teollinen anaerobi Clostridium acetobutylicum käyttää polyketidejä solujen erilaistumisen säätelyyn

bakteerikannat ja väliaineet

C. acetobutylicum ATCC 824 viljeltiin anaerobikammiossa (Coy Laboratory Products), jonka ilmakehä oli 97% typpeä ja 3% vetyä. 2xYTG medium67 sisälsi 16 g/L tryptonia, 10 g/L hiivauutetta, 5 g/L NaCl: ää ja 10 g/L glukoosia (ellei toisin mainita) pH: n ollessa 5.2 nestemäiselle väliaineelle ja 5.8 kiinteälle väliaineelle (joka sisältää myös 15 g/L agaria). Clostridial growth medium (CGM)68 sisälsi 30 g/L glukoosia (ellei toisin mainita), 6,25 g/L hiivauutetta, 2,5 g/L ammoniumsulfaattia, 1,25 g/L NaCl: ää, 2,5 g/L asparagiinia, 0,95 g/L yksiemäksistä kaliumfosfaattia, 0,95 g/L kaksiemäksistä kaliumfosfaattia, 0,5 g/L magnesiumsulfaattiheptahydraattia, 13 mg/L mangaanisulfaattiheptahydraattia ja 13 mg/L rautasulfaattia heptahydraatti, jonka pH on säädetty 6, 4: ään. P2 medium69 sisälsi 80 g/L glukoosia (ellei toisin mainita), 1 g/L hiivauutetta, 2,2 g/L ammoniumasetaattia, 0.5 g/L yksiemäksistä kaliumfosfaattia, 0, 5 g/L kaksiemäksistä kaliumsulfaattiheptahydraattia, 0, 2 g/L magnesiumsulfaattiheptahydraattia, 1 mg/L para-aminobentsoehappoa, 1 mg/L tiamiinihydrokloridia, 10 µg/L biotiinia, 10 mg/L mangaanisulfaattiheptahydraattia, 10 mg/L rautasulfaattiheptahydraattia ja 10 mg/L NaCl, jonka pH on säädetty arvoon 6, 4. Clostridial basal medium (CBM)70 sisälsi 10 g/L glukoosia, 0,5 g/L yksiemäksistä kaliumfosfaattia, 0,5 g/L kaksiemäksistä kaliumfosfaattia, 4 g/L tryptonia, 0.2 g/L magnesiumsulfaattiheptahydraattia, 10 mg/L mangaanisulfaattiheptahydraattia, 10 mg/L ferrosulfaattiheptahydraattia, 1 mg/L para-aminobentsoehappoa, 1 mg/L tiamiinihydrokloridia ja 2 µg/L biotiinia, jonka pH on säädetty arvoon 6,9. Kiinteille CGM-levyille lisättiin 15 g/L agaria. CBM-s (käytetään nestemäisessä sporulaatiokokeessa) oli identtinen CBM: n kanssa, paitsi että käytettiin 50 g/L glukoosia ja lisättiin 5 g/L CaCO3 juuri ennen viljelmien inokulointia. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) kasvatettiin Luria-Bertani (lb) – kasvualustalla 37 °C: ssa. Sopivien Clostridium-kantojen kasvatusalustaa täydennettiin erytromysiinillä (ery; 40 µg/mL kiinteissä elatusaineissa, 80 µg/mL nestemäisissä elatusaineissa) ja/tai tiamfenikolilla (th; 5 µg/mL kiinteissä ja nestemäisissä elatusaineissa). Kanamysiiniä (Kan; 60 µg/mL) tai kloramfenikolia (Cm; 25 µg/mL) lisättiin E. coli-bakteeriviljelyaineisiin ilmoitetulla tavalla. Clostridium-ja E. coli-kannat säilyivät, sillä 20% v/v glyserolivarastoista varastoitiin -80 °C: ssa.

Plasmidirakenne

Oligonukleotidit saatiin integroiduilla DNA-teknologioilla (täydentävä Taulukko 5). Phuusiopolymeraasia (NEB) käytettiin kaikissa PCR-reaktioissa. Genomisen DNA: n eristämiseen C. acetobutylicum ATCC 824: stä käytettiin emäksistä lyysimenetelmää71. C. asetobutylicumia viljeltiin yön yli 2xytg: n väliaineessa stationäärifaasissa (OD600 > 2, 0), jolloin 10 mL: aa viljelmää sentrifugoitiin 3500×g: n lämpötilassa 15 minuutin ajan (huoneenlämpötilassa). Supernatantti hävitettiin ja soluselletti suspendoitiin uudelleen 5 mL: n asetettuun puskuriin (75 mM NaCl, 25 mm EDTA pH 8, 0, 20 mM Tris-HCl, pH 7, 5). Lysotsyymiä lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 2 mg / mL, ja liuos sekoitettiin varovasti. Seosta inkuboitiin 37 °C: ssa 60 minuutin ajan ja sekoitettiin kevyesti 15 minuutin välein. Inkubaatioajan jälkeen lisättiin 660 µL lysis-puskuria (1 M NaOH, 10% w/v SDS) ja liuos sekoitettiin perusteellisesti. Proteinaasi K:ta lisättiin lopulliseksi pitoisuudeksi 0, 5 mg/mL, ja liuosta inkuboitiin 55 °C:ssa 1 tunnin ajan. tämän inkubointijakson jälkeen lisättiin yhtä suuri määrä fenolia: kloroformia (1: 1) ja liuosta sekoitettiin inversiolla 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen liuosta sentrifugoitiin 3500×g: n lämpötilaan 15 minuutin ajan (huoneenlämpötilassa), ja ylempi vesifaasi hävitettiin pipetoimalla. Orgaaniseen faasiin lisättiin 3 M natriumasetaattia (lopullisessa liuoksessa 10% v/v). Genomisen DNA: n saostamiseksi lisättiin 2 volyymia etanolia ja liuos sekoitettiin. Saostunut genomi-DNA kerättiin lasikoukulla ja pestiin 70-prosenttisella etanolilla. Pestyä DNA: ta kuivattiin typpikaasun päällä 15 minuutin ajan, suspendoitiin uudelleen alhaiseen TE-puskuriin (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) ja liuotettiin inkuboimalla 50 °C: ssa.

plasmidin pko_mazf_mod rakentamiseen (joka myöhemmin toimisi mallina pKO_pks: lle) käytettiin alukkeita pKON_Fo ja pKON_Ro PCR monistamaan 5,0 kb aluetta pko_mazf template15: stä. Tämä vaihe oli tarpeen poistaa 677 bp alue pko_mazf selkäranka, jota emme voineet vahvistaa kautta PCR. 5.0 kb PCR-tuote puhdistettiin geelillä, sulatettiin 5′ ja 3 ’ päistä PshAI: n avulla, liitettiin muodostamaan pKO_mazF_mod ja muutettiin E. coli TOP10: ksi. Transformantit kloonit seulottiin puhdistetulla plasmiditestillä ja Sanger-sekvensoinnilla vahvistettiin lopullisen pko_mazf_mod-kloonin sekvenssi. Plasmidin pko_pks (PKS-geenin poistamiseksi C. acetobutylicumista) rakentamiseen käytettiin 3,8 kb: n aluetta, joka sisältää colE1: n, repL: n, bgaR: n ja mazF: n, PCR monistettiin pko_mazf_mod: sta käyttäen alukkeita pKO_F ja pKO_R. lisäksi alukkeita UHR_Fo ja UHR_Ro sekä DHR_Fo ja DHR_Ro käytettiin PCR: n vahvistamiseen 1 kb: n alueilla, jotka edustavat alku-ja loppupään homologisia alueita (Uhr ja DHR) rinnastaen PKS-geenin (ca_c3355) C: stä. acetobutylicum ATCC 824 genominen DNA-malli. Kloramfenikoli / tiamfenikoliresistenssigeeni ja konstitutiivinen promoottori (P ptb C. acetobutylicumista) monistettiin PKO_MAZF_MODISTA käyttäen alukkeita CMR_F ja CMR_R (1,1 kb alue). Nämä neljä PCR-tuotetta liitettiin Gibson Assemblyn kautta ja muunnettiin E. coli TOP10: ksi. Transformantit kloonit seulottiin puhdistetulla plasmiditestillä ja Sanger-sekvensoinnilla vahvistettiin lopullisen pKO_pks-kloonin sekvenssi. Plasmidin pAN315 (välttämätön pko_pks: n ja pCKO_pks: n metyloimiseksi ennen muuntamista C: ksi) rakentamiseen. acetobutylicum), 6.4 kb alue plasmidista pAN172 monistettiin käyttäen alukkeita pAN1_F ja pAN1_R, ja 1.0 kb alue, joka sisältää kanamysiiniresistenssigeenin vektorista pCOLA_Duet, monistettiin alukkeilla KAN_Fo ja KAN_Ro. Geelistä uutetut PCR-tuotteet liitettiin Gibson Assemblyn kautta ja muunnettiin E. coli TOP10-bakteeriksi. Transformanttikloonit seulottiin puhdistetulla plasmiditestillä ja Sanger-sekvensoinnilla vahvistettiin lopullisen pAN3-kloonin sekvenssi. Plasmidin pcko_pks rakentamiseen (PKS-geenin ilmentymiseen konstitutiivisella krotonaasipromoottorilla C: stä. acetobutylicum), alukkeita CPKS_Fo ja CPKS_Ro käytettiin PCR: n vahvistamiseen 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks-geenillä (CA_C3355) Gibsonin kokoonpanoon soveltuvilla ylityksillä. Pwis_empty vector71-selkäranka (joka sisältää konstitutiivisen crt-promoottorin ylävirtaan moninkertaisesta kloonauspaikasta) vahvistettiin PCR: llä käyttäen alukkeita pWIS_F ja pWIS_R, jotka tuottavat 5,0 kb tuotteen. Kaksi geelillä puhdistettua PCR-tuotetta liitettiin Gibson Assemblyn kautta ja muunnettiin E. coli TOP10: ksi. Transformantit kloonit seulottiin puhdistetulla plasmiditestillä ja Sanger-sekvensoinnilla vahvistettiin lopullisen pCKO_pks-kloonin sekvenssi.

plasmidin pet24b_pks rakentamiseksi 5,4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks-geeni (CA_C3355) monistettiin C. acetobutylicum-genomisesta DNA: sta käyttäen alukkeita PKS_Fo ja PKS_Ro. Kaksinkertaisesti pilkottu vektori pET24b (EcoRI/XhoI pilkottu) liitettiin kaksinkertaisesti pilkkoutuneella pks PCR-tuotteella (EcoRI / XhoI pilkottu), ja ligaatiotuote muutettiin E. coli TOP10: ksi. Transformantit kloonit seulottiin puhdistetulla plasmiditestillä ja Sanger-sekvensoinnilla vahvistettiin lopullisen pET24b_pks-kloonin järjestys.

C. acetobutylicum

ennen muuntumista C. acetobutylicumiksi vektori pKO_pks muuntui yhdessä pan3: n kanssa E. coli TOP10: ksi elektroporaatiolla. Tämä menettely mahdollisti pko_pks: n metylaation, joka on tarpeen C. acetobutylicum 72: ssa aktiivisen natiivin rajoitusmuokkausjärjestelmän voittamiseksi. E: n plasmidipuhdistus. coli pKO_pks / pAN3 nesteviljely suoritettiin,ja tuloksena olevaa plasmidiseosta käytettiin C. acetobutylicumin elektroporaatioissa aiemmin julkaistulla menetelmällä72, jonka yksityiskohtaisesti tässä. Sähkökompetenttien solujen valmistamiseksi yksi C. acetobutylicum-pesäke 2xYTG-levyltä (yli 1 viikon vanha) kuumennettiin 80 °C: ssa 10 minuutin ajan ja sitä käytettiin inokuloimaan 10 mL CGM: ää. Inkuboitiin yön yli 37 °C: ssa ja saavutettiin eksponentiaalisen vaiheen puoliväli (OD600 0, 4-0, 9), minkä jälkeen 6 mL: n viljelmää inokuloitiin 54 mL tuoretta 2xytg: tä. Tätä alakulttuuria inkuboitiin 37 °C: ssa, kunnes saavutettiin OD600 1.2 (~5 h), jolloin alakulttuuri sentrifugoitiin 3500×g: n lämpötilaan 20 min (4 °c). Supernatantin poistamisen jälkeen soluselletti suspendoitiin uudelleen 20 mL: aan jääkylmää elektroporaatiopuskuria (EPB; 270 mM sakkaroosia, 5 mM NaH2PO4, pH 7.4). Uudelleen suspendoidut kennot sentrifugoitiin 3500×g: n lämpötilaan 10 minuutin (4 °c) ajan, supernatantti hylättiin ja soluselletti suspendoitiin uudelleen 20 mL: aan jääkylmää EPB: tä. Kun supernatantti oli viimeisen kerran pelletoitu sentrifugoimalla lämpötilassa 3500×g 10 minuutin (4 °c) ajan, se heitettiin pois ja sakka suspendoitiin uudelleen 2, 3 mL: aan jääkylmää EPB: tä. Tätä lopullista uudelleensuspensiota käytettiin sähköakkujen varastona. Elektro-transformaatiot suoritettiin sekoittamalla ensin (jään päällä) 500 µL päteviä soluja ja ~20 µL plasmidi-DNA-liuosta (yhteensä 1-5 µg) muunnettavaksi. Seos siirrettiin 0,4 cm: n elektroporaatiokuvettiin, ja sen annettiin inkuboitua jäällä 15 min. Elektroporoinnit suoritettiin seuraavilla parametreilla: jännite, 2000 V; kapasitanssi, 25 µF; resistanssi, ääretön Ω. Elektroporaation jälkeen näytteet suspendoitiin uudelleen 1 mL: aan 2xYTG: tä ja siirrettiin 9 mL: aa 2xytg: tä sisältävään putkeen. Inversiolla tapahtuneen sekoittamisen jälkeen viljelmien annettiin palautua 37 °C: ssa 4 tunnin ajan. talteenottoviljelmät sentrifugoitiin 3500×g: n lämpötilaan 15 minuutin ajaksi (huoneenlämpöiseksi) ja supernatantti hylättiin. Soluselletti suspendoitiin uudelleen 500 µL: aan 2xYTG ja 100 µL pinnoitettiin kiinteille 2xytg-levyille, joita täydennettiin sopivalla antibiootilla. Levyä inkuboitiin 37 °C: ssa 2-3 päivää, ja transformanteille pesäkkeille tehtiin PCR-verifiointi.

PKS-geenin poisto ja geneettinen komplementaatio

Kohdennettu KO PKS-geenin (ca_c3355) C. acetobutylicum ATCC 824 saavutettiin aiemmin julkaistulla menetelmällä15. Yksityiskohtaisesti 5 µg metyloitua pko_pks / pAN3 plasmidiseosta muunnettiin C. acetobutylicumiksi edellä kuvatulla menetelmällä. Kun solupelletit kerättiin nesteessä 2xYTG 4 tunnin ajan, ne sentrifugoitiin (3500×g, 15 min, huoneenlämpötila), suspendoitiin uudelleen 0, 5 mL: aan tuoretta nestettä 2xYTG ja 100 µL uudelleen suspendoitua soluviljelmää pinnoitettiin kiinteille 2xytg + 5 µg/mL Th + 40 mM β-laktoosilevyille. Näissä pinnoitusolosuhteissa vain sellaisten solujen, jotka ovat läpikäyneet halutun homologisen kaksoisratkaisutapahtuman, odotetaan selviävän. Vektorin selkärangan vastavalinnan tarjoaa laktoosia indusoiva promoottori (P bgaL), joka ajaa toksiinigeeni mazF: ää pKO_pks-vektorin selkärangassa. Tämän pinnoitusmenetelmän jälkeen havaittiin noin 10 pesäkettä 2xytg + 5 µg/mL Th + 40 mm β-laktoosilevyillä. Näistä 10 pesäkkeestä neljä uudistettiin kahdesti ja niille tehtiin pesäkkeiden PCR-verifiointi. Pesäkkeiden PCR-verifioinnin perustana käytettiin neljää alukkeiden sarjaa, kuten Tarkennettu täydentävässä Kuvassa. 2.

PKS-geneettisen komplementaatiokannan tuottamiseksi ∆PKS C. acetobutylicum-bakteerin elektroporaatio pCKO_pks / pAN3-plasmidiseoksella suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Elektroporaation ja talteenoton jälkeen viljelmät pinnoitettiin kiinteälle 2xytg + 5 µg/mL TH + 40 µg/mL Ery-väliaineelle. Kun pcko_pks: ää sisältävää kiinteää 2xytg + 5 µg/mL TH + 40 µg/mL Ery-väliainetta oli käytetty kahdesti uudelleen, mahdolliset pesäkkeet, joissa pCKO_pks oli, seulottiin pesäkkeiden PCR: n kautta käyttäen alukkeita pCKO_F ja pCKO_R.

LC-HRMS-metabolomianalyysi

kohdistamattomissa metabolomivertailuissa villityypin ja ∆PKS C. acetobutylicum-kannan yksittäispesäkkeitä kuumennettiin 80 °C: ssa 10 minuutin ajan, ja niitä käytettiin inokuloimaan 10 mL nestemäistä CGM: ää (30 g/L glukoosia). Yön yli jatkuneen inkubaation (pysähtynyt) jälkeen, kunnes saavutettiin OD600 ~1.0, näitä viljelmiä käytettiin inokuloimaan 10 mL nestemäistä CGM: ää (80 g/L glukoosia) 10%: n inokulaatilla alakasvatusta varten. Jälkeen ~5 h (OD600 ~1.0) pysähtyneen kasvun alakulttuureja käytettiin inokuloimaan magneettisekoitustankojen avulla vatkattuja neliruplikaattipullon fermentaatioita (70 mL CGM, 80 g/L glukoosia + 5 µL vaahdonestoainetta 204, 3% inokulaattia). PH: n puskurointiin lisättiin kalsiumkarbonaattia (6 g/L). Kaikki viljely suoritettiin 37 °C: n lämpötilassa.noin 5 µg/mL TH oli mukana kaikissa ∆pks-viljelmissä lukuun ottamatta lopullista käymisviljelyä, koska tiettyjen antibioottien tiedetään häiritsevän ABE-käymisvaiheita. Näytteet käymisliemestä (1 mL) jokaisesta rinnakkaisnäytteestä otettiin varhaisen stationäärifaasin aikana ja uutettiin 3 mL:lla 2: 1 kloroformimetanolia. Seokset pyörrettiin, erotettiin sentrifugoimalla (2700×g, 10 min) ja pohja kloroformipitoinen kerros siirrettiin lasiseen injektiopulloon. Nämä orgaaniset uutteet kuivattiin typpikaasulla, suspendoitiin uudelleen 100 µL metanoliin ja 10 µL ruiskutettiin Agilent Technologies 6520-Massaiseen QTOF LC-MS-mittalaitteeseen, jossa oli Agilent Eclipse Plus C18-kolonni (4,6 × 100 mm). Käytettiin lineaarista gradienttia 2-98% CH3CN (vol/vol) yli 40 min H2O: ssa 0,1% muurahaishapolla (vol/vol) virtausnopeudella 0,5 mL/min. Scripps Research Institute-tutkimuslaitoksen (xcms16) metabolomianalyysialustaa käytettiin vertaamaan villityyppisten ja ∆PKS-kantojen metabolomeja nelinkertaisten LC-HRMS-tietojen perusteella. MS peaks unique to ∆pks (Kuva. 1a) tunnistettiin käyttämällä seuraavia parametreja: p-arvo < 0, 01, kertainen muutos > 10, 0, huippuintensiteetti > 5000.

bioreaktorin fermentoinnit

vertailemaan villin tyypin Abe-käymisprofiileja ja ∆PKS C: tä. acetobutylicum, bioreactor fermentaatiot suoritettiin DASGIP bioreaktoreissa (4 × GPI 100 astiaa, Dasgip Bioblokkijärjestelmä) 500 mL: n työskentelymäärillä. Yön yli viljelmät (10 mL CGM, 30 g/L glukoosia, pysähtynyt, 34 °C) inokuloitu lämpöshokissa yksittäisiä C. acetobutylicum-pesäkkeitä viljeltiin, kunnes saavutettiin OD600 ~1. 10% inokulaattia käytettiin sitten alakulttuurin aloittamiseen (30 mL P2-väliainetta, 80 g/L glukoosia, pysähtynyt, 34 °C), ja alakulttuuria inkuboitiin, kunnes saavutettiin OD600 ~1. Tämän jälkeen 30 mL: n alakulttuurit siirrettiin aseptisesti yksittäisiin Dasgip-Bioreaktoreihin, joihin oli ladattu 500 mL P2-elatusainetta (80 g/L glukoosia, 100 µL vaahdonestoainetta 204, 34 °C). Fermentaatioiden annettiin edetä 54 tunnin ajan säännöllisin väliajoin optisten tiheysmittausten, käymistuotteiden analysoinnin ja yhdisteiden 1, 2 ja 3 kvantifioinnin avulla. Lämpötila pidettiin 34 °C: ssa koko käymisen ajan, ravistettiin sekoittamalla 200 rpm: ssä ja pH pidettiin yli 5,0 lisäämällä automaattisesti 3 M NH4OH. Anaerobisten olosuhteiden ylläpitämiseksi hapetonta typpikaasua haravoitiin 2 sL/h: n nopeudella käymisen keston ajan. Yhdisteiden 1, 2 ja 3 kvantifiointia varten 1 mL käymislientä sekoitettiin 3 mL: aan etyyliasetaattia pyörteittäin eroteltuna sentrifugoimalla (2700×g, 10 min, huoneenlämpötila) ja ylempi orgaaninen kerros eristettiin. Orgaaninen kerros kuivattiin pyörivällä haihdutuksella, suspendoitiin uudelleen 200 µL metanoliin ja 20 µL ruiskutettiin Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (with dad) – laitteeseen, jossa oli Agilent Eclipse ja C18-kolonni (4,6 × 100 mm). Käytettiin lineaarista gradienttia 2-98% CH3CN (vol/vol) yli 40 min H2O: ssa 0,1% muurahaishapolla (vol/vol) virtausnopeudella 0,5 mL/min. Yhdisteet 1, 2 ja 3 tunnistettiin UV-absorptiolla (240 nm), kuten kuviossa osoitetaan. 1b, ja kvantifioitiin integroidulla piikin pinta-alalla (absorbanssi 240 nm: ssä).

Käymisanalyysimenetelmät

solujen tiheyden määrittämiseen käytettiin spektrofotometriä mittaamalla optinen tiheys 600 nm: ssä (OD600). C: n analysointiin käytettiin Shimadzu näkyvyys uflc-järjestelmää, jossa oli Bioradiaminex HPX-87H-sarake (300 mm × 7,8 mm). asetobutyylikäymisliemi glukoosin ja käymistuotteiden (asetaatti, butyraatti, laktaatti, asetoni, butanoli ja etanoli) konsentrointiin. Käymisliemestä (1 mL) otettuja näytteitä pelletoitiin ensin sentrifugoimalla 10 000×g 3 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantti suodatettiin 0,22 mikronin PVDF-ruiskusuodattimella. Suodatettua supernatanttia (20 µL) sisältäviä näytteitä ruiskutettiin UFLC-järjestelmään siten, että 0,01 N rikkihappoa sisältävä liikkuva faasi virtasi 0,7 mL/min, kolonnin lämpötila 35 °C, ja niitä kromatografoitiin 35 minuutin ajan. Analyyttejä havaittiin käyttämällä taitekerroin-ilmaisinta (käytetään glukoosin, asetaatin, laktaatin, butanolin ja etanolin pitoisuuksien kvantifiointiin) ja diodirividetektoria (käytetään butyraatin (208 nm) ja asetonin (265 nm) pitoisuuksien kvantifiointiin).

RNA-eristäminen ja RNA-Seq-analyysi

näytteet (10 mL) käymisliemestä otettiin biologisina kolmena kappaleena bioreaktorifermentaatioista villityypin ja ∆PKS C. acetobutylicum 26 h inokulaation jälkeen. Näytteet sentrifugoitiin (4000×g, 10 min, 4 °c) ja pelletit suspendoitiin uudelleen ja varastoitiin RNAprotect-Solureagenssiin (Qiagen). Total RNA uutettiin käyttäen rneasy Mini Kit (Qiagen) valmistajan ohjeiden mukaan. Kolonninen DNase-hoito suoritettiin käyttäen DNase I: tä (RNase-free) (NEB). RNA: n laadunvalvonnan, kirjaston rakentamisen ja kirjaston sekvensoinnin suorittivat University of California-Berkeley QB3 Functional Genomics Laboratory ja Vincent J. Coates Genomic Sequencing Laboratory. RNA: n laatu ja pitoisuus arvioitiin Nanosirun avulla Agilent 2100-Bioanalysaattorilla. Bakteeri 16S ja 23S rRNA poistettiin RiboZero-pakkauksella (Illumina). Tuloksena saatu lähetti-RNA (mRNA) muunnettiin RNA-Seq-kirjastoksi mRNA-Seq-kirjaston rakennuspaketin (Illumina) avulla. RNA-kirjaston sekvensointi suoritettiin Illumina HiSeq4000: lla, jossa oli 50 bp: n yksipäätylukemat. Sekvensointi lukee (50 bp ) käsiteltiin ja kartoitettiin C. acetobutylicum ATCC 824 genomi (NCBI liittyminen NC_003030.1 ja NC_001988.2) käyttäen CLC Genomics Workbench 9.0 oletuksena parametrit. Lukemat, jotka eivät olleet yhteneväisiä genomin kanssa, hylättiin. Erot geenien ilmentymisessä villityypin ja ∆pks C. acetobutylicumin välillä laskettiin saman ohjelmiston avulla. Geenejä pidettiin eri tavoin ilmaistuina P-arvolla < 0, 003 (tuloksettoman t-testin perusteella n = 3) ja |normalisoidulla kertamuutoksella |> 2, 0. P-arvoihin tehdyt väärät löytönopeuskorjaukset laskettiin CLC Genomics Workbench 9.0: ssa julkaistulla menetelmällä 73. RNA-Seq-analyysin tulokset on esitetty täydentävissä tiedoissa 1. STRING analysis30 suoritettiin RNA–Seq-analyysissä paljastuneiden, toisistaan poikkeavien geenien välisten oletettujen proteiini-proteiini-vuorovaikutusten määrittämiseksi.

Fenotyyppivertailukokeet

nestemäisellä sporulaatiokokeet tehtiin vähäisillä muutoksilla74. Näytteet otettiin biologisista kolmikantaisista nesteviljelmistä 5 päivän inkubaation (30 mL CBM-S, 37 °C) jälkeen. 20 µL: n näytteet olivat lämpöshokkeja (80 °c, 10 min), laimennoksia (101-106) havaittiin 2xYTG-levyillä ja pesäkkeet laskettiin 30 tunnin inkubaation (37 °C) jälkeen lämmönkestävien pesäkemuodostusyksiköiden (pmy/mL) määrän laskemiseksi. ∆Pks: n kemiallista täydentämistä varten nestemäisessä sporulaatiomäärityksessä lisättiin puhdistettua klostrienoosia (lopullinen pitoisuus 3, 5 µM) CB PKS C. acetobutylicum-bakteerin CBM-s-viljelmissä inokulaation ajankohtana. Koska yhdistettä 3 lisättiin väkevänä liuoksena metanoliin, vastaava määrä metanolia (60 µL) lisättiin kaikkiin muihin nestemäisiin sporulaatiomittausviljelmiin (villityyppiset ja täydentämättömät ∆PKS) tämän vaikutuksen valvomiseksi.

kiinteissä sporulaatiomäärityksissä käytettiin aiemmin kuvattua menetelmää75, johon tehtiin joitakin muutoksia. Yksityiskohtaisesti, lämpö järkytti (80 °c, 10 min) yksittäisiä pesäkkeitä viljeltiin nestemäisessä väliaineessa (10 mL CGM, 37 °C) 24 tunnin ajan. viljelmät laimennettiin kertoimella 106 ja pinnoitettiin kiinteällä CBM: llä. Näytteenotto suoritettiin 1, 2, 3, 4 ja 6 päivää alkuperäisen pinnoituksen jälkeen. Näytteenottoa varten kolme yksittäistä pesäkettä yhdistettiin ja suspendoitiin perusteellisesti uudelleen 60 µL: aan nestemäistä CGM: ää. Tämän jälkeen 20 µL uudelleen suspendoitua pesäkeseosta lämpöshokattiin (80 °c, 10 min), laimennokset (101-106) havaittiin 2xYTG-levyillä ja pesäkkeet laskettiin 30 tunnin inkubaation (37 °C) jälkeen lämmönkestävien pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (pmy/pesäke) lukumäärän laskemiseksi. Kaikki näytteet otettiin biologisina kolmena kappaleena.

Granuloosikertymätestit suoritettiin joditahrauksella 53. Mid-log-vaihe (OD600 ~0.6) nesteviljelmät (P2, 37 °C) pinnoitettiin kiinteälle 2xytg-alustalle, jossa oli kohonneet glukoosipitoisuudet (50 g/L) granuloosin tuotannon mahdollistamiseksi. Levyjä inkuboitiin 30 °C: ssa 4 päivää, jolloin ne värjättiin altistamalla ne jodikiteille 10 minuutin ajan. Levyjen annettiin sitten irrota 10 minuuttia ennen kuvantamista. ∆Pks: n kemiallista täydentämistä varten granuloosikertymätestissä puhdistettu klostrienoosi (lopullinen levypitoisuus 4, 0 µM) upotettiin kiinteisiin 2xytg-levyihin ennen ∆pks-viljelmän pinnoitusta. Koska klostrienoosia lisättiin 2xytg-levyihin väkevänä liuoksena metanolissa (sekoitettiin sulaan väliaineeseen ennen jähmettymistä), vastaava määrä metanolia (6 µL) lisättiin kaikkiin muihin 2xytg-levyihin, joita käytettiin granuloosikertymäkokeissa tämän vaikutuksen hallitsemiseksi.

yksittäisiä C. acetobutylicum-bakteerin pesäkkeitä, joita viljeltiin CBM-levyillä 48 tunnin (37 °C) ajan, tarkasteltiin ja kuvattiin Leica DFC300 FX-kameralla varustetulla Leica mz16 F-dissektiomikroskoopilla.

öljyn levittämistestit suoritettiin edellä kuvatulla tavalla 76,77,78. Yksityiskohtaisesti 400 mL: n lasinen dekantterilasi (sisähalkaisija 7,5 cm) täytettiin 300 mL: lla vettä, ja siihen lisättiin 10 µL: n pisara parafiinilamppuöljyä, jonka annettiin levitä ohueksi kalvoksi vedenpinnalle 5 minuutin ajan (halkaisijaltaan~25 mm). Surfaktiiniliuoksia, puhdistettua klostrienoosia ja kaliumfosfaattipuskurikontrollia valmistettiin ilmoitetulla pH: lla ja pitoisuudella (valmistettu 10 mM: n kaliumfosfaattipuskurissa). Öljykalvon keskelle lisättiin varovasti noin 10 µL näytettä, ja vaikutus öljykalvoon havaittiin. Näytteiden, joilla on pinta-aktiivista aktiivisuutta, odotetaan muodostavan vakaita pyöreitä clearing-vyöhykkeitä öljykalvossa, jolloin tehokkaampi pinta-aktiivisten aineiden aktiivisuus vastaa suurempia clearing-vyöhykkeitä (tai öljykalvon täydellinen hajaantuminen erittäin korkean pinta-aktiivisen aktiivisuuden vuoksi). Pudotuskokeet suoritettiin 77,79, 80. 96-mikrolevyn (12,7 × 8,5 cm) polystyreenikannessa olevat pyöreät mikrokerrokset (sisähalkaisija 8 mm) päällystettiin ohuella parafiinilamppuöljykerroksella lisäämällä kumpaankin kuoppaan 2,0 µL parafiinilamppuöljyä ja antamalla pisaran levitä tasaisesti mikroon 1 tunnin ajan. Näytteitä surfaktiinista, puhdistetusta klostrienoosista ja kaliumfosfaattikontrollista valmistettiin kuten öljyn levittämistestejä varten. Noin 5 µL näytettä lisättiin varovasti mikroputken keskelle. 5 minuutin kuluttua havaittiin pisaran muoto ja leviämisaste. Vaikka puskurikontrollien odotetaan muodostavan vakaita helmiä mikroaallon pinnalle, pinta-aktiivista ainetta sisältävien näytteiden odotetaan romahtavan ja leviävän mikroaallon pinnalle, jolloin pinta-aktiivisen aineen aktiivisuus vastaa suurempaa pisaroiden leviämistä.

PKS-proteiinin Puhdistus ja in vitro-analyysi

His6-merkityn PKS-proteiinin puhdistamiseksi in vitro-analyysia varten pET24b_pks muutettiin E. coli BAP1: ksi. Yhdestä pesäkkeestä inokuloitiin 10 mL LB + 50 µg/mL kanamysiiniä (Kan) yön yli tapahtuvaa kasvua varten 37 °C: ssa.noin 7 mL yön yli kestänyttä viljelyä käytettiin inokuloimaan 700 mL lb + 50 µg/mL Kan, ja viljelyä ravistettiin 240 rpm: ssä ja 37 °C: ssa, kunnes saavutettiin 0, 5 OD600. 10 minuutin kuorrutuksen jälkeen isopropyylitio-β-d-galaktosidi (IPTG) lisättiin lopulliseksi pitoisuudeksi 0.1 mM proteiinin ilmentymisen indusoimiseksi, ja viljelmää inkuboitiin 16 °C: ssa 16 tunnin ajan. solut kerättiin sentrifugoimalla (5500×g, 4 °c, 20 min), suspendoitiin uudelleen 25 mL: aan lyysipuskuria (25 mm HEPES, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mM imidatsoli) ja lysoitiin homogenoimalla jään päällä. Solujäte poistettiin sentrifugoimalla (17 700×g, 4 °C, 60 min) ja supernatanttiin lisättiin ni-NTA-agaroosihartsia (2 mL/L viljelmä). Seos pähkinöitiin 4 °C: ssa 1 tunnin ajan, kuormitettiin gravitaatiovirtauskolonniin, ja PKS-proteiini eluoitiin kasvavilla Imidatsolipitoisuuksilla puskurissa A (20 mm HEPES, pH 8,0, 1 mM DTT). Puhdistettu PKS-proteiini konsentroitiin ja puskuri vaihdettiin puskuriksi a + 10% glyserolia käyttäen Vivaspin-Keskipakokeskittäjää. Puhdistetun PKS-proteiinin aliquotit aliquotoitiin ja flash jäädytettiin nestemäiseen typpeen. Proteiinin likimääräinen saanto oli 5 mg/L (203 kDa).

PKS-kuormituskoe 14C-merkityllä substraatilla, jonka kokonaistilavuus on 15 µL, 4 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 0.5 mM CoA, 2-14C-malonihappo (0,1 µCi), 10 µM MatB, 17 µM PKS ja 50 mM HEPES, pH 8,0. Kun näytteitä oli inkuboitu 2 tuntia 25 °C: ssa, ne sammutettiin lisäämällä yhtä suuri määrä 1× SDS-näytepuskuria. 4-15% TGX–geelillä (Criterion) tehdyn SDS-PAGE-analyysin jälkeen geeliä kuivattiin 2 tuntia 50 °C: n lämpötilassa ja altistettiin 5 päivän ajan fosforinäytölle (20 × 25 cm; molekyylidynamiikka). Radioleimattua proteiinia kuvattiin Typhoon 9400 phosphorimagerilla (Storage Phosphor mode, 50 µm resoluutio; Amersham Biosciences).

PKS-proteiinin in vitro valmistemäärityksissä (50 µL) 8 µM PKS: ää inkuboitiin malonyyli-CoA: lla (2 mM) fosfaattipuskurissa (100 mM, pH 7.0) huoneenlämmössä 2 tunnin ajan yhdisteen 4 valmistamiseksi, joka on tunnistettu kemialliseen standardiin verrattuna. Määritykseen lisättiin NADPH (2 mM), jolloin saatiin yhdisteitä 5 ja 6, jotka molemmat tunnistettiin kemiallisiin standardeihin verrattuna. Inkuboinnin jälkeen määritysseokset uutettiin kahdesti 100 µL: lla 99-prosenttista etyyliasetaattia/1-prosenttista etikkahappoa (v / v). Orgaaniset uutteet kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen 100 µL metanolia ja 10 µL ruiskutettiin Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (with dad) – laitteeseen, jossa oli Agilent Eclipse ja C18-kolonni (4,6 × 100 mm). Käytettiin lineaarista gradienttia 2-98% CH3CN (vol/vol) yli 40 min H2O: ssa 0,1% muurahaishapolla (vol/vol) virtausnopeudella 0,5 mL/min. Määritysuutteiden LC-HRMS-analyysi tehtiin Agilent Technologies 6520-massaisella Qtof LC-MS-laitteella, jossa oli Agilent Eclipse Plus C18-sarake (4.6 × 100 mm) käyttäen samaa liuottimen gradienttia ja virtausnopeutta kuin edellä on kuvattu.

tietojen saatavuus

tässä tutkimuksessa saadut RNA-seq-tiedot on talletettu arrayexpress-tietokantaan (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) liittymisnumerolla E-MTAB-6019. Kaikki muut asiaankuuluvat tiedot ovat saatavilla laatijoilta pyydettäessä.