vasta-aineita
Dynabeadeihin konjugoitua kanin IgG: tä (Sigma) käytettiin hanalla merkittyjä kantoja vastaan, joissa kohderyhmänä oli proteiini A: ta sisältävä TAP-tagi. Millipore 07-729-vasta-ainetta käytettiin K562-näytteisiin, jotka kohdistettiin CTCF: ään.
Tn5 puhdistus
TN5 e54k E110K P242A L372P14 pET-45b ( + )-vektorissa määrättiin (GenScript) ilmaisemaan hyperaktiivista Tn5: tä n-päätteisellä His6-tagilla. Plasmidi on saatavilla osoitteessa Addgene (Addgene ID: 112112). BL21 (DE3) – kompetentit E. coli-solut (New England Biolabs) muunnettiin ja yksi pesäke kasvatettiin 37 °C: n lämpötilassa OD600: aan 0, 4/500 ml: ssa lb + 50 µg/ml ampisilliiniä + 30 µg / ml kloramfenikolia. Solut siirrettiin 25 °C: n inkubaattoriin ja indusoitiin 0,5 mM: n isopropyyli-β-D-galaktopyranosidilla 4 tunnin ajan. solut kerättiin sentrifugoimalla, pestiin kerran ST-puskurilla ja solupelletti salamajäädytettiin nestemäiseen typpeen.
Tn5 puhdistettiin aiemmin kuvatulla tavalla 10 pienin muutoksin. Solut suspendoitiin lyhyesti 10 tilavuuteen (ml/g) TEGX100-puskuria (20 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glyserolia, 0, 1% Triton-X 100), jotka sisälsivät CPI: tä ja 100 µM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, ja lysotoitiin inkuboimalla lysotsyymillä (Sigma; 1 mg / 1 g solupellettiä) huoneenlämmössä 30 minuutin ajan. Lysaattia sentrifugoitiin 20 000 × g: n lämpötilassa 20 minuutin ajan 4 °C: ssa ja supernatantti saostettiin 0,25-prosenttisella polyetyleeni-imiinillä (Sigma) ja sentrifugoitiin 10 000 × g: n lämpötilassa 15 minuutin ajan. Tämän jälkeen supernatantti saostettiin 47% kylläisyydellä ammoniumsulfaatilla (0.28 g / ml) 30 minuutin inkubaation aikana, minkä jälkeen sentrifugoidaan 20 000 × g: n tarkkuudella 15 minuutin ajan.
pelletti suspendoitiin sitten uudelleen 50 ml: aan nikkelin Affiniteettikuormapuskuria (50 mM kaliumfosfaatti, pH 7, 4, 50 mM KCl, 20% glyserolia) ja ladattiin HisTrap HP-kolonniin (GE Healthcare; 5 ml), jonka pitoisuus oli 1, 5 ml/min tasapainotettu samalla puskurilla. Kolonni pestiin peräkkäin Pesupuskurilla I (50 mM kaliumfosfaatti, pH 7,4, 1 M KCl, 50 mM imidatsoli, 20% glyserolia), Pesupuskuri II (50 mM kaliumfosfaatti, pH 7.4, 500 mM KCl, 50 mM imidatsoli, 20% glyserolia), minkä jälkeen Tn5 eluoitiin nikkelin Affiniteettieluutiopuskurilla (50 mM kaliumfosfaatti, pH 7, 4, 500 mM KCl, 500 mM imidatsoli, 20% glyserolia) 2 ml/min. Eluaatti laimennettiin Laimennuspuskurilla 300 mM: n KCl: ään (50 mM kaliumfosfaatti, pH 7, 4, 20% glyserolia) ja lopullinen tilavuus säädettiin 50 ml: aan TEGX300-puskurilla (20 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glyserolia, 0, 1% Triton-X 100).
seuraavaksi näyte ladattiin HiTrap-hepariinin HP-kolonniin (GE Healthcare; 1 ml), joka oli tasapainotettu TEGX300: lla 1 ml/min. Kun puskuria oli pesty 5 kolonnitilavuudella, eluoitiin 10 ml: n lineaarinen (300 mM-1,2 M) NaCl-gradientti. TN5 eluoitu kolonnista noin 600 mM NaCl: llä. Pääeluutiopiikin sisältävät fraktiot yhdistettiin (3, 5 ml) ja dialysoitiin yön yli 30% glyserolia sisältävää Tegx300-puskuria vastaan, minkä jälkeen ne varastoitiin -80 °C: ssa.
Hiivakromatiinivalmiste
hanalla merkittyjä Saccharomyces cerevisiae-kantoja (avoimia Biosystemejä) kasvatettiin 500 ml: ssa hiivapeptonidekstroosi-ainetta OD600 = 0, 8: aan 25 °C: ssa. Solut ristisidottiin formaldehydiin 1%: n lopullisena pitoisuutena 15 minuutin ajan huoneenlämmössä ja sammutettiin 125 mM: n glysiinipitoisuudella 5 minuutin ajan. Solut kerättiin sentrifugoimalla, ja ne pestiin 1 ml: ssa ST-puskuria (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) 4 °C: ssa ja jaettiin kahteen osaan. Kennot pelletoitiin uudelleen, supernatantti poistettiin ja pelletti salamajäädytettiin.
250 ml: n viljelmäerää lysoitiin 750 µl: aan FA Lysis-puskuria (50 mm Hepes-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 0.1% natriumdeoksikolaattia ja CPI) ja 1 ml tilavuudeltaan 0,5 mm Zirkonia/piidioksidihelmiä helmen hakkaamalla Mini-Beadbeater-96-koneessa (Biospec) kolmen syklin ajan 3 min päälle/5 min off-sykliä (näytteitä pidettiin jäällä off-syklin aikana). Lysaatti siirrettiin uuteen putkeen ja mikrosentrifugoitiin maksiminopeudella 3 min 4 °C: n lämpötilassa kromatiinin pelletoimiseksi. Supernatantti hävitettiin, ja pelletti suspendoitiin uudelleen 750 µl: aan FAYSIS-puskuria, johon lisättiin 0, 1% SDS ja joka siirrettiin 15 ml: n polystyreenimuunteiseen putkeen. Tämän jälkeen näyte sonikoitiin Bioruptorilla (Diagenode) 15 sykliä 30 s on/off-välein, jotta saatiin 100-500 bp kokoisia DNA-fragmentteja. Yksi ChIP-exo-määritys käsitteli 50 ml: n soluviljelmää (~6 × 108 solua) vastaavan määrän. Tämä on sopiva määrä eikä vähimmäismäärä tarvitaan.
k562 kromatiinivalmiste
ihmisen krooninen myelooinen leukemiasolu (K562, ATCC) säilyi 1 × 105-1 × 106 solua/ml dmem-elatusaineessa, jota täydennettiin 10%: lla sikiön naudan seerumista 37 °C: ssa ja 5% CO2: lla. Solut pestiin PBS: llä (8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl ja 2,7 mM KCl), minkä jälkeen ne ristisidottiin formaldehydiin 1%: n lopullisena pitoisuutena 10 minuutin ajan huoneenlämmössä ja sammutettiin 125 mM: n glysiinipitoisuudella 5 minuutin ajan. Supernatantti poistettiin ja solut suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää pesua varten. Soluissa oli 100 miljoonaa solua, ne sentrifugoitiin, supernatantti poistettiin ja pelletti salamajäädytettiin.
100 miljoonaa soluerää (käytettäväksi useissa siruissa) lysättiin 500 µl: ssa (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0.5% NP40 ja täydellinen proteaasinestäjä (CPI, Roche)) inkuboimalla jäällä 10 min. Lysaattia mikrokentrifugoitiin 2500 rpm: ssä 5 minuutin ajan 4 °C: n lämpötilassa.supernatantti poistettiin, pelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan (50 mM Tris-pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,32% SDS ja CPI) ja inkuboitiin jäällä 10 min tumien lyseyttämiseksi. Näyte laimennettiin 600 µl: lla immunopresipitaatiolaimennuspuskuria (IP-Laimennuspuskuri: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 ja CPI) lopulliseksi pitoisuudeksi (40 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 7 mM EDTA, 56 mM NaCl, 0, 4% Triton-X 100, 0.2% SDS, ja CPI), ja sonicated Bioruptor (Diagenode) 10 sykliä 30 s on/off välein saada DNA fragmentteja 100-500 bp kooltaan.
hiiren kudosvalmiste
16 viikon ikäinen AIKUINEN uroshiiren aivo -, keuhko -, maksa-ja munuaiskudokset toimitti runsaasti tohtori Yanming Wang hiiren kudoksia käsiteltiin 100 mg: n annoksella ja kromatiinia tuotettiin edellä kuvatulla tavalla 21 pienin muutoksin. Lyhyesti sanottuna 100 mg hiiren kudosta jauhettiin paloiksi jäälle, kiinnitettiin 1% formaldehydillä 10 minuutin ajan ja sitten sammutettiin lopullisella 125 mM glysiinipitoisuudella 5 minuutin ajan. Solut kehrättiin, pestiin PBS: llä ja suspendoitiin sitten uudelleen 1 mL: aan kylmää Farnhamin solulyysipuskuria (20 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 85 mM KCl, 0, 5% NP-40, 0, 5% Triton X-100 ja CPI). Tämän jälkeen soluja inkuboitiin rototorkilla 20 minuutin ajan 4 C: ssä.eristetyt ytimet eristettiin kehräämällä alas ja suspendoitiin RIPA-ydinlyysipuskuriin (1 × PBS, 1% NP-40, 0, 5% Nadeoksikolaatti, 0, 5% SDS ja CPI). Ytimiä sonikoitiin Bioruptorilla (Diagenodi) 10 sykliä 30 s on/off-välein, jotta DNA: ta saataisiin 100-500 bp kokoalueella. Maksasolujen määrä arvioitiin edellä kuvatulla tavalla 22, käyttäen muuntokerrointa 1 mg kudoksen märkäpainoa vastaa ~250 000 solua.
kromatiini-immunopresipitaatio
50 ml: n viljelmäekvivalentti hiivaa tai 10 miljoonan soluekvivalentti K562-kromatiinia laimennettiin IP-Laimennuspuskurilla 200 µl: aan ja inkuboitiin yön yli 4 °C: ssa sopivalla vasta-aineella. Hiivanäytteisiin lisättiin 10 µl: n levymäärä IgG-Dynabeadeja; lisäksi K562-näytteisiin lisättiin 3 µg anti-CTCF-vasta-ainetta, jossa on 10 µl lietettä vastaava määrä proteiini A: ta Mag Sefaroosia (GE Healthcare).
ChIP-exo 1.1
ChIP-exo 1.1 suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla 7,8,23. Lyhyesti sanottuna seuraavat entsymaattiset vaiheet suoritettiin immunopresipitoidulla kromatiinilla, joka oli edelleen hartsissa, useiden suolapesujen avulla jokaisen vaiheen välillä.: T4-DNA-polymeraasipään kiillotus, T4-polynukleotidikinaasi, Klenow-fragmentin a-pyrstö, T4-DNA-ligaasivälitteinen Read_2-adapteri-ligaatio, phi29-DNA-polymeraasitäyte, toinen T4-polynukleotidikinaasi, lambda-eksonukleaasi-digestio ja RecJf-eksonukleaasi-digestio. Yön yli kestäneen käänteisen ristisilloituksen ja proteinaasi K-hoidon jälkeen liuoksessa suoritettiin seuraavat vaiheet: phi29 primer extension, toinen Klenow-fragmentti a-tailing, T4 DNA-ligaasivälitteinen Read_1 adapter ligation ja PCR.
ChIP-exo 3.0 ja 3.1 (tagmentation-based version)
immunopresipitaation jälkeen hartsille suoritettiin seuraavat vaiheet. Transposaasin kokoamiseksi TN5 inkuboitiin 10 × Transposaasiseoksessa, joka sisälsi seuraavat komponentit ja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämmössä: 12,5 µM TN5, 50% glyserolia ja 7,5 µM adapteri (NexA2/ME comp). Katso täydentävä Taulukko 1 Tässä tutkimuksessa käytettyjen oligonukleotidisekvenssien osalta.
hartsin Sirumateriaali pestiin peräkkäin FA Lysis-puskurilla, NaCl-puskurilla (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% natriumdeoksikolaattia), LiCl-Puskuri (100 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 500 mM LiCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoksikolaattia) ja 10 mM Tris-HCl, pH 8, 0 4 °C: ssa.
tagmentaatioreaktio (30 µl), joka sisältää: 20 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 5 mM MgCl2, 10% dimetyyliformamidia ja 1 × vaiheen 1 tagmentaatiosekoitusta (lopullinen pitoisuus: 1,25 µm TN5, 5% glyserolia, 750 Nm adapteri) inkuboitiin 30 min 37 °C: ssa. inkubaation jälkeen hartsi pestiin kahdesti guanidiini-Hydrokloridipuskurilla (50 mm tris-HCL, pH 7,5, 500 mm Guanidiinihydrokloridi, 2 mm EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% natriumdeoksikolaattia) 5 min 37 °C: ssa, sitten kerran licl-puskurilla ja 10 mM Tris-HCl: llä, pH 8,0 4 °C: ssa.
fill-in-reaktio (30 µl), joka sisältää: 10 U phi29 polymeraasia (NEB), 1 × phi29-reaktiopuskuria (NEB), 2 × (200 µg/ml) BSA: ta ja 165 µM dNTPs: ää inkuboitiin 20 min 30: ssä °c; sitten pestään 10 mm tris-HCL: llä, pH 8.0 4 °C: ssa. kinaasireaktiota (30 µl), joka sisältää: 10 U T4 PNK (Neb), 1 × T4 DNA-Ligaasipuskuria (Neb) ja 2 × BSA inkuboitiin 15 minuutin ajan 37 °C: ssa; sitten pestiin 10 mm Tris-HCL: llä, pH 8.0 4 °C: ssa. λ eksonukleaasidigestio (100 µl), joka sisältää: 20 U λ eksonukleaasi (NEB), 1 × λ eksonukleaasireaktiopuskuri (NEB), 0,1% Triton-X 100 ja 5% DMSO inkuboitiin 30 min 37 °C: ssa; sitten pestiin 10 mM Tris-HCl: llä, pH 8,0 4 °C: ssa.RecJf-eksonukleaasi-digestio (100 µl), joka sisältää: 75 U recjf-eksonukleaasia (NEB), 2 × NEBuffer 2, 0,1% Triton-X 100 ja 5% DMSO: ta inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C: ssa; sitten pestiin 10 mm tris-HCL: llä, pH 8, 0 4 °C: ssa.
DNA eluoitiin hartsista, ja tehtiin Käänteinen Ristisidonta ja proteinaasi K-käsittely (40 µl), joka sisältää: 30 µg proteinaasi K: ta, 25 mm tris-HCL: ää, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl ja 0,5% SDS inkuboitiin 16 tunnin ajan 65 °C: ssa.supernatantti siirrettiin sitten uuteen putkeen ja puhdistettiin Agencourt AMPure-magneettihelmillä (Beckman Coulter) valmistajan ohjeiden mukaisesti ja käyttäen DNA-tilavuuteen (72 µl) lisättyä 1,8 × ampurilietteen määrää.Näyte eluoitiin Ampurihelmistä 10 µl: aan vettä, ja seuraavat entsymaattiset vaiheet suoritettiin liuoksessa.
adapterin ligaatio (versio 3.0): primerin laajennusreaktiolle (kokonaisreaktiotilavuus 20 µl); uudelleen suspendoituun näytteeseen lisättiin 1 × phi29-reaktiopuskuri, 2 × BSA, 100 µM dntps ja 0,5 µM me-sekvenssin oligonukleotidi (yhteensä 9 µl) ja inkuboitiin 5 min 95 °C: ssa, sitten 10 min 45 °C: ssa, jotta oligo-aika hehkuisi. Näytettä siirrettiin 30 °C: seen ennen kuin siihen lisättiin 10 U phi29 polymeraasi (1 µl)ja inkuboitiin 20 min 30 °C: ssa; sitten 10 min 65 °C: ssa inaktivoitavaksi ja siirrettiin 37 °C: seen.
a-jäännösreaktiossa (kokonaisreaktiotilavuus 30 µl); primer extension-reaktioon lisättiin 10 U Klenow-fragmentti,-exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (yhteensä 10 µl) ja inkuboitiin 30 min 37 °C: ssa, sitten 20 min 75 °C: ssa inaktivoitavaksi ja siirrettiin 25 °C: seen. toiselle adapteri-ligaatioreaktiolle (kokonaisreaktiotilavuus 40 µl); a-tailing-reaktioon lisättiin 2 000 U T4-DNA-ligaasia (entsymaatit), 1 × nebnext quick ligation buffer (neb), 375 nm adapteri (exa1-58/13) ja inkuboitu 1 tunnin ajan 25 °C: ssa.
splint ligation (versio 3.1): adapterin ligaatiota varten (40 µl); uudelleen suspendoituun DNA: han lisättiin 1 200 U T4-DNA-ligaasi, 1 × T4-DNA-Ligaasipuskuri, 375 nM-adapteri (ExA1-58/ExA1-Ssl_n5) ja inkuboitiin 1 tunnin ajan 25 °C: ssa.
sekä Versio 3.0 että 3.1: ligaatioreaktio puhdistettiin sitten Ampurihelmillä ja suspendoitiin uudelleen 15 µl: aan vettä. Tämän jälkeen näyte monistettiin PCR: n avulla. PCR-monistuksessa (kokonaisreaktiotilavuus 40 µl); uudelleen suspendoituun DNA: han lisättiin 2 U: n fuusio-Kuumakäynnistyspolymeraasi (Thermo scientific), 1 × fuusio-HF-Puskuri (Thermo scientific), 200 µM dntps, 500 nM kukin aluke (P1.3 ja NexA2-iNN) ja monistettu 18 syklin ajan (20 sekuntia 98 °C: n denatuurissa, 1 min 52 °C: n hehkutuksessa ja 1 min 72 °C: n laajennuksessa). Neljäsosa reaktiosta monistettiin vielä kuuden syklin ajan (yhteensä 24) ja kirjastojen läsnäolo määritettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelillä.
kokovalinta: 200-500 bp PCR-tuotteet puhdistettiin 2-prosenttisesta agaroosigeelistä qiaquick Gel Extraction Kit-Valmisteella (Qiagen).
ChIP-exo 4.0 ja 4.1 (yksijuosteiset DNA-ligaatioversiot)
immunopresipitaation jälkeen hartsille tehtiin seuraavat vaiheet. Hartsissa oleva Sirumateriaali pestiin peräkkäin FA Lysis-puskurilla, NaCl-puskurilla, LiCl-puskurilla ja 10 mM Tris-HCl: llä, pH 8,0 4 °C: ssa.loppukorjausreaktiota (50 µl), joka sisältää: 7,5 U T4 DNA-polymeraasi (NEB), 2,5 U DNA-polymeraasi I (NEB), 25 U T4 PNK, 1 × T4 DNA-Ligaasipuskuri ja 390 µM DNTPS inkuboitiin 30 min 12 °C: ssa; sitten pestiin 10 mM: llä Tris-HCL, pH 8,0 4 °C: ssa λ Eksonukleaasin digestio (100 µl), joka sisältää: 20 U λ eksonukleaasia, 1 × λ Eksonukleaasireaktiopuskuri, 0,1% Triton-X 100 ja 5% DMSO inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C: ssa; sitten pestiin 10 mm Tris-HCL: llä, pH 8.0 4 °C: ssa. RecJf-eksonukleaasin digestio (100 µl), joka sisältää: 75 U RecJf-eksonukleaasia, 2 × NEBuffer 2, 0, 1% Triton-X 100 ja 5% DMSO-swasia inkuboidaan 30 min 37 °C: ssa; pestään sitten 10 mM Tris-HCl: llä, pH 8, 0 4 °C: ssa.
ensimmäinen adapteri ligaatio: ssDNA-ligaatio (versio 4.0, 40 µl): 1200 U T4-DNA-ligaasia, 1 × T4-DNA-ligaasipuskuria ja 375 nm: n yksijuosteista adapteria (Exa1-58-N5) inkuboitiin 1 tunnin ajan 25 °C: ssa; sitten pestiin 10 mm Tris-HCL: llä, pH 8,0 4 °C: ssa.
Splint-ligaatio (versio 4.1, 40 µl): 1200 U T4-DNA-ligaasia, 1 × T4-DNA-Ligaasipuskuria ja 375 nM: n adapteria (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) inkuboitiin 1 tunti 25 °C: ssa; sitten pestiin 10 mM Tris-HCl: llä, pH 8.0 4 °C: ssa.
sekä Versio 4.0 että 4.1: DNA eluoitiin hartsista ja tehtiin Käänteinen ristisidonta ja proteinaasi K-käsittely (40 µl) sisältää: 30 µg proteinaasi K: ta, 25 mm Tris-HCL: ää, pH 7, 5, 2 mm EDTA: ta, 200 mm NaCl: ää ja 0, 5% SDS: ää inkuboituna 16 tunnin ajan 65 °C: ssa.
supernatantti siirrettiin sitten uuteen putkeen ja puhdistettiin Agencourt AMPure-magneettihelmillä (Beckman Coulter) valmistajan ohjeiden mukaisesti (1,8 × tilavuus). Näyte eluoitiin Ampurihelmistä 20 µl: aan vettä, ja seuraavat entsymaattiset vaiheet suoritettiin liuoksessa.
toinen adapteri ligaatio: ssDNA-ligaatio (versio 4.0, kokonaisreaktiotilavuus 40 µl): uudelleen suspendoituun DNA: han lisättiin 1200 U T4-DNA-ligaasi, 1 × T4-DNA-Ligaasipuskuri, 375 nM-adapteri (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) ja sitä inkuboitiin 1 tunnin ajan 25 °C: ssa.
Splint-adapterin ligaatio (versio 4.1, kokonaisreaktiotilavuus 40 µl): uudelleen suspendoituun DNA: han lisättiin 1200 U T4-DNA-ligaasi, 1 × T4-DNA-Ligaasipuskuri, 375 nM-adapteri (ExA1-58/ExA1-Ssl_n5) ja sitä inkuboitiin 1 tunnin ajan 25 °C: ssa.
sekä Versio 4.0 että 4.1: ligaatioreaktio puhdistettiin ampurihelmet (1,8 × tilavuus) ja sekoitetaan uudelleen 15 µl: aan vettä. Tämän jälkeen näyte monistettiin PCR: n avulla. PCR-monistuksessa (reaktion kokonaistilavuus 40 µl); uudelleen suspendoituun DNA: han lisättiin 2 U: n fuusion Kuumakäynnistyspolymeraasi (Thermo scientific), 1 × fuusion HF-Puskuri (Thermo scientific), 200 µM dntps, 500 nM kukin primer (P1.3 ja NexA2-iNN) ja monistettiin 18 syklin ajan (20 s 98 °C denatuurissa, 1 min 52 °C: n hehkutuksessa, 1 min 72 °C: n laajennuksessa). Neljäsosa reaktiosta monistettiin vielä kuuden syklin ajan (yhteensä 24) ja kirjastojen läsnäolo määritettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelillä. Kokovalinta: 200-500 bp PCR-tuotteet puhdistettiin 2-prosenttisesta agaroosigeelistä qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen) – Valmisteella.
Huomautus: ChIP-exo 4.0 / 4.1 sisälsi yleisen Read_2-sovittimen, jossa viivakoodi lisättiin myöhemmin PCR: n aikana pitkillä alukkeilla. Aina kun pitkiä PCR-alukkeita käytettiin kirjastorakenteessa, johon kuului lambda-eksonukleaasi-digestio, kirjastot kärsivät alhaisesta tuotosta ja korkeista adapteri-dimeereistä. Käytämme nyt vain täyspitkiä adaptereita ja vähimmäispituisia PCR-alukkeita.
ChIP-exo 5, 0
immunopresiitin jälkeen hartsille tehtiin seuraavat vaiheet. Hartsissa oleva Sirumateriaali pestiin peräkkäin FA Lysis-puskurilla, NaCl-puskurilla, LiCl-puskurilla ja 10 mM Tris-HCl: llä, pH 8,0 4 °C: ssa. a-tailing-reaktiossa (50 µl), joka sisältää: 15 U Klenow-fragmenttia, – exo (Neb), 1 × NEBuffer 2 ja 100 µM dATP inkuboitiin 30 min 37 °C: ssa; sitten pestiin 10 mM Tris-HCl: llä, pH 8,0 4 °C: ssa. ligaatio-ja kinaasireaktiot (45 µl), jotka sisältävät: 1200 U T4 DNA-ligaasia, 10 U T4 PNK, 1 × nebnext quick ligation Buffer, ja 375 Nm adapteri (exa2_inn / exa2b) inkuboitiin 1 tunnin ajan 25 °C: ssa, minkä jälkeen se pestiin 10 mm tris-HCL: llä, pH 8.0 4 °C: ssa. Fill-in-reaktio (40 µl), joka sisältää: 10 U phi29 polymeraasia, 1 × phi29 reaktiopuskuria, 2 × BSA ja 180 µM dntps inkuboitiin 20 min 30 °C: ssa; sitten pestiin 10 mM Tris-HCl: llä, pH 8.0 4 °C: ssa. λ eksonukleaasidigestio (50 µl), joka sisältää: 10 U λ eksonukleaasia, 1 × λ eksonukleaasireaktiopuskuria, 0,1% Triton-X 100 ja 5% DMSO: ta inkuboitiin 30 min 37 °C: ssa; sen jälkeen se pestiin 10 mm: n tris-HCL: llä, pH 8, 0 4 °C: ssa.
DNA eluoitiin hartsista, ja tehtiin käänteinen ristisilloitus ja proteinaasi K-käsittely (40 µl), joka sisälsi: 30 µg proteinaasi K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl ja 0,5% SDS inkuboitiin 16 tunnin ajan 65 °C: ssa.supernatantti siirrettiin sitten uuteen putkeen ja puhdistettiin Agencourt AMPure-magneettisilla helmillä (Beckman Coulter) valmistajan ohjeiden mukaisesti (1,8 × tilavuus).Näyte eluoitiin Ampurihelmistä 20 µl: aan vettä, ja seuraavat entsymaattiset vaiheet suoritettiin liuoksessa. Toinen adapteri ligaatio (kokonaisreaktiotilavuus 40 µl): uudelleen suspendoituun DNA: han lisättiin 1200 U T4-DNA-ligaasi, 1 × T4-DNA-Ligaasipuskuri, 375 nM-adapteri (ExA1-58/ExA1-ssl_n5) ja sitä inkuboitiin 1 tunnin ajan 25 °C: ssa.ligaatioreaktio puhdistettiin sitten Ampurihelmillä (1,8 × tilavuus) ja suspendoitiin uudelleen 15 µl: aan vettä.
näyte monistettiin PCR: n avulla. PCR-monistuksessa (kokonaisreaktiotilavuus 40 µl); uudelleen suspendoituun DNA: han lisättiin 2 U: n fuusion Kuumakäynnistyspolymeraasi (Thermo scientific), 1 × fuusion HF-Puskuri (Thermo scientific), 200 µM dntps, 500 nM kukin aluke (P1.3 ja P2.1) ja monistettu 18 syklin ajan (20 sekuntia 98 °C: n denatuurissa, 1 min 52 °C: n hehkutuksessa, 1 min 72 °C: n laajennuksessa). Neljäsosa reaktiosta monistettiin vielä kuuden syklin ajan (yhteensä 24) ja kirjastojen läsnäolo määritettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelillä. Kokovalinta: 200-500 bp PCR-tuotteet puhdistettiin 2-prosenttisesta agaroosigeelistä qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen) – Valmisteella.
Huom: olemme havainneet, että käyttämällä tässä vaiheessa muuta menetelmää kuin geelin puhdistamista saadaan lopullisessa näytteessä sopimattoman korkea adapteridimeeri. Geelin puhdistus voi tehokkaasti erottaa sovittimen dimerin (150 bp fragmentti) ja pienemmät siru-exo-kirjaston fragmentit (200 bp fragmentti = 150 BP adapterit + 50 bp insertti).
DNA-sekvensointi
suuritehoinen DNA-sekvensointi suoritettiin nextseq 500: lla paripäätetilassa tuottaen 2 × 40 bp: n lukemat. Sekvenssilukemat mukautettiin myöhemmin hiivan (sacCer3) ja ihmisen (hg19) genomeihin käyttäen bwa-mem (v0.7.9 a)24. Aligned reads suodatettiin ei-uniikkien linjausten ja PCR-kaksoiskappaleiden poistamiseksi. PCR-kaksoiskappaleet määriteltiin sekvenssilukemiksi, joilla on identtiset read_1-ja Read_2-sekvenssit.
tietojen saatavuus
Kaikki tämän tutkimuksen jaksotustiedostot ja huipputiedostot ovat saatavilla osoitteessa NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) liittymisnumeroilla GSE110681 ja GSE114606. Koordinaattitiedostot, komentosarjaparametrit ja mukautettu koodi, jota käytetään tämän paperin lukujen luomiseen, voidaan ladata osoitteesta https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.
kaikki muut tiedot ovat saatavilla tekijöiltä kohtuullisesta pyynnöstä.