ja 1 g/L.