kromatiini Immunoprecipitation (ChIP) assay on tärkeä menetelmä transkriptiosäätelyn seurannassa, jossa on kattamatonta tietoa tiettyjen proteiinien ja genomisen DNA-alueen yhteisvaikutuksista. Koska DNA: ta sitovat proteiinit (mukaan lukien transkriptiotekijät ja histonit) elävissä soluissa voivat olla ristisitoutuneita DNA: han, sirua käytetään immunopresipitoimaan proteiini-DNA-kompleksi solulysaateista sopivalla vasta–aineella. Immunopresipitoidut kompleksit kerätään sentrifugoimalla, ja proteiinit eluoidaan jatkotutkimusta varten, kuten western blot ja LC/MS. Nukleiinihappoanalyysi saadaan aikaan PCR: n, RT-PCR: n, cDNA-sekvensoinnin ja mikroarrayn avulla. Tämä protokolla tarjoaa yksityiskohtaisen menettelyn onnistuneen Sirumäärityksen saavuttamiseksi nopeasti ja tehokkaasti.
reagenssit:
- 37% formaldehydi
- 1 M glysiini
- Solulyysipuskuri: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 5 mM EDTA, 0, 5% NP-40, 1% Triton X-100, 1× proteaasinestäjäsekoitus.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Lisätään 27 µL 37% formaldehydiä 1 mL: n viljelyainetta kohti, jotta saadaan lopullinen pitoisuus 1%: ssa, soluja inkuboidaan 10 minuutin ajan huoneenlämmössä ja ravistellaan hitaasti keinu-tai ravistuslaitteella.
2. Sammutetaan ristisidos lisäämällä 141 µL 1 M glysiiniä 1 mL: aan viljelyainetta, jotta saadaan lopullinen pitoisuus 125 mM: n lämpötilassa, soluja inkuboidaan 5 minuutin ajan huoneenlämmössä.
3. Kelluvat kennot: kolletoidaan kennot 15 mL: n kartiomaiseen putkeen, sentrifugoidaan 2 000 × g: n lämpötilassa 4°C: ssa 5 minuutin ajan. Hävitä supernatantti ja pese solut kahdesti kylmällä PBS: llä.
Skip to step 5.
4. Liimasolut: poista väliaine, pese solut kahdesti kylmällä PBS: llä. Kuutioi solut PBS: ään 15 mL: n kartiomaisessa putkessa, sentrifugoidaan 2 000 × g: n lämpötilassa 4°C: ssa 5 minuutin ajan.
Lysis ja sonikointi
5. Supernatantti heitetään pois ja lisätään 1 mL kylmäsolulyysipuskuria 1 × 107 solua kohti. Sekoita pelletti pipetoimalla ylös ja alas useita kertoja ja inkuboi jäällä 10 minuuttia.
6. Sonikoidaan kromatiinin leikkaamiseksi 0,5~1 kb: n fragmentiksi. Vältä vaahtoa ja pidä näyte jäässä.
huomautuksia:
- Sonikointiolosuhteet tulisi optimoida otos-ja sonikaattorimallin mukaan. Tyypillisesti kuusi 15 sekunnin sykettä, joita seuraa 45 sekunnin lepojakso teholla 6,0, on todettu toimiviksi. Fragmentin koon analysointia varten otetaan pieni määrä kokonais-DNA: ta leikatusta kromatiinista ja analysoidaan sitten agaroosigeelillä (1~2%).
- tilavuuksien on ehdotettu olevan ≤ 1 mL sonikointitehokkuuden säilyttämiseksi.
7. Sentrifugoidaan 12 000 × g: n lämpötilassa 4°C: ssa 10 minuutin ajan ja supernatantti säilytetään.
8. Siirrä 0, 5 mL supernatanttia tuoreeseen 1.5 mL: n putkilo DNA-fragmenttianalyysiä varten.
Immunopresipitaatio
9. Lisätään näytteeseen asiaankuuluvat vasta-aineet tai normaali IgG ja inkuboidaan 15 minuutin ajan ultraäänivesihaudassa huoneenlämmössä.
huomautuksia:
- valitse IgG samasta lajista, jossa vasta-aineet on tuotettu.
- inkubointiaika on optimoitava vasta-aineen ja antigeenin mukaan. Jos antigeenit ilmentyvät heikosti, inkubaatio voitiin suorittaa 4°C: ssa yön yli pyörivällä alustalla .
10. Valmista proteiini A-agaroosihelmet: Helmet pestään kolme kertaa 1 mL: lla lyysipuskuria (ilman proteaasinestäjää), sentrifugoidaan 2000 × g: n lämpötilassa muutaman sekunnin ajan 4°C: ssa ja sen jälkeen supernatantti heitetään pois.
11. Laimennetaan Helmet 1: 1 lysis-puskurilla ja lisätään näytteeseen 50 µL.
12. Inkuboidaan 4°C: ssa 30~45 min pyörivällä alustalla.
13. Sentrifugoidaan lämpötilassa 2000 × g 1 minuutin ajan 4°C: ssa, minkä jälkeen supernatantti heitetään pois.
14. Helmet pestään neljä kertaa 1 mL: lla lyysipuskuria (ilman proteaasinestäjää), supernatantti heitetään pois.
DNA: n puhdistus ja analyysi
15. Sekoita pestyt Helmet 100 µL: aan 10% Chelex 100: aa.
16. Pipetoidaan ylös ja alas useita sekunteja, ja sitten keitetään näyte 10 minuuttia.
17. Sentrifugoidaan 12 000 × g: n lämpötilassa 1 minuutin ajan huoneenlämmössä ja siirretään supernatantti tuoreeseen 1, 5 mL: n putkeen.
18. Puhdistaa DNA käyttäen DNA puhdistus kit tai standardin fenoli: kloroformi uutto protokolla.
19. Liuotetaan DNA 50 µL ddH2O: lla ja käytetään 2~10 µL DNA-näytettä (25% reaktion tilavuudesta) PCR-reaktioissa
Opi sirun periaatteesta
Reach to our ChIP servise
jos sinulla on kysyttävää, ota yhteyttä: