Y-kromosomin mikrodeletio isällä ja hänen neljä lapsetonta poikaansa

Abstrakti

Yq: n Mikrodeletiot liittyvät atsoospermiaan ja vaikeaan oligotsoospermiaan. Yleensä miehet, joilla on deleetioita, ovat hedelmättömiä ja siksi deleetiot eivät tartu poikiin, ellei in-vitro-hedelmöitystä (IVF) ja sytoplasmaista siittiöiden injektiota (ICSI) suoriteta. Raportoimme epätavallinen perhe ominaista useita jäseniä hedelmättömyys ja Yq microdeletion. Asianomaisilta perheenjäseniltä otettiin täydelliset lisääntymishistoriat, siemennesteanalyysit ja verinäytteet. DNA: n valmistus ja kvantifiointi tehtiin kaupallisilla pakkauksilla. Yhteensä 27 paria sekvenssi tagged sivustoja pohjainen pohjamaali asetetaan erityisiä Y microdeletion alue loci käytettiin seulontaan. Tämän jälkeen analysoitiin vahvistusta varten Eteläiset blotit, joissa käytettiin atsoospermiassa (DAZ) poistettua ja ribosomaalista sidontamotiivia (RBM). Proband, hänen kolme veljeään ja isänsä todettiin kaikki poistettavan DAZ: n vuoksi, mutta ei RBM: n. Tuolloin analyysi, proband isä oli azoospermic kun taas hänen neljä poikaa olivat joko vakavasti oligozoospermic tai azoospermic. Toisin kuin isänsä, neljä poikaa ovat hedelmättömiä eikä heillä ole jälkeläisiä, paitsi yksi heistä, joka sai tyttären vasta IVF/ICSI-hoidon jälkeen hedelmättömyyteen. YQ: n mikrodeleet, joissa on mukana DAZ-geeni, liittyvät muuttuvaan fenotyyppiseen ilmentymään, joka voi sisältää ilmeisesti normaalin hedelmällisyyden.

Johdanto

hedelmättömyyttä esiintyy ~14%: lla pareista (Mosher, 1985), ja miespuolisen kumppanin poikkeavuuksia arvioidaan esiintyvän jopa puolessa tapauksista (Swerdloff ym., 1985). Pyrkimykset arvioida atsoospermian syitä ovat osoittaneet, että perinteisesti tunnistettavien syiden poissulkemisen jälkeen (eli epänormaali karyotyyppi, tukos, varicocoele, hormonaalinen vika jne.), useimmat tapaukset (50-75%) ovat selittämättömiä ja kutsutaan idiopaattinen (Pryor et al., 1997). Viime aikoina on raportoitu, että jopa 30% miehistä, joilla on ”idiopaattinen” atsoospermia, on Y-kromosomin mikrodeleetioita (Henegariu et al., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi ym., 1993; Kobayashi ym., 1994; Najmabadi ym., 1996; Reijo ym., 1996; Vogt ym., 1996; Pryor ym., 1997). Miten ja aiheuttavatko nämä mikrodeleet atsoo/oligozoospermiaa, on sekä intensiivisen tutkimuksen että keskustelun kohteena.

olennaista väitteelle, että Y-mikrodeleet aiheuttavat hedelmättömyyttä, on havainto siitä, että hedelmälliset miehet harvoin ilmentävät Y-mikrodeleetioita. Mikrodeleet neljä 200 hedelmällistä miestä tutkittu on raportoitu (Pryor et al., 1997). Näiden miesten deleetiot olivat kuitenkin hyvin pieniä ja edustivat todennäköisesti merkityksetöntä polymorfismia. Miesten hedelmättömyyteen liittyviä suhteellisen suuria poistoja ei ole raportoitu miehillä, joilla on normaali hedelmällisyys. Vaikka yleisesti oletetaan, että nämä deleetiot syntyvät de novo ja että isältä pojalle transmission y mikrodeletion ei odoteta, muutamia harvoja tapauksia isältä yhdelle pojalle transmission Y-kromosomin mikrodeletion on raportoitu (Kobayashi et al., 1994; Stuppia ym., 1996; Vogt ym., 1996; Pryor ym., 1997). Kuitenkin, pystysuora siirto mikrodeletion mukana poistetaan azoospermia (DAZ) lokus isältä yhdelle pojalle on raportoitu vain kolmessa tapauksessa (Kobayashi et al., 1994; Vogt ym., 1996; Pryor ym., 1997). Kuvaamme nyt neljän sukupolven perhettä, jossa atsoosperminen isä ja hänen neljä lapsetonta poikaansa jakavat ilmeisen identtisen mikrodeletion, joka sisältää DAZ-lokuksen. Tämä perhe edustaa ensimmäistä ja ainoaa raporttia Daz-deleetion spontaanista pystysuuntaisesta siirtymisestä useisiin jälkeläisiin. Se tarjoaa näyttöä siitä, että yksi YQ microdeletion voi johtaa vaihteleviin fenotyyppinen ilmaisu eri yksilöissä. Se on kliinisesti merkittävä, koska läsnäolo mikrodeletion ei ole absoluuttinen markkeri hedelmättömyyttä ja voi liittyä ilmeisesti normaali hedelmällisyys.

materiaalit ja menetelmät

Yq-mikrodeletion-seulonta suoritettiin rutiininomaisesti miesten hedelmättömyyden varalta käyttäen protokollaa, jonka Columbian yliopiston Institutional Review Board of College of Physicians & Surgeons on tarkistanut ja hyväksynyt. Näytteet otettiin potilailta tietoon perustuvan suostumuksen jälkeen.

Siemennesteanalyysi

tulokset analysoitiin WHO: n kriteereillä Nikon-faasikontrastimikroskoopilla.

seerumin hormonipitoisuudet

follikkelia stimuloiva hormoni (FSH), luteinisoiva hormoni (LH) ja testosteroni mitattiin kiinteäfaasisella, kahdella paikalla tapahtuvalla kemiluminesenssiin perustuvalla immunometrisellä määrityksellä (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). Miesten normaalit vaihteluvälit ovat FSH <10 mIU/ml, LH <10 mIU/ml ja testosteroni 270-1070 ng / dl.

genomi-DNA

genomi-DNA: n uuttaminen kokoverestä suoritettiin punasolujen lyysillä ja sen jälkeen valkosolujen ja niiden tumien lyysillä. Soluproteiinit poistettiin saostamalla suolaa, ja genomi-DNA saostettiin isopropanolilla puregeeni-DNA-uuttopakkauksen (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, Yhdysvallat; luettelonumero. D-5004).

polymeraasiketjureaktio (PCR)

alukkeita valmistettiin kuivattuina oligonukleotideina automatisoidulla DNA-syntetisaattorilla (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, Yhdysvallat). Yhteensä 27 y-kromosomikohtaista sekvenssiä merkittyjä paikkoja (STS) (Kuva 1) valittiin STS-kartalta (Vollrath et al., 1992). Niihin kuuluvat kolme ehdotettua spermatogeneesiä loci AZFa, AZFb ja AZFc (per Vogt et al., 1996) ulottuen YQ: n väleihin 5, 6 ja 7. Nopeana seulontaprotokollana käytettiin PCR-multiplex-järjestelmää, joka koostui kahdesta kuuteen erilaisesta primer-parista yhteensä kuudessa multiplexed-reaktiossa (taulukko I). Jokaisessa PCR-ajossa oli mukana naiskontrolli ja normaali mieskontrolli. Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin polykarbonaattilevyillä (Teche®) MJ Research® – koneessa. PCR-ehdot olivat pääosin edellä kuvatut (Henegariu et al., 1993). Lyhyesti 14 µl: n kokonaistilavuusreaktiossa käytettiin mallina 50 ng genomista DNA: ta, 1 µl primer-standardiliuosta (mix I tai II tai III tai IV tai V tai VI, joka koostuu 10 pmol: sta per primer), 12 µl ”PCR-kylmäseosta” (1, 5 mmol/l MgCl2, 0, 2 mmol/l jokaista dntp: tä, 5% DMSO, 1× Taq-polymeraasireaktiopuskuria ilman Mg2+: a), 1, 25 IU Taq-DNA-polymeraasia (Promega) ja 1 pisara öljyä. Täydelliset sekoitukset laitettiin suoraan 94°C: seen esilämmitettyyn lämpösykliin. 27 syklin Sykliolosuhteet olivat: 94°C, 30 s (sulaminen); 55°C, 45 s (hehkutus); ja 72°C, 60 s (laajennus). Lopullinen jatkoaika oli 5 min. Tämän jälkeen PCR-reaktiotuotteet erotettiin 3% agaroosigeeleillä (Bio-Rad, ultra-pure grade) elektroforeesilla TBE-puskurissa. PCR-tuotteet värjättiin etidiumbromidilla ja visualisoitiin altistamalla ne ultraviolettivalolle. STS, jossa ei ollut monistumista multiplex-reaktioissa, vahvistettiin yhdellä reaktiolla PCR asianmukaisilla positiivisilla ja negatiivisilla kontrolleilla. STS: n katsottiin puuttuvan kolmen vahvistusvirheen jälkeen.

Southern hybridization

Southern blotting suoritettiin vakiintuneen protokollan mukaisesti (Sambrook et al., 1989). Lyhyesti, 5 µg genomista DNA: ta pilkottiin Hindii tai TaqI, ajetaan 0,7% agaroosigeelillä standardissa TBE puskurissa, siirretään nailonkalvoon ja hybridisoidaan 32P-merkityillä antureilla. Daz-luotain oli puhdistettu insertti plasmidista (pDP1577), joka sisälsi täyspitkän cDNA: n (Reijo et al., 1995). Vastaavasti RBM-luotain oli RBM cDNA-kloonin plasmidisisäkäs (MK5) (Ma et al., 1993).

isyyden määrittäminen

kaikkien neljän pojan isyys vahvistettiin osoittamalla neljän erittäin polymorfisen autosomaalisen merkkiaineen odotettu erottelu (Weber ja May, 1989). Nämä olivat d21s156, D21S270, D13S132 ja d13s159, joiden heterotsygositeetit olivat 0, 83, 0, 86, 0, 84 ja 0, 90.

fluoresoiva in situ-hybridisaatio (FISH)

FISH for DAZ suoritettiin cosmid 63C9: llä(Saxena et al., 1996), käyttäen vakiintuneita menetelmiä (Yu et al., 1996).

tulokset

proband (yksilö III 8 kuvassa 2) ja hänen puolisonsa (III-9) esiteltiin lisääntymis-endokrinologian-hedelmättömyyden klinikalle Columbia-Presbyterian Medical Centeriin valittaen primaarisesta hedelmättömyydestä 3 vuoden ajan. Testeissä todettiin normaali karyotyyppi ja normaali seerumin hormonitaso, kun taas siemennesteanalyysit osoittivat vakavaa oligozoospermiaa (taulukko II). STS–pohjaisen PCR: n suorittama Microdeletion-seulonta paljasti, että Y-kromosomin pitkän varren subinterval 6D-6F: ssä on mikrodeletion (Kuva 1). Proband kertoi keskustelun aikana, että hänen kaksi vanhempaa veljeään (III-4 ja III-6) tiedettiin atsoospermisiksi ja hedelmättömiksi. Myöhemmät tutkimukset paljastivat, että kaikilla kolmella veljeksellä oli ilmeisen identtinen mikrojälki. Yhdellä niistä (III-6) tehdyllä kivesbiopsialla todettiin vain Sertolin solusyndrooma.

kolmelta hedelmättömältä veljekseltä löydetyt mikrotautitapaukset viittasivat siihen, että heidän isällään oli todennäköisesti sama deleetio. Perheen muista jäsenistä, jotka kaikki asuivat Dominikaanisessa tasavallassa sijaitsevassa pikkukaupungissa, tehtiin yksityiskohtainen tutkimus. Täysi-ikäisiltä perheenjäseniltä saatiin täydellinen lisääntymishistoria. Sukutaulussa kuvatut sukulaisuussuhteet (kuva 2) vahvistettiin osoittamalla useiden autosomaalisen polymorfisen merkkiaineen odotettu erottelu (tietoja ei näy) asianomaisilla perheenjäsenillä (I-1, I-2, II-1, II-8 ja II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Isyydestä kieltäytymisestä ei ollut näyttöä. Perusteelliset sytogeneettiset tutkimukset asianomaisilla perheenjäsenillä (I-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 ja IV-1) osoittivat normaaleja karyotyyppejä. Siemennesteanalyysi tehtiin seitsemälle 16 miehestä ja verinäytteet otettiin useimmilta perheenjäseniltä.

taulukossa II on yhteenveto siemennesteanalyysin ja hormonitoimintaa koskevien tutkimusten tuloksista asianomaisilla perheenjäsenillä. Proband (III-8), Hänen isänsä (II-1) ja kaksi hänen kolmesta veljestään (III-4, III-6) todettiin joko atsoospermisiksi tai vakavasti oligozoospermisiksi. Probandin vanhin veli (III-1) kieltäytyi siemennesteanalyysistä. Lisäksi probandin sedällä (II-8) todettiin atsoospermia ja kohonnutta FSH: ta, jolla oli alhainen testosteroni. Kuten kuvassa 1 osoitetaan, proband, hänen isänsä ja kolme veljeä olivat kaikki todettu olevan mikrodeletion Yq STS PCR analyysi. Eteläinen blottaus Daz – (kuva 3) – ja RBM-luotaimilla (tietoja ei näy) varmisti, että deleetio sisälsi DAZ-lokuksen, mutta ei RNA: n sitova motif (RBM) – lokusta. Kala analyysi Daz Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996) probandin isän (II-1) leukosyyttien (Daz-lokuksen) yhtenäinen puuttuminen (Kuva 4).

havainto, että yksilö II-8 sukutaulussa oli atsoosperminen, mutta sillä ei ollut mikrodeletiota, oli yllätys. Tämän yksilön DAZ-lokusta testattiin edelleen eteläisellä analyysillä käyttäen DAZ cDNA: ta ja erilaista restriktioentsyymiä (TaqI). Siinä ei näkynyt poikkeavuutta DAZ-lokuksessa. Lisäksi kalat, joilla oli DAZ Cosmid 63C9, osoittivat normaalia voimakkuutta (tietoja ei näy).

proband (III-8) ja hänen isoveljensä (III-6) hakeutuivat lapsettomuushoitoihin. Laajan neuvonnan jälkeen he valitsivat koeputkihedelmöityksen (IVF) ja sytoplasmaisen sperman injektion (ICSI). Probandille (III-8) ja hänen vaimolleen (III-9) tehtiin kaksi IVF-ICSI-sykliä, jotka eivät johtaneet huonoon munasarjavasteeseen. Probandin veli (III-6) ja hänen vaimonsa (III-7) kävivät läpi yhden kontrolloidun munasarjojen hyperstimulaatiosyklin ja yhdeksän munasolua saatiin talteen. Yksitoista kypsää siittiötä löydettiin kolmesta ejakulaatista noutopäivänä ja niitä käytettiin ICSI: hen. Kolme munasolua hedelmöittyi, jotka myöhemmin pilkkoutuivat ja siirtyivät. Hän synnytti terveen naisvauvan (IV-2).

Keskustelu

raportoimme poikkeuksellisesta perheestä, jossa atsoospermisellä isällä ja hänen neljällä hedelmättömällä pojallaan on ilmeisesti identtinen Yq-mikrodeletio, johon liittyy DAZ-lokus. Daz: n mikrodeletioon johtanut de-novo-mutaatio näyttää saaneen alkunsa probandin isästä (II-1). Tämän poistamisen odotetaan aiheuttavan azoo / oligozoospermia ja miesten hedelmättömyyttä, ja silti hän spontaanisti tuli raskaaksi viisi lasta ja oli tietämätön hedelmällisyysongelmista. On kuitenkin kiinnostavaa, että kaikki neljä poikaa ovat hedelmättömiä ja ovat joko atsoospermisiä tai vakavasti oligozoospermisiä.

tämä perhe herättää useita kysymyksiä liittyen Yq microdeletionin ja lapsettomuuden väliseen yhteyteen. Ensinnäkin se vahvistaa, että vertikaalinen siirto Yq microdeletion on mahdollista ja voi johtaa myöhempään hedelmättömyyteen urospuolisissa jälkeläisissä. Toiseksi on selvää, että sama poisto voi johtaa eri fenotyyppejä eri yksilöissä. Vaikka tämän perheen neljän pojan isä (II-1) oli analyysin aikaan atsoospermic, hän sai ensimmäisen lapsensa 25-vuotiaana ja viimeisen 38-vuotiaana. Niinpä hänellä oli jonkin verran hedelmällisyyttä useiden vuosien ajan. Samoin Y-kromosomin, erityisesti DAZ: n, mikrodeletaatio ei välttämättä merkitse atsoospermian elinikäistä historiaa eikä sulje pois suurperheen muodostumista. Hänen neljä poikaansa taas ovat hedelmättömiä ja joko atsoospermisiä tai vakavasti oligozoospermisiä.

Daz-geeniä on ehdotettu Y-kromosomin atsoospermiatekijäksi. Tämä perhe osoittaa selvästi, että vaikka DAZ voi olla kriittinen rooli spermatogeneesiä, se ei ole välttämätöntä hedelmällisyyden. Lisäksi Daz-geeniklusterin täydellinen häviäminen voidaan liittää histologiseen kuvaan ”vain Sertolin solusta”sekä siittiöiden kypsymispysähdykseen (Foresta et al., 1997; Pryor ym., 1997). Useat kirjoittajat ovat löytäneet huonon korrelaation y-mikrodeleetioiden sijainnin (mukaan lukien DAZ-deleetiot) ja potilaiden kliinisen ja histologisen fenotyypin (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt ym.; 1996; Silber et al., 1998). Tämän perheen havainnot ovat yhtä mieltä siitä, että tällainen korrelaatio voi osoittautua varsin ongelmalliseksi. Probandin veljen kivesbiopsia (III-6) näytti kuvaa vain Sertolin solusta, kun taas probandin (III-8, jonka siittiömäärä on 0,5×106/ml) odotetaan selvästi olevan jossain määrin siittiöiden kypsymistä koepalassa. Lisäksi kivesbiopsia ei välttämättä edusta koko kivestä, koska spermatogeneesissä voi olla maantieteellinen heterogeenisuus, kuten yksittäisillä III-6: lla, joiden ejakulaatit sisälsivät kypsiä siittiöitä.

voidaan vain spekuloida, millä perusteilla perheenjäsenten fenotyyppiset erot ovat samalla poistolla. On hyvin tunnettua, että autosomien identtiset deleetiot voivat johtaa erilaisiin fenotyyppeihin (Schinzel, 1994). Voidaan olettaa, että tällaiset erot ovat seurausta kunkin yksilön altistumisesta ympäristölleen tai erilaisten muuntuvien geenien ilmentymisestä. Hedelmällistä isää on kuvattu mikrodeletionilla, joka laajeni, kun se siirrettiin hänen hedelmättömään poikaansa (Stuppia et al., 1996). Vaikka poiston rajoilla voi olla muuttuvia laajennuksia eri perheenjäsentemme välillä, näitä molekyylilaajennuksia ei voida erottaa intervallikartoituksella. PCR-analyysillä sama STSs ei vahvistunut viidessä yksilössämme ja eteläinen risteytyminen Daz-luotaimen kanssa vahvisti tämän geenirykelmän täydellisen poiston. Vaikka on mahdollista, että havaitut deleetiot eivät itse asiassa ole identtisiä ja lähialueet saattavat sisältää tärkeitä geenejä, jotka moduloivat fenotyypin ilmentymisastetta, nämä tulokset osoittavat silti poistetun Y-DNA: n suuren päällekkäisyyden (mukaan lukien Daz-geeniklusterin häviäminen) tämän ainutlaatuisen perheen jokaisessa yksilössä.

meitä kiehtoi se, että probandin sedällä (II-8) on hedelmättömyyttä ja atsoospermiaa, mutta ei STS-testillä ilmenevää mikrotautia. Koska southern blot-analyysi RBM-ja DAZ-koettimilla sekä kala-analyysit Daz cosmidilla olivat täysin normaaleja, meidän on pakko päätellä, että hänen hedelmättömyytensä taustalla on erilainen etiologia. On tosin mahdollista, että hänellä on pienempi tai pisteen mutaatio/häiriö tai proksimaalinen/distaalinen uudelleenjärjestely, jota ei ole havaittavissa nykyisillä menetelmillä. Hän ei ole altistunut gonadotoksiineille tai muille spermatogeneesiin todennäköisesti vaikuttaville tekijöille.

viime aikoihin asti Y-mikrodeletionilla on ollut vain vähän kliinistä merkitystä, sillä deleetio ei yleensä lisäänny. ICSI: n ja kivesten siittiöiden aspiraation (TESA) hyödyntäminen yhdessä IVF: n kanssa on nyt mahdollista oligo/atsoospermisille miehille, joilla on y microdeletion, saavuttaa raskaudet (Mulhall et al., 1997; Silber ym., 1998 ja yksittäiset III-6). Tämä on lietsonut huolta siitä, että tällaiset raskaudet voivat tuottaa miespuolisia jälkeläisiä, joilla on samanlainen mikrodelektio ja sitä seuraava lapsettomuus (Reijo ym., 1996; Girardi ym., 1997; Kremer ym., 1997). Itse asiassa, Yq microdeletion voidaan siirtää urospuolisille jälkeläisille kautta ICSI (Kent-First et al., 1996). Perhe, jonka raportoimme, ehdottaa, että miehet, joilla on YQ microdeletions (kuten yksittäiset II-1), jotka saavuttavat raskauksia, välittävät saman mikrodeletion ja lapsettomuusriskin pojilleen (yksilöt III-1, III-4, III-6, III-8). Siksi potilaille olisi tarjottava y microdeletion-seulontaa ennen ICSI: tä, ja heille olisi annettava neuvoja siitä, että YQ-mikrodeletion ja mahdollisesti lapsettomuus välittyvät heidän pojilleen. Koska enemmän tutkimusta on keskittynyt geneettinen aetiologies miesten hedelmättömyys, tunnistaminen geenien mukana spermatogeneesiä pitäisi tarjota tietoa patofysiologia miesten hedelmättömyys ja järkevämpi perusta aloittaa hoito.

Kiitämme perheitä yhteistyöstä tutkimuksessa; Dr David C. Page tarjoaa Daz cDNA-luotaimen ja hänen korvaamatonta apua tämän käsikirjoituksen kanssa; Dr kun Ma MK5 (RBM1) cDNA-luotaimen tarjoamisesta; Tohtori Peter Vogt YQ: n mikrodeletoitujen yksilöiden DNA: sta, jota käytettiin STS PCR-menetelmämme validointiin; ja C. C. Yu ja Patricia Lanzano heidän korvaamattomasta teknisestä avustaan.

tätä tutkimusta rahoitti osittain Columbia Presbyterian Medical Center Office of Clinical Trials House Staff Awards.