sisplatiinin ototoksisuuteen liittyy sytokiineja ja STAT6-signalointiverkko

reagenssit

sisplatiini ja 3-(4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) ostettiin Sigma Chemical Co: lta (Sigma, St Louis, MO, USA). Muoviviljelymateriaalit ostettiin Becton Dickinson and Companyltä (Franklin Lakes, NJ, USA). Dulbeccon modifioitu essential medium (dmem), fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) ja muut kudosviljelyreagenssit saatiin Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, Yhdysvallat). Rekombinantti hiiren IL-4-ja IL-13-proteiini, vasta-aineet IL-4 -, IL-13 -, TNF-α -, IL-1β -, IL-6-ja entsyymi-immunosorbenttimääritys (Elisa) – sarjat (Kvantiineri) sytokiineille ostettiin R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, Yhdysvallat). Näitä vasta-aineita käytettiin immunohistokemiaan pitoisuutena 1:200. Santa Cruz Biotech Inc.: ltä ostettiin P-STAT4: n, STAT4: n, p-STAT6: n, STAT6: n, NF-kB: n (p65) ja IkB: n vasta-aineita. (Santa Cruz, CA, Yhdysvallat).

Soluviljely ja elinkyky

ehdollisesti ikuistettujen HEI-OC1-kuulosolujen perustaminen ja luonnehtiminen kuvattiin edellisessä raportissamme 1. OHC-spesifisten merkkiaineiden kuten Math1: n ja myosiini 7a: n ilmentyminen viittaa siihen, että HEI-OC1-solut edustavat OHC: n esiasteita. HEI-OC1-solut säilyivät korkean glukoosin dmem: ssä (Gibco BRL), joka sisälsi 10% FBS: ää. Alla kuvatuissa kokeissa HEI-OC1-soluja viljeltiin seuraavissa sallivissa olosuhteissa: 33 °C ja 5% CO2 dmem: ssä täydennettynä 10% FBS: llä. Soluja (3 × 104 solua/24-kuoppalevyn kuoppa) inkuboitiin 20 µM sisplatiinilla 24 tunnin ajan. solujen elinkyvyn määrittämiseksi MTT (0, 25 mg) lisättiin 1 ml: n solususpensioon 4 tunnin ajaksi. solujen pesun jälkeen ja kolme pesua PBS: llä (pH 7, 4) liukenematon formatsaanituote liuotettiin DMSO: han. Tämän jälkeen kunkin viljelmäkaivon optinen tiheys (OD) mitattiin Mikrotiitterinlukijalla (Titertek Multiskan, Flow Laboratories) 590 nm: n aallonpituudella. Kontrollisoluista otetun OD: n katsottiin osoittavan 100-prosenttista elinkelpoisuutta. Eri sytokiinien vaikutusten tutkimiseksi viljelmiin lisättiin neutraloivia vasta− aineita sytokiineja vastaan 30 minuutin ajan, minkä jälkeen niitä viljeltiin 20 µM sisplatiinilla 24 tunnin ajan.

Eläimet

STAT4−/− (backcross− sukupolvi N10), STAT6 – / – (backcross-sukupolvi N6) ja WT BALB/C-hiiret ostettiin Jacksonin laboratoriosta (Bar Harbor, ME, USA). Homotsygootit STAT4 ja STAT6 ko-hiiret tunnistettiin PCR: llä. Ko-hiirillä ei havaittu kehityshäiriöitä. Kokeet tehtiin 6 viikon ikäisillä hiirillä, ja kaikki hiiret olivat samanikäisiä 3 päivän kuluessa. Hiirille annettiin tavanomaista kaupallista ravintoa, kun ne säilytettiin ympäristön lämpötilassa 20-22 °C ja suhteellisessa kosteudessa 50 ± 5% 12:12 tunnin valo-ja pimeäsyklin aikana tietyssä taudinaiheuttajista vapaassa tilassa. Wonkwangin yliopiston lääketieteellisen korkeakoulun Eläinten hoito-ja Käyttökomitea hyväksyi kaikki eläinkokeet.

Luciferase reporter assay

Cells were transently transfected with NF-kB luciferase reporter plasmid using the transfektioreagence, Lipofectamine 2000. 36 tunnin inkubaation jälkeen soluja käsiteltiin sisplatiinilla 12 tunnin ajan neutraloivien sytokiinivasta-aineiden läsnä ollessa. Tämän jälkeen solut pestiin kahdesti PBS-puskurilla ja lysoitiin reporter lysis-puskurissa (Promega, Madison, WI, USA). Tämän jälkeen 20 µl lysaattia sekoitettiin 100 µl luciferaasimääritysreagenssiin, minkä jälkeen emittoituneen valon voimakkuus mitattiin luminometrillä AutoLumat LB953 (esim.ja G Berthold, Bad Wildbad, Saksa). Lopuksi luciferaasin aktiivisuus mitattiin kolmena kappaleena, laskettiin keskiarvona ja normalisoitiin β-galaktosidaasiaktiivisuuteen käyttäen galaktosidaasimääritysjärjestelmää (Galacto-Light, Tropix Inc., MA, USA) valmistajan ohjeen mukaan.

Transfektio sirna-konstruktioilla

ennen Sirnoja hiiren STAT4: ää, STAT6: ta ja kontrollikemikaalia sirnaa vastaan ostettiin Santa Cruzin bioteknologiasta. Sirnojen sense-säikeet STAT4: ää ja STAT6: ta vastaan ovat seuraavat. STAT4 siRNAs-konstruktio koostuu kolmesta sirnan jaksosta seuraavasti: Duplex 1 Sense Strand: 5 ’- Indextermcua GCU GUG GUA AU UCA a-3′, Duplex 2 Sense Strand: 5′-IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA a-3′ ja Duplex 3 Sense Strand: 5′-IndexTermCUG UCG UGA UGA UU CUA a-3’ (mRNA: n liittymisnumero: NM_011487). STAT6 siRNAs-konstruktio koostuu sirnan kolmesta sekvenssistä seuraavasti: Duplex 1 Sense Strand: 5 ’- IndexTermGAU GCU UUC UGU UAC AAC A-3′, Duplex 2 Sense Strand: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG AUG Aug a-3’ja Duplex 3 Sense Strand: 5’-IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG a-3 ’ (mRNA: n liittymisnumero: NM_009284). Solut transfektoitiin 100 nM: n siRNA-konstruktiolla X-tremeGENE siRNA-transfektioreagenssissa (Roche Applied Science, Penzberg, Saksa) valmistajan protokollan mukaisesti. Kun soluja oli inkuboitu 33 °C: ssa ja 5% CO2: ssa 36 tunnin ajan, soluja käsiteltiin edelleen sisplatiinilla 24 tunnin ajan. sitten näytteet valmistettiin ja analysoitiin elinkelpoisuutta tai Western blot-analyysiä varten. Ilmaisun häiriöt varmistettiin immunoblottianalyysillä.

proinflammatoristen sytokiinien mittaus ELISA-menetelmällä

proinflammatoristen sytokiinien erityksen mittaamiseksi sisplatiinilla käsitellyistä soluista kerättiin supernatantit jokaisena ajankohtana ja eritettyjen proinflammatoristen sytokiinien pitoisuudet määritettiin ELISA-menetelmällä (Quantikine Sytokine Kits; R&D Systems Inc.) valmistajan ohjeen mukaan.

sytosoliuutteiden ja ydinuutteiden valmistus

solut pestiin jääkylmällä PBS: llä, kaavittiin ja sentrifugoitiin lämpötilassa 1 000× g 5 minuutin ajan 4 °C: ssa.tämän jälkeen soluselletti suspendoitiin uudelleen 200 µl: aan lyysipuskuria (10 mm HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 0,5 mm ditiotreitoli) ja sitten inkuboidaan jäällä 15 min. Inkubaation lopussa lisättiin 10 µl 10% NP-40: tä ja putkea pyörrettiin 10 sekunnin ajan. Kun supernatantti (sytosoliuute) sentrifugoitiin 1 min 4 °C: n lämpötilassa, supernatantti (sytosoliuute) kerättiin ja varastoitiin -80 °C: n lämpötilaan, kun taas pellettiä jatkojalostettiin ydinuutteiden saamiseksi. Tämän jälkeen pelletti suspendoitiin uudelleen uuttopuskuriin (5 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM ditiotreitoli ja 25% (Vol/vol) glyseroli) ja inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 °C: ssa. Ydinuutteita eristettiin sentrifugoimalla 13 000× g: n lämpötilassa 30 minuutin ajan 4 °C: ssa. Tämän jälkeen supernatantti poistettiin ja säilytettiin -80 °C: ssa, kunnes sitä käytettiin western blot-analyysiin. Lopulta proteiinipitoisuus määritettiin Lowryn menetelmällä.

Western blot-analyysi

Western blot-analyysi tehtiin seuraavasti. Kennot kerättiin ja pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä. Kokonais-ja ydin – /sytosolifraktioidut lysaatit altistettiin sitten elektroforeesille 12%: n SDS-polyakryyliamidigeeleillä 3 tunnin ajan 20 mA: n nopeudella, minkä jälkeen ne siirrettiin nitroselluloosaan. Tämän jälkeen kalvoa inkuboitiin 5%: ssa (wt/vol) kuivattua maitoproteiinia PBS:ssä, joka sisälsi 0,05% (vol/vol) Tween-20: tä (PBS-T) 1 tunnin ajan, minkä jälkeen ne pestiin PBS-T: ssä ja reagoitiin edelleen primaarisella vasta-aineella (1: 1 000) 1 tunnin ajan. seuraavaksi kalvo pestiin laajasti PBS-T: llä ja inkuboitiin sitten anti-kani IgG-vasta-aineella, joka konjugoitiin HRP: hen (1: 3 000) 1 tunnin ajan. oli visualisoitu käyttämällä kemiluminesenssireagensseja valmistajan ohjeiden mukaisesti (supersignal substrate; Pierce, Rockford, IL, USA).

in vivo-koe sisplatiinin ototoksisuudesta

kaikki hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen kuuden hiiren ryhmään. Ryhmän 1 eläimet, joita pidettiin verrokkiryhmänä, saivat vatsaontelonsisäisen PBS-injektion. Ryhmän 2 eläimille annettiin sisplatiinia (4 mg painokiloa kohti) intraperitoneaalisena injektiona 4 peräkkäisenä päivänä. Eläimet lopetettiin nukutuksessa CO2-kaasun avulla viimeistä sisplatiinipistosta seuraavana päivänä, jonka jälkeen oikean korvan ohimoluu poistettiin.

ABR: n mittaus

kuulokynnyksen tarkempaa analysointia varten ABR mitattiin ennen sisplatiinihoitoa ja 24 tuntia sen jälkeen. Tämän jälkeen verrattiin ABR-kynnysarvojen muutoksia ennen hoitoa ja sen jälkeen. Hiiret nukutettiin ketamiinin (40 mg/kg) ja ksylatsiinin (10 mg/kg) sekoituksella, ja ne pidettiin lämpiminä lämmitystyynyllä ABR-tallennuksen aikana. Subdermaalinen (aktiivinen) neulaelektrodi asetettiin huippupisteeseen, kun taas Maa-ja vertailuelektrodit asetettiin subdermaalisesti vastakkaisten korvien pinnien alla olevaan löysään ihoon. Testiärsykkeet koostuivat vaihtelevista vaihesävelpurkauksista taajuuksilla 4, 8, 16 ja 32 kHz. Signaalit luotiin Tucker Davis Technologiesin (TDT, Gainesville, FL, USA) SigGen-ohjelmistolla. Jokainen sävy burst (1 ms kesto) oli aidattu läpi Blackmann ikkuna, ja oli 0.5-ms nousu-lasku aika ilman tasannetta. Ärsykkeet kalibroitiin ennen jokaista testisessiota tallentamalla kaiuttimen ulostulo mikrofonilla, joka oli sijoitettu eläinten pään tasolle. ABR-aaltomuotojen keskiarvoksi laskettiin 300 sävelryöppyä kullakin testatulla taajuudella. Jokaisella taajuudella signaalin amplitudi vaimeni automaattisesti 10-dB askelin 90 dB SPL: stä, kunnes ABR-aallot katosivat 100-3 000 Hz: n suodatinasetuksilla tallennetuissa jäljissä. Kaksi riippumatonta, kokeellisesti sokeaa havainnoitsijaa, jotka perustuivat ABR: n tietoihin.

kaikki hiiret tapettiin viimeisen sisplatiinipistoksen jälkeisenä päivänä. Ohimoluu leikeltiin pois ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydiin 16 tunnin ajan 4 °C: ssa ja huuhdeltiin 0,1 M PBS: llä. Ohimoluun kalsinoituminen jatkui, kun PBS: n EDTA oli 10% 3 päivän ajan. Simpukka leikeltiin huolellisesti pois. Seuraavaksi stria-vaskularis ja spiraaliside leikattiin pois, jolloin jäljelle jäi Cortin elin. Simpukan keskimmäinen käännös upotettiin TRITC-merkittyyn falloidiiniin (Sigma P1951, 1: 100) PBS: ssä 20 min. Kolmen PBS-pesun jälkeen näyte tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla käyttäen asianmukaisia tritc-suodattimia (heräte: 510-550 nm, emissio: 590 nm).

Immunohistokemiallinen värjäys ja TUNEL-määritys

poistettu ohimoluu kiinnitettiin 4% paraformaldehydiin 16 tunnin ajan ja sen jälkeen se kalsifikoitiin 10% EDTA: lla PBS: ssä 2 viikon ajan, minkä jälkeen se kuivatettiin ja upotettiin parafiiniin. Ksyleenistä poistui 5 µm: n osia, jotka hydrattiin uudelleen etanolipitoisuuksien perusteella. Immunohistokemian tutkimuksessa käytettiin immunohistokemiallista pakkausta (Dako Lsab Universal K680, Carpinteria, CA, USA) ja toimenpiteet suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tämän jälkeen endogeeninen peroksidaasi estettiin 3-prosenttisella vetyperoksidilla 5 minuutin ajan huoneenlämmössä (RT). Kun Osat oli pesty PBS:llä, epäspesifinen sitoutuminen estettiin 1%: lla naudan seerumialbumiinia 1 tunnin ajan. primaariset vasta-aineet (laimennettu 1: 200) lisättiin dioihin, minkä jälkeen inkubaatio jatkui 1 tunnin ajan. toistuvien PBS-pesujen jälkeen osioita inkuboitiin biotinyloidulla sekundaarisella vasta-aineella 30 minuutin ajan ja peitettiin 30 minuutin ajan sekundaarisella vasta-aineella, joka sisälsi piparjuuriperoksidaasia. Lopuksi osat värjättiin vasta valmistetussa substraattiliuoksessa (3 mg 3-amino-9-etyylikarbatsolia 10 ml: ssa natriumasetaattipuskuria (pH 4,9), 500 µl dimetyyliformamidia, 0,03% vetyperoksidia) 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen immunotahrattujen solujen tumat vastasivat Mayerin hematoksyliinia (Sigma-Aldrich Co.). Apoptoottisia soluja havaittiin paikan päällä käyttäen TUNEL-määritystä (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Saksa). Lyhyesti, osa oli depaffinized ja nesteytettiin. Inkuboinnin jälkeen 20 µg/ml proteinaasi K: lla (Boehringer Mannheim, Mannheim, Saksa) endogeeninen peroksidaasi estettiin inkuboimalla näytteitä 2-prosenttisessa H2O2: ssa metanolissa 30 minuutin ajan RT: ssä. seuraavaksi kudososat pestiin PBS: ssä ja inkuboitiin merkintäliuoksella 1 tunnin ajan 37 °C: ssa. ytimet vastattiin sitten propidiumjodidilla (0,5 µg/ml, Molekyylikoettimet) 10 minuutin ajan RT: ssä.PBS: llä pesemisen jälkeen näyte tutkittiin a fluoresenssimikroskooppi.

Käänteiskopioijaentsyymi-PCR-vahvistus

sisäkorvan PCR: ssä vasen korvan ohimoluu korjattiin nopeasti ja upotettiin Rnalateriin (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) till käyttö -20 °C: ssa sitten koko simpukka leikeltiin pois ja sitä käytettiin koko RNA: n uuttamiseen Trizolin (Invitrogen) avulla valmistajan protokollien mukaisesti. Kun kokonais-RNA oli uutettu Trizolilla (Invitrogen), yksijuosteinen cDNA syntetisoitiin kokonais-RNA: sta. Seuraavaksi PCR ja Taq DNA polymeraasi (Takara, Takara Shuzo, Japani) suoritettiin altistamalla näytteet 30 syklille 95 °C 40 s, 58 °C 40 s ja 72 °C 50 s. tämän jälkeen PCR-tuotteiden kymmenen mikrolitraa erotettiin 1,2% agaroosigeelillä ja visualisoitiin UV-valossa. PCR-vahvistuksessa käytettyjen alukkeiden sekvenssit olivat seuraavat: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, reverse, 5′-IndexTermGCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3′).

tilastollinen analyysi

jokainen koe tehtiin vähintään kolme kertaa, ja kaikki ilmoitetut arvot edustavat kolmena kappaleena tehtyjen analyysien keskiarvoa ± SD. Tilastollinen monimuuttuja-analyysi tehtiin varianssi-ja Duncan-testien avulla käyttäen SPSS 11 (Chicago, IL, USA) – tilastoohjelmistoa. Tulosten merkityksen määrittämiseen käytettiin kaksisuuntaista ANOVAA ja/tai yksisuuntaista ANOVAA. Tilastotulokset kävi läpi maisteritason biostatistikko. Arvot P < 0.05: tä pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.