mikroskopia on oletuksena tekniikka, jonka avulla voidaan mittaamisen sijaan tarkkailla biologisia tapahtumia ja tehdä päätelmiä näkemämme perusteella joidenkin laskelmien sijaan. Tämän artikkelin aihe saattaakin tuntua hieman yllättävältä, sillä se käsittelee kolokalisaation mittauksia. Vaikka on tilanteita, joissa voit määrittää proteiinin colocalisation visuaalisesti, tarkempi vahvistus kahden koettimen keskinäisestä jakautumisesta on usein tarpeen.
miksi Kolokalisaation visuaalinen määritys on riittämätön?
vain jos olet kerännyt kuvia hallitun protokollan mukaisesti kolokalisaatioanalyysiä varten (riittävä signaali kummassakin kanavassa, ei autofluoresenssia tai signaalin läpäisyä), on turvallista sanoa, että nämä kaksi luotainta kolokalisoituvat pelkästään havainnon perusteella. Tällöin, jos vihreä signaali kolokalisoituu punaisen signaalin kanssa ja kuva on enimmäkseen keltainen, tilastollista mittausta ei tarvita. Mutta jos et näe päällekkäisyyttä, se ei tarkoita, etteikö sitä olisi! Voi olla, että kahden kanavan intensiteetit eivät ole samat. Nimittäin, väli väri, että näemme voi näkyä vain, jos molemmat luotaimet ovat saman intensiteetin. Siksi silmämääräiseen määritykseen perustuvat päätelmät voivat usein johtaa vääriin negatiivisiin tuloksiin.
mitä menetelmiä päällekkäisyyksien mittaamiseen on olemassa?
vaikka tähän asiaan ei ole olemassa yhtä standardimenetelmää, on olemassa kaksi laajalti käytettyä ja yleisesti hyväksyttyä menetelmää. Näitä ovat joko Pearsonin korrelaatiokerroin (PCC) tai Manderin kolokalisaatiokerroin (MCC).
nämä kaksi menetelmää liittyvät kolokalisaation kahteen eri aspektiin – korrelaatioon ja rinnakkaisesiintymiseen. Pearsonin kerroin liittyy kahden kanavan pikseliintensiteettien korrelaatioon. Se mittaa signaalien välistä suhdetta-nousevatko yhden kanavan signaaliarvot samanaikaisesti toisen kanssa, vai putoaako toinen signaali toisen noustessa. Korrelaatio eroaa co-esiintymisestä, joka ilmaistaan matemaattisesti Manderin kertoimella. Tämä kuvaa yhden signaalin peittoa yli muiden, mikä paljastaa, missä määrin kaksi luotainta miehittää samassa paikassa. Tutkitaanpa asiaa hieman tarkemmin.
Pearsonin korrelaatiokerroin (PCC)
määritelmä: PCC heijastaa signaalin intensiteettien välistä lineaarista suhdetta. Arvot voivat vaihdella välillä 1 (täydellinen positiivinen korrelaatio) ja -1 (täydellinen negatiivinen korrelaatio), kun taas 0 tarkoittaa, että korrelaatiota ei ole. PCC: tä on mahdollista tutkia visuaalisesti scattergramin avulla, jossa tontin koordinaatit edustavat pikseliarvoja (signaalia) molemmissa kanavissa. Mitä enemmän pisteitä kerääntyy suoran ympärille, sitä parempi korrelaatio kahden signaalin välillä
vaatimukset: PCC on mitattava kiinnostavalla alueella (Roi) väärien positiivisten tai negatiivisten vaikutusten välttämiseksi. Jos PCC mitataan koko kuvasta, taustan Pikselit korreloivat täydellisesti ja täyttävät PCC: n. Sen sijaan jos mittaus suoritetaan alueella, jolla ei ole kiinnostusta ja jossa molempien kanavien jakauma on epäyhtenäinen, PCC laskee.
voit valita ROI: n käsin tai puimalla, jotta tausta voidaan sulkea pois. Riippumatta siitä, miten teet sen, ole varovainen, varsinkin puinnissa. ROI: n valinnassa on otettava huomioon kaikki solun(solujen) merkitykselliset alueet eli kaikki paikat, joihin luotaimen voidaan odottaa jakautuvan. Jos käytät intensiteettiin perustuvaa menetelmää ROI: n valitsemiseksi (thrashholding), saatat epähuomiossa jättää relevantit tulokset pois. Miten näin voi käydä? Sinulla voi olla molemminpuolisen poissulkemisen alue, jossa ei ole merkintää, ja tämä voi olla biologisesti merkityksellinen tulos (molemmat molekyylit eivät ilmene kyseisessä paikassa solussa). Thresholoding ei kuitenkaan sisällä tätä aluetta ROI: ssa, mikä saattaa sinut vaaraan menettää merkityksellisiä tuloksia.
suositellaan: PCC: tä tulisi käyttää kuviin, jos intensiteettien välillä on lineaarinen suhde. Jos data sopii monimutkaisempaan malliin, PCC ei suoriudu hyvin. Eri menetelmä olisi valittava myös, jos on epätasainen päällekkäisyys, jossa luotaimet yhdessä jakaa mutta eri mittasuhteissa. Näin voi käydä, kun GFP: tä käytetään yhtenä anturina. Sen ekspressiotaso voi vaihdella solujen välillä ja mahdollisesti aiheuttaa PCC: n painumista suuren intercell-vaihtelun vuoksi.
Manderin Kolokalisaatiokertoimet
määritelmä: MCC on metriikka, joka kuvaa yhteisesiintymistä-sitä proteiinin fraktiota, joka kolokalisoituu toisen kanssa. MCC antaa sinulle hyvän kolokalisaation, kun merkitset yhden proteiinin rakkulaan ja haluat nähdä, miten se kolokalisoituu tietyn solun rakenteen kanssa, vaikkapa mikrotubulus. Jos oletamme, että kaikki vesikkelit kolokalisoituvat mikrotubulusten kanssa, mutta vain osa mikrotubuluksista kolokalisoituu vesikkelin kanssa, voit laskea MCC: n jokaiselle kanavalle ja saada metriikan, joka kvantitatiivisesti kuvaa tätä murto-osan päällekkäisyyttä.
vaatimukset: MCC: llä saatu saalis on se, että se edellyttää taustan poistamista. Vaikeinta tässä on asettaa raja-arvo intensiteetille, joka mahdollistaa taustan vähentämisen. MCC mittaa yhden anturin täydellistä fluoresenssia jokaisessa nollan ylittävässä pikselissä. Nollan yläpuolella olevat pikselit ovat kuitenkin erittäin harvinaisia, johtuen mm.: autofluoresenssi, valovuoto, epäspesifiset merkinnät tai fluoresenssi epätarkasta kuvasta. MCC: n mittaaminen edellyttää siis kynnysarvon (cutoff) huolellista valintaa.
ensimmäinen tapa tehdä tämä on global thrashholding, jossa jokaisesta pikselistä vähennetään raja-arvo, jolloin jokainen valitun katkaisun alapuolella oleva taso on taustana ja jokainen edellä oleva pikseli kuuluu kiinnostavaan alueeseen. Vaikka tämä on hyvin intuitiivinen, maailmanlaajuinen kynnysarvo on melko karkea ja voi johtaa ei-toivottuihin tilanteisiin, kuten sellaisten alhaisen arvon pikselien poissulkemiseen, jotka ovat lähellä taustaa, mutta ovat itse asiassa myönteisiä.
automaattisempi ja vähemmän Subjektiivinen vaihtoehto on Costes-menetelmä, jossa kynnysarvo arvioidaan laskemalla PCC moninkertaisesti. Tällä pyritään määrittelemään pikseliarvojen vaihteluväli, joka on positiivinen, minkä vuoksi sitä ei pitäisi sulkea pois. PCC lasketaan eri pikseliryhmille, ja raja-arvoiksi otetaan pikseliarvot, joiden PCC on yhtä suuri tai lähellä nollaa. Se kannattaa kuitenkin tarkistaa myös silmämääräisesti, sillä matalamman signaali-kohina-suhteen omaavissa kuvissa se saattaa tunnistaa hyvin matalan kynnystason, jotta se ei erottaisi leimattuja rakenteita taustasta.
suositellaan: kun kokeen biologinen kysymys koskee proteiinin/rakenteiden päällekkäisyyttä, MCC: n tulisi olla valinnan mittari. Näitä kertoimia tulkitaan intuitiivisemmin kuin PCC: tä, ja ne ovat riippumattomia signaalin suhteellisuudesta (kunkin koettimen merkitsemien rakenteiden lukumäärän erot).
ennen kuin aloitat analyysin
kumman tahansa valinnan kolokalisaation mittaamiseksi valitset, on erittäin tärkeää, että kuvakokoelma suoritetaan oikein. Yritä hallita niin monta tekijää kuin voit, ja valmistella joukko ohjaus näytteitä, joiden avulla voit seurata niin monta muuttujaa kuin mahdollista.
muista, että visuaaliseen kolokalisaation määritykseen vaikuttavat monet tekijät, kuten havaitsijan subjektiivisuus, se, että jokaisen ihmisen aivot saattavat nähdä värit eri tavalla, havaitsijan mahdollinen värisokeus ja pikselin koon määrittävä avaruudellinen erottelukyky. Muista käsitellä kuvat olet aikeissa analysoida yhdenmukaisella tavalla, ja pitää mielessä, että hallitsematon manipulointi voi aiheuttaa voit menettää olennaisia tietoja.
ja viimeisenä mutta ei vähäisimpänä
nämä laskelmat on toteutettu useimmissa kuvaanalyysiohjelmistopaketeissa esim.ImageJ ja Volocity. Mutta, koska mittaus colocalization on edelleen hieman hämmentävä kenttä, parannuksia tarvitaan, joten seurata uusia versioita ja paketteja ohjelmiston.
miten kolokalisaatiota mitataan? Kerro meille kirjoittamalla kommenttiosioon!
kirjallisuus:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Colocalization Analysis in Fluorescence Microscopy. In: Taatjes, Douglas J., Roth, Jürgen (toim.), Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols, New York: Humana Press, 2012, s. 97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Statistical tests for measures of colocalization in biological microscopy. Journal of microscopy. 2013; 252(3): 295-302
onko tämä auttanut sinua? Jaa sitten verkkosi kanssa.