tässä videossa tarkkailet, miten kromin vapautumiskoe suoritetaan ja miten efektorisolujen sytotoksinen potentiaali määritetään.
immuunisolut vastaavat mahdollisesti haitallisten solujen, kuten syövän tai viruksen infektoimien solujen, tunnistamisesta ja poistamisesta elimistöstä, mikä on olennainen osa immuunivastetta. Useilla immuunisoluilla, kuten T-soluilla ja NK-soluilla, on ominaisuus, joka tunnetaan sytotoksisena potentiaalina, joka on kyky tunnistaa kohdesolut ja erittää proteiineja, jotka aiheuttavat kohdesolujen hajoamista, hajoamista ja kuolemaa. Sytotoksisen potentiaalin kvantifiointi on tärkeää immuunisolujen aktivaation ja voimakkuuden mittaamiseksi, ja tähän tarkoitukseen käytetään yleisesti kromin vapautumismääritystä.
tämän menetelmän avulla käyttäjät voivat vertailla tietyntyyppisten immuunisolujen aiheuttamaa sytotoksisuutta eri olosuhteissa, mikä on arvokasta tutkittaessa syövän immunoterapiaa ja immuniteettiin liittyviä sairauksia. Aluksi kohdesolut, kuten syöpäsolut, inkuboidaan radioaktiivisella isotoopilla Kromi 51: llä, jonka solut ottavat haltuunsa. Seuraavaksi nämä radiomerkityt solut viljellään yhdessä kiinnostavien eristettyjen immuunisolujen, joita kutsutaan myös efektorisoluiksi, kanssa pyöreään pohjaan, 96 – kuoppalevyyn näiden kahden solutyypin vuorovaikutuksen helpottamiseksi.
määrityksen kokonaisasetelma käsittää tietyn määrän kohdesoluja, joilla on erilaiset immuunisolukon pitoisuudet, sekä asianmukaiset kontrollit. Rinnakkaisviljelyn avulla efektorisolut voivat indusoida apoptoosin ja lyysin kohdesoluissa, jolloin solunsisäinen Kromi 51 vapautuu supernatanttiin. Sitten, ennalta optimoidussa aikapisteessä, supernatantti, joka sisältää vapautuneen kromin, otetaan talteen kaikista kaivoista. Koska Kromi-51 on radioaktiivinen, se hajoaa itsestään radioaktiivisesti ja lähettää gammasäteilyä. Kaikkien määrityslevyn kuoppien supernatanttien gammasäteilytasot edustavat mitattavissa olevaa tuotosta kohdesolujen hajoamisesta. Tämä mitataan gammalaskurilla, jonka avulla määritetään immuunisolujen sytotoksinen potentiaali.
aluksi kohdesolut, ihmisen melanoomasolulinja WM793 tässä esimerkissä, valmistetaan yhdeksi solususpensioksi. Tätä varten poistetaan ensin väliaine kudosviljelypullosta ja pestään solut viidellä millilitralla 1X PBS: ää. Dekantoi PBS ja lisää sitten yksi millilitra trypsiiniä lautaselle noin kahdeksi minuutiksi. Taputtele pulloa varovasti, jotta solut irtoavat pullon pinnasta ja lisää sitten pulloon viisi millilitraa RPMI-väliainetta. Pipetoidaan mediaa ylös ja alas solujen keräämiseksi ja lisätään tämä suspensio 15 millilitran kartiomaiseen putkeen.
putki asetetaan sentrifugiin viideksi minuutiksi nopeudella 1200 RPM. Seuraavaksi Poista väliaine putkesta varmistaen, ettei se häiritse solupellettiä. Näpäytä putken pohjaa varovasti, jotta solupelletti häiriintyy ja lisää putkeen 10 millilitraa väliainetta. Pipetoi sitten kevyesti mediaa ylös ja alas, jotta solut saadaan suspensioon. Seuraavaksi määritetään solun pitoisuus hemosytometrillä ja siirretään kaksi millilitraa alkuperäistä solususpensiota uuteen 15 millilitran kartiomaiseen putkeen. Aseta putki sentrifugiin ja pelletoi solut 12 sadalla RPM: llä viiden minuutin ajan. Sentrifugoinnin jälkeen kaada ylimääräinen väliaine putkesta jäteastiaan. Vortex putki lyhyesti suspendoida solupelletti pieni määrä väliainetta jäljellä.
seuraavaksi valmistaudutaan käyttämään Kromi 51: tä siirtymällä laboratoriotilaan, joka on omistettu juuri tälle radioaktiivisuudelle. Kromi 51: n turvalliseen varastointiin ja käyttöön tulisi olla runsaasti lyijysuojausta kaikkien vaiheiden aikana sekä asianmukaiset opasteet osoittamaan, missä Kromi 51-näytteitä pidetään. Geigermittari varustettu pannukakku anturi on myös tarpeen palvella tilassa mahdollisen saastumisen.
kun se on asetettu radioaktiivisuuden asianmukaiseen käyttöön, lisätään Kohdesolususpensioon suoraan 100 Kromi-51: tä sisältävää mikrokursiota. Sitten lisätään pieni pala radioaktiivista teippiä putkeen sen osoittamiseksi, että näyte ja putki ovat nyt radioaktiivisia. Aseta putki 37-asteiseen inkubaattoriin, jossa on lyijysuoja, ja inkuboi tunnin ajan heiluttaen putkea 15-20 minuutin välein.
kohdesolujen merkitsemisen aikana valmistetaan efektorisolujen yksisolususpensio. Tässä esimerkissä ihmisen perifeerisen veren monoydinsolut eli Pdmc: t eristettiin kokoverestä standarditiheysgradientti sentrifugoimalla pitoisuudeksi 5 kertaa 10-6. Siirrä tämä efektorisolususpensio kertakäyttöiseen reagenssisäiliöön ja lisää sitten 200 mikrolitraa tätä suspensiota jokaiseen rivin B kaivoon 96-kuopan pyöreäpohjalevylle. Seuraavaksi lisätään 100 mikrolitraa RPMI: tä jokaiseen levyn rivin C-G kaivoon.
Aloita nyt Pbmc: n sarjalaimennusten suorittaminen niin, että efektorikennojen lukumäärä vaihtelee poistamalla ensin 100 mikrolitraa soluista rivin B kaivoissa ja lisäämällä tämä riville C. Tämän jälkeen efektorikennoja laimennetaan edelleen siirtämällä 100 mikrolitraa soluja riviltä C riville D. Jatka sarjalaimennusta. Kun rivi G on saavutettu, siirretään 100 mikrolitraa kaivoista, jotta jokaiseen kyseisen rivin kaivoon jää 100 mikrolitraa. Seuraavaksi lisätään 100 mikrolitraa kudosviljelyainetta rivin A kuoppiin kontrolloimaan Kromi 51: n spontaania vapautumista kohdesoluista, koska Tälle riville ei saa lisätä efektorisoluja. Aseta sitten levy 37 asteen inkubaattoriin, kunnes kohdesolut ovat valmiita lisättäväksi.
inkubointijakson jälkeen kohdesolut poistetaan inkubaattorista ja pestään 5 millilitralla FBS: ää ylimääräisen Kromi 51: n poistamiseksi. Aseta putki sentrifugiin ja pyöri 1200 rpm: ssä 5 minuutin ajan. Poista radioaktiivinen FBS-pesu asianmukaiseen jäteastiaan ja toista pesuvaihe sekoittamalla pelletti uudelleen tuoreeseen 5 millilitraan FBS: ää. Putki asetetaan määrättyyn sentrifugiin ja kennoja pyöritetään uudelleen nopeudella 1200 rpm 5 minuutin ajan. Poista toinen pesu ja tarkista pelletin radioaktiivisuus Geigermittarilla. Sekoita lopuksi pelletti uudelleen 10 millilitraan täydellistä väliainetta ja kaada Kromi 51 merkitty kohdesolususpensio kertakäyttöiseen reagenssisäiliöön. Sitten lisätään 100 mikrolitraa näitä merkittyjä kohdesoluja 96-kuoppaisen efektorisolulevyn jokaiseen kuoppaan. Seuraavaksi lisätään 100 mikrolitraa 1% NP-40 vedessä rivin H kaivoihin, jotta kaikki kohdesolut lyseoidaan tällä rivillä. Näitä kaivoja käytetään kontrollina määritettäessä kokonaislukuja minuutissa eli cpm: ssä.
nyt kun levy on valmis, kiinnitä kansi lisäämällä pieni pala teippiä levyn kummallekin puolelle ja aseta radioaktiivista teippiä kannelle osoittamaan, että se sisältää kromi 51: tä. Sitten levy laitetaan sentrifugiin, johon on merkitty radioaktiivisten Näytteiden käsittely. Jos käytetään vain yhtä koelevyä, sentrifugiin lisätään vaakalevy. Aseta sentrifugi 1200 rpm: ään ja nosta levy vauhtiin. Kun nopeus, Pysäytä kone. Poista levy sentrifugista. Aseta levy sitten 37 asteen inkubaattoriin, jossa on pieni pala lyijysuojusta levyn päälle lisäturvallisuuden takaamiseksi. Inkuboidaan 16 tuntia, jotta kohdesolut lysähtävät.
haudonta-ajan päättyessä irrota varovasti teippi levyn reunasta ja poista kansi. Aseta seuraavaksi sadonkorjuukehys levylle varmistaen, että pienet suodatinlevyt ovat paikoillaan kunkin puuvillatulpan kohdalla. Painele vanutulpat nyt hitaasti ja varovasti kuoppiin. Noin kymmenen sekunnin kuluttua vapauta puuvillatulppien paine ja siirrä sitten puuvillatulpat putkiliuskoihin. Aseta jokainen näistä putkista toissijaiseen FACS putkeen. Lopuksi Ladataan Faks-putket gammalaskuriin ja suoritetaan näytteet kussakin tilassa vapautuvan Kromi-51: n määrän määrittämiseksi. Kirjaa huolellisesti, missä järjestyksessä putket ladattiin tiskiin.
Tässä 3 ensimmäiselle kaistalle lisättiin kiihdyttämättömiä Pbmc-yhdisteitä ja kaistoille 4-6 lisättiin CPG-stimuloituja Pmbc-yhdisteitä. Tässä esimerkissä minuuttikohtaiset luvut syötettiin laskentataulukon soluihin samalla tavalla kuin näytteet vahvistettiin alkuperäiselle levylle ja kolmikertojen keskiarvot laskettiin. Esimerkiksi ensimmäisen tilan solujen A1, A2 ja A3 keskiarvoksi laskettiin solu I3. Kun keskiarvot on määritetty, kunkin ehdon ominaislyysin prosenttiosuus voidaan laskea tämän kaavan avulla. Esimerkiksi, jotta voitaisiin laskea stimuloimattomien solujen prosentuaalinen hajoaminen, jonka suhde oli 50-1 efektorisoluihin kohdesoluihin, spontaani CPM, joka tässä esimerkissä on 1164.67, vähennettiin kokeellisesta CPM: stä 1129. 67. Tämä luku voidaan sitten jakaa suurimman CPM: n ja spontaanin CPM: n erotuksella ja kertoa sitten 100: lla, jolloin saadaan prosenttikohtainen hajoaminen. Tämä lasketaan sitten kullekin ehdolle. Nämä tiedot voidaan sitten graafisesti esittää vertaamalla E-T-suhdetta sekä stimuloimattomien Pbmc: iden prosentuaaliseen hajoamiseen että CPG: n stimuloimaan Pbmc: hen. Tässä esimerkissä EFEKTORISOLUT, joita stimuloitiin CPG: llä, tappoivat kohdesoluja tehokkaammin efektorisolujen ja kohdesolujen suhteen kasvaessa. Tätä nousua ei havaittu stimuloimattomissa Pbmc: issä, mikä viittaa siihen, että CPC-stimulaatio on tarpeen havaitun kohdesolulyysin lisääntymisen vuoksi.